Ribosome 바운드 Polypeptides을 파악하는 도구로 SecM 체포 시퀀스를 사용하여

Summary

우리는 지금 여기 정기적으로 안정적으로 바운드 ribosome 초기 체인 단지 (RNCs)를 분리하는 데 사용되는 기술을 설명합니다. 이 기술은 17 아미노산 긴 SecM "체포 시퀀스는"prokaryotic에서 번역 신장을 중지할 수있는 발견의 활용 ( E. 대장균 거의 모든 단백질 (또는 C-말단에 융합)에 삽입) 시스템.

Abstract

광범위한 연구는 세포에 개고 단백질이 공동 translational 절차 ^1-5는 것을 제안 충분한 증거를 제공했습니다. 다만, 폴리펩티드 사슬는 기능적인 양식을 달성하기위한 공동 translational 접는 동안 다음과 정확한 경로는 여전히 수수께끼입니다. 이 과정을 이해하고 공동 translational 접힘 중간체의 정확한 형태를 결정하기 위해서는, 그들의 자세한 구조 분석을 허용하도록 미리 정해진 크기의 초기 체인을 들고 RNCs의 절연을 허용 기법을 개발하는 것이 필수적입니다.

SecM (분비 모니터)는 170 아미노산 E.입니다 secM-secA 오페론 ⁶ 하류 SecA (분비 운전) ATPase의 표현을 규제 대장균 단백질. Nakatogawa와 이토 원래 SecM 단백질의 C-말단 지역에서 17 아미노산 긴 시퀀스 (150-FSTPVWISQA QGIRA G P-166)에 충분하고 필요한 것을 발견따라서 peptidyl-glycyl-tRNA가 안정적으로 ^7-9 P 사이트 ribosomal에 바인딩 생산, Gly165에서 SecM 신장의 연기자 거든. 더 중요한 건, 그것이 17 아미노산 긴 시퀀스 따라서 미리 결정된 사이즈 ^7의 초기 체인을 들고 RNCs의 생산을 허용하는 거의 모든 전신 및 / 또는 잘린 단백질의 C-말단에 융합 수있는 사실을 발견했습니다. 따라서 대상 단백질에 융합하거나 삽입할 때 SecM 끄는 순서는 폴리펩티드 사슬의 신장의 체포를 생산하고 E.에서 생체내에 모두 안정적인 RNCs를 생성 대장균 세포와 세포없는 시스템에서 체외 인치 자당의 기울기 원심 분리는 더욱 RNCs을 분리하기 위해 사용된다.

격리된 RNCs는 공동 translational 접힘 중간체의 구조 및 기능적 특징을 분석하는 데 사용할 수 있습니다. 최근에는이 기술이 성공적으로 여러 개의 ribosome 바운드 초기 체인 ^10,11의 구조에 대한 통찰력을 얻기 위해 사용되었습니다. 다음은 소 감마-B Crystallin의 고립을 설명하는 것은 SecM에 융합 및 체외 번역 시스템에서 발생 RNCs.

Protocol

1. DNA를 템플릿 준비 및 시험 관내 스크립트 작성에

1. 관심있는 유전자는 어떤 T7 및 / 또는 예 : 플라스미드 기반 SP6 발기인에 복제됩니다. 관심 RNCs를 얻으려면 폴리펩티드 대상의 C-말단은 SecM FXXXXWIXXXXGIRAGP ⁷ 구속 유도 시퀀스를 추가하여 연장됩니다. 관심 폴리펩티드 조각은 ribosomal 터널 밖으로 압출 성형 것을 보장하기 위해서, 대상 단백질의 C-말단 부분은 ^12-14 최소한 30 아미노산에 의해 확장되어야한다. 유연한 글리신 - 세린 풍부 링커는 모든 가능한 conformational 제약을 피하기 위해 단백질과 SecM 체포 시퀀스 사이에 도입 할 수 있습니다.
2. 시험 관내 전사의 경우, 템플릿 DNA가 ORF의 하류를 절단 제한 효소로 선형되어야합니다. 하나는 아가로 오스 겔 전기 영동에 제한 소화 제품을 실행하여 플라스미드 DNA의 완전한 선형화를 확인해야합니다.
3. 선형 혈장id는 추가 시험 관내 전사 반응에 사용됩니다. 템플릿 DNA의 서로 다른 농도는 시험 관내 전사에 필요한 최적의 DNA 농도를 확인하는 테스트를 할 수 있습니다. 일반적으로 Amb....

Discussion

시험 관내 전사와 번역에 사용된 부품의 재현성 결과, 품질과 집중이 중요하십시오. 우리는 시험 관내 전사 및 번역 추출물에서 시판 사용하고 신중하게 처리한다면 그들은 효과적이고 재현성 결과를 제공합니다. mRNA의 품질이 번역에 영향을 미칠 수 있으므로, 그것은 체외의 번역을 위해 사용하기 전에 mRNA의 무결성을 테스트하기 위해 가장 중요합니다. 체외 번역에 대한 배양 시간은 단백질의 길이에 따라 다릅니다. 또한, 원심 분리의 시간 / 속도, 그에 따라 조정할 수 있습니다 경우, 70 ribosomal 분수가 잘 해결되지 않고 50에서 분리. 또한, ribosome 바운드 단백질 단지는 RNase 오염을 피하기 위해 신중하게 다루어 져야합니다. 또한, 버퍼 조건 주의깊게 모니터링해야하며 MG ² 킬레이트 수 chelating 요원은 ⁺ 피해야한다.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
시약 / 키트의 이름	회사	카탈로그 번호
MEGAscript T7 높은 항복 전사 키트	Ambion	AM1333
RTS 100 E.coli HY 키트	5 프라임	2,401,100
Ribonuclease 억제제	Invitrogen	15518012
트랜스 [35 S]-라벨	MP의 Biomedicals	0,151,006
Amicon 울트라-4 원심 필터 유닛	Millipore	UFC801008
저장 형광체 autoradiography	GE 헬스케어	태풍 9,410 가변 모드 영상기
밀도 그라데이션 분획화 시스템	Teledyne Isco 주식 회사	ISCO 프로그램 밀도 기울기 시스템
자당 그라데이션 Centrifugation	Beckman 보습 바로 앞에 달린 풀베는 날	Optima L-90 K 예비의 Ultracentrifuge