Isolering och Primär kultur av celler Rat Hepatiska

Summary

Primära hepatocyter ett värdefullt verktyg för att utvärdera biokemiska, molekylära och metabola funktioner i ett fysiologiskt relevant experimentellt system. Vi beskriver en pålitlig protokoll för råtta i situ leverperfusion, som konsekvent ger livskraftiga hepatocyter upp to1.0 × 10

Abstract

Primär hepatocyte kultur är ett värdefullt verktyg som har använts i stor utsträckning inom grundläggande forskning av leverfunktionen, sjukdom, patofysiologi, farmakologi och andra relaterade ämnen. Den metod som bygger på två steg kollagenas perfusion för isolering av intakta hepatocyter först introducerades av Berry och vän i 1969 ^1, och sedan dess har genomgått många förändringar. Den vanligast använda tekniken beskrevs av Seglenin 1976 ^2. I huvudsak hepatocyter är skiljas från sövda vuxna råttor av en icke-återcirkulerande kollagenas perfusion genom portalen ven. De isolerade cellerna och filtrerades sedan genom en 100 | im porstorlek mesh nylonfilter, och odlades på plattor. Efter 4 timmars odling, ersattes mediet med seruminnehållande eller serum-fritt medium, t.ex. HepatoZYME-SFM, för ytterligare tid för att kulturen. Dessa förfaranden kräver kirurgiska och steril kultur steg som kan bättre påvisas genom video än text. HERE, dokumenterar vi de detaljerade stegen för dessa förfaranden genom både video och skriftliga protokoll som tillåter konsekvent generering av livskraftiga hepatocyter i stora antal.

Protocol

1. Beredning

Alla buffertar nyframställd med steril teknik och filtersteriliseras med användning av en Corning 0,22 | im filter.

1. Framställ perfusionsbuffert I genom att lägga till följande Hanks balanserade saltlösning (HBSS, utan Ca ^{2 +} och ^{Mg2 +,} se tabell 1): Mg ^{2 +} _(MgCl2) till 0,9 mM, EDTA till 0,5 mM och HEPES och 25 mM.
2. Förbered II perfusionsbuffert genom att lägga till följande till HBSS (med Ca ^{2 +} och Mg ^{2 +,} se tabell 1): HEPES till 25 mM.
3. Framställ II Perfusion buffert plus collagenaseII: Lös kollagenas II (1000 U) med 300 ml perfusionsbuffert II och hålla lösningen varm i vattenbad före perfusion. Denna lösning bör användas inom 30 minuter på grund av aktiviteten hos kollagenas II minskade med tiden.
4. Förbered William fullständiga Medium: Lägg till följandeWilliams Medium E: L-glutamin med 2 mM, fetalt bovint serum (FBS) till 5%, insulin och 100 nm, dexametason och 100 nm, penicillin till 100 lU / ml och streptomycin till 100 mg / ml.
5. Dessa buffertar bör värmas under 30 minuter i vattenbad vid 42 ° C, en optimal temperatur som motsvarar en utloppstemperatur vid den kanyl på 37 ° C.

2. Råtta Perfusion för levern Isolation

1. Perfusionssystemet består av pumpen, autoklaverbara silikonplaströr och ett vattenbad (se figur 1). Förinställas av flödeshastigheten hos den peristaltiska pumpen perfusionen till 10 ml / min.
2. Bedöva en vuxen råtta (300 g kroppsvikt) med intraperitoneal (ip) ketamin (87 mg / kg kroppsvikt) plus xylazin (13 mg / kg). Djup av anestesi skall övervakas av toe nypa. När råttan inte längre svarar på skadliga stimuli, raka buken hår och prep buken med Betadine och etanol. In genom en mittlinjeincision.
3. Exponeraden hepatiska portådern genom att noggrant förflytta inälvorna till höger utanför bukhålan, och infogar en 18-gauge angiocath i levern portvenen (se figur 1).
4. Ansluta perfusatet slangen för att nålen och initiera infusion in situ vid en låg flödeshastighet (10 ml / min) med förvärmd (37 ° C) perfusionsbuffert I.
5. Om det utförs korrekt, bör levern börjar omedelbart på blanchera. När framgångsrika kanylering bekräftas, gör ett snitt på nedre hålvenen (IVC) för att tillåta utflöde (figur 1). Ett ytterligare test för framgångsrik kanylering kan utföras genom att trycka lätt med steril kompress på IVC, alla lober i levern bör snabbt börja svälla.
6. Öka hastigheten av flödet till 25 ml / min. Levern ska bli blek i färgen.
7. Växla perfusion lösningen perfusionsbuffert II plus kollagenas II utan avbrott av flöde för ytterligare 6 minuter.
<li> regelbundet (5-10 gånger under matsmältningen) utöva tryck med pinnen till IVC för 5-sekunders intervall. Levern kommer att svälla, vilket leder till ökad hepatisk cell dissociation, som i sin tur minska den totala koktiden och öka slutliga avkastning.
8. Efter kollagenas perfusion ska levern börja leta mosig. Dissekera levern fri plats i en pre-kyld steril bägare med 20 ml William fullständiga Medium, och sedan ta det till vävnad cellodling huva.

3. Hepatocyt cellisolering

1. Inom cellodling huven, använda en cellskrapa att försiktigt dispergera cellerna i Williams komplett medium i en steril petriskål.
2. Filtrera cellen dispersionen genom en 100 | im porstorlek cellfilter i en 50 ml koniskt rör i syfte att avlägsna bindvävnader och osmält fragment vävnad.
3. Suspendera cellerna i 40 ml Williams komplett medium och centrifugera vid 50 xg under 3 min vid 4 ° C.
4. Sug av supematanten ochförsiktigt återsuspendera celler i 40 ml kallt William fullständiga Medium att tvätta celler. Upprepa centrifugeringen.
5. Sug av supematanten och försiktigt återsuspendera celler med 25 ml Williams komplett medium. Tillsätt 25 ml 90% Percoll-lösning i PBS in i röret och blanda försiktigt.
6. Centrifugera vid 200 x g under 10 min vid 4 ° C. Aspirera döda celler från toppen av gradienten eftersom de livskraftiga cellerna förblir vid botten av Percoll-gradienten.
7. Häng cellpelleten i 30 ml varmt William fullständiga Medium, och sedan upprepa centrifugering och återsuspendera cellpelleten i 20 ml varmt William fullständiga Medium.
8. Räkna cellerna i cell-suspensionen med användning av en hemocytometer och bestämma cellens livsduglighet genom trypan blå-färgning.

4. Hepatocyt kultur

1. Späd celler i varmt Williams fullständigt medium till föredragna koncentrationen, t ex 2,5 x 10 ⁵ celler per ml. Plate celler vid en önskad volym på cellodlingsplattor, t.ex.. 5 x 10 ^5-celler / 2 ml / brunn och 6 brunnar / platta, eller 2,5 x 10 ⁵ celler per 1,5 ml / brunn, 12 brunnar / platta. Un-belagd plåt är bra för kulturer hepatiska cell.
2. I en typisk preparativ med> 85% viabla celler, bör celltätheten når cirka 60-70% konfluens, vilket medger cell-cellkontakt under bibehållande av tillräcklig plats för hepatocyterna att växa till sin fulla cellstorlek och ge en slutlig sammanflöde av 90-95%.
3. För att bilda en ännu monoskikt av hepatocyter, med andra ord, för att minimera tendensen för celler att aggregera i det centrala området av brunnen (mest sannolikt på grund av luftflödet in i cellen inkubator), tillåter plattorna att förbli inuti cellodlingen huven under 30 minuter innan de placeras i en inkubator.
4. Odla cellerna vid 37 ° C i en fuktad atmosfär av 95% luft och _5% CO2. Efter att 4-h odling kan cellerna antingen förbli i samma serum-innehållande medium eller ersätta mediet med serum-free-medium, t.ex. HepatoZYME-SFM (se tabell 1). Det serumfria mediet hjälper till att bibehålla cellmorfologi utan några negativa effekter från hormoner när ett serumfritt medium som används.
5. Tillåta celler att återhämta sig och växa åtminstone över natten före experimentet. Vi rekommenderar att använda celler för test inom 24 timmar eftersom det kan bidra till att bevara funktionen av kritiska enzymer (t.ex. P450).
6. Ersätta odlingsmediet med 2 dagars intervaller om nödvändigt.

5. Representativa resultat

De villkor som anges regelbundet genererar cell skördar på 1,0 x 10 ⁸ celler per beredning från en råtta lever. Viabiliteten hos hepatocyterna mätt genom trypanblåttuteslutning var genomgående inom intervallet 88 ~ 96%.

Såsom visas i figur 2, den hepatocyter aggregerar och bildar kluster efter 4 h ympning. Mest isolerade celler platta och spridas i typisk monolager tillväxt. Genom 24 h, är kanterna på celler definieras, är ytan av celler ganska slät och lipiddroppar är synliga. Cellerna har en till tre nukleolerna, som är runda, ligger i centrum av cellerna, och kärnorna displayen konsekvent storlek hos celler (Figur 2).

Figur 1. Ett diagram över leverperfusion. En 18-gauge angiocath införes i portvenen hos levern, därefter en perfusat slang ansluten till nålen. När framgångsrika kanylering bekräftas, gör ett snitt på nedre hålvenen (IVC) för att möjliggöra utflöde.

Figur 2. Morfologi hos odlade hepatocyter över tiden (4 h till 24 h), förstoring x 200. Efter odling under 24 timmar, cellerna sprids i typiska monoskikt tillväxt, och skarvarna mellan cellerna är linjära.

Namnet på reagens	Företaget	Katalognummer
HBSS (utan Ca 2 + och Mg 2 +)	Invitrogen	14.174
HBSS (med Ca 2 + och Mg 2 +)	Invitrogen	14.025
Williams Medium E	Invitrogen	12551-032
Collegenase II	Worthington	LS004176
Cellfilter (100 pm)	BD	352.360
HepatoZYME-SFM	Invitrogen	17.705
PercoU	Sigma	P4937
Angiocath (18-gauge)	BD	381.705

Tabell 1.

Discussion

Primärkultur av hepatocyter är en in vitro-modell används allmänt för att studera olika aspekter av levern fysiologi och patologi. Till exempel primär kultur används för att bedöma uttryck och funktion av narkotika-enzymer, inklusive cytokrom P450, läkemedelsmetabolism, interaktioner med andra läkemedel och de mekanismer för cytotoxicitet och genotoxicitet ^3-7. Protokollet beskriver isolering och odling av celler från råtta levern är anpassad från de tidigare rapporterna från Aiken et al. ^8, och andra ^2,9,10 med ändringar. De betingelser som beskrivits genomgående generera livskraftiga hepatocyter upp till 1,0 x 10 ^8-celler per beredning med cellviabilitet mellan 88 ~ 96%. Följande är andra viktiga steg:

1. Som med alla protokoll som beskriver cellkultur, är den mest kritiska aspekten för att undvika kontaminering från bakterier eller svamp patogener med hjälp av strikt aseptisk teknik ^11.
2. Desmosom, även känd som macula adherensgränssnitten är en cellstruktur specialiserad för cell-till-cell-adhesion. Integriteten hos desmosom kräver kalcium och bryts ned av EDTA och kalcium-fria medier. Enzymerna kollagenas kan dissociera desmosom, vilket leder till cellerna isolering hepatiska. Därför använder perfusion Ca ^{2 +} medium och därefter Ca ^{2 +} rikt medium som innehåller Ca ^{2 +} beroende kollagenas, för matsmältningen.
3. Lämplig kollagenas behandling är helt avgörande för hepatocyte beredning. Flödeshastigheten hos Perfussion buffert II plus collegenase II bör hållas vid 25 ml / min. Vanliga orsaker till misslyckade hepatocyte kulturen är: 1) Dåligt cell dissociation, vilket kan bero på att perfusion buffertar otillräckligt värms till 37 ° C och / eller långsam perfusion hastighet, och 2) celldöd, vilket Could bero på överdriven kollagenasdigerering.
4. Var försiktig när du ändrar media efter den första 4-H kulturen, eftersom hepatocyter är fortfarande relativt ömtåliga och kan lätt skadas eller störas genom direkt kontakt, pipett enda negativa sidan av brunnen, och aldrig direkt på cellerna.