Summary
流感病毒与宿主细胞染色体复制他们在协会的RNA基因组。在这里，我们提出了一个方法来净化完整的病毒核蛋白复合物，从感染细胞的染色质。纯化病毒复合物，可以分析，Western blot和引物蛋白质和RNA含量的扩展，分别。
Abstract
像所有的负链RNA病毒，流感病毒的基因组在病毒核蛋白复合物（vRNP），单链的基因组，其中encapsidated由核蛋白（NP），三聚聚合酶组成的复杂关联的形式打包的PA，PB1和PB2亚基。然而，在大多数RNA病毒，流感病毒感染细胞的细胞核中执行病毒RNA的合成。有趣的是，病毒mRNA的合成采用细胞mRNA前，为引物，并已提出，这个过程需要1对染色体的地方。也被病毒聚合酶和RNA聚合酶II的主机，以及NP和主机的核小体之间的相互作用特点1,2。
近日，代编码单链球菌标签的重组流感病毒的基因融合病毒聚合酶PB2亚基C-末端（rWSN铅，链球菌3）已成为EN描述。这些重组病毒PB2-含复合物，包括vRNPs从被感染的细胞，使净化。为了获得纯化vRNPs，被感染的细胞培养，vRNPs有亲和力，从来自这些细胞裂解纯化。然而，迄今用于裂解程序已根据上一步的洗涤剂溶解，尽管一般核酸的存在，往往只提取染色质结合材料低效。
我们的前期工作的建议，没有在传统的细胞裂解提取大量的核vRNPs的部分，因此，不能亲和纯化。为了提高提取效率，并从非绑定到染色质的核vRNPs分开染色绑定，我们适应了一步明智的亚流感病毒感染的细胞提取协议。简言之，此过程首先从细胞核分开，然后提取可溶性核蛋白（这里称为“核质”的部分）。其余的不溶性的核材料，然后消化Benzonase，非特异性的DNA / RNA核酸，其次是两个盐提取步骤：首先使用150 mM氯化钠（称为“ch150”），然后500毫米的NaCl（“ch500”（ 图1） ）。根据我们的观察，这些盐的提取步骤被选为500 mM氯化钠充分溶解超过核vRNPs 85％，但仍允许亲和力矩阵标签vRNPs具有约束力。
受感染的细胞的亚细胞分离后，它是可能亲和力净化PB2标签从每个人的分数vRNPs和分析其蛋白质和RNA的组成部分，分别用Western blot和引物延伸，。最近，我们利用这种方法，发现在感染后的后期染色质部分提取500 mM氯化钠（ch500）3点，vRNP出口复合物的形式。
Protocol
一个协议的原理流程图如图。 1和试剂表呈列如下。
1。感染（16 - 24小时）
- 出HeLa细胞在5 150毫米塑料杜尔贝科的改良Eagle培养基（DMEM培养基），高糖培养基，这样，他们将达到约80％汇合翌日（约5×10 8个细胞）细胞在培养皿中的种子。重要的是，这些细胞没有达到100％汇合。
- 第二天，稀释到的链球菌标签的流感病毒库存磷酸盐缓冲液（PBS）含0.3％牛血清白蛋白（BSA）的多重感染3。
- 从细胞生长培养基，用PBS洗一次，添加10毫升PBS含有病毒的细胞。在室温下1小时的孵育。
- 更换培养液高糖感染的媒介，继续孵化，在37°C。
2。亚细胞分离（3小时）
- 一次用冷PBS洗涤细胞和暂停冷PBS用橡皮刮刀和转让到50毫升锥形管细胞。
- 颗粒细胞在表顶部的离心5分钟1000转，然后吸的PBS。
- 重悬细胞沉淀在10毫升冷蔗糖缓冲（10毫米肝素钠pH值7.9，氯化钾10毫米，2毫米镁醋酸（MgOAc），3毫米氯化钙 ，蔗糖340毫米，1毫米二硫苏糖醇（DTT），1％的蛋白酶抑制剂混合） 。暂停后，通过细胞200μl的吸管尖连接到一个10毫升的塑料血清移液管，破坏细胞团块。
- 在冰上孵育10分钟。轻轻颠倒定期悬浮细胞。
- Nonidet的P-40（NP-40）在高速的终浓度为15秒到0.5％和旋涡。立即在4°C离心10分钟在3500 XG表顶部的离心GE。
- 删除上清并存储在4°C。这是细胞质的一部分。颗粒要小，比原来的细胞沉淀白。所有的分数可以在4°C保存至少4小时
- 洗5毫升冷蔗糖缓冲液，再离心沉淀在步骤2.5和弃上清。
- 悬浮颗粒（含核）1.5毫升冷核质提取缓冲液（50 mM的肝素钠pH值7.9，150毫米KOAc，1.5毫米氯化镁 ，0.1％NP-40，数码地面1毫米，1％蛋白酶抑制剂组合）。
- 转移到冷藏，全玻璃4毫升Dounce匀浆紧身杵和20杆，均质细胞核。
在同质化，避免起泡。阻力后，应增加约10招。相衬显微镜下可以确认有效的同质化。 - 均质核转移到1.5毫升离心管和孵化一个旋转的轮子上20分钟，在4°C。
- 在离心10分钟，在4°C离心16,000 xĞ。
- 删除上清并存储在4°C。这是核质的分数。
- 重悬浮颗粒在1.5毫升的消化缓冲液（50 mM的肝素钠pH值7.9，10 mM氯化钠， 氯化镁 1.5毫米，1毫米数码地面电视，1％的蛋白酶抑制剂的组合，100单位/毫升Benzonase（RNA分析，20 U / ml的酶代替无DNA酶I））预先加热至37℃，孵育10分钟，在37°C。
- 加入42微升5 M氯化钠（终浓度为150 mM氯化钠）和孵育20分钟，在4°C。
- 在离心10分钟，在4°C离心16,000 xĞ。
- 删除上清并存储在4°C。这是的ch150分数。
- 沉淀重悬在1.5毫升冷高盐缓冲液（50毫米肝素钠pH值7.9，500 mM氯化钠，MgCl 2的 1.5毫米，0.1％NP-40，1毫米数码地面电视，1％蛋白酶抑制剂组合）和孵育20分钟冰。
- 在16000离心x G </ EM>在在4°C离心10分钟。
- 删除上清并存储在4°C。这是的ch500分数。
3。链球菌标记净化（2小时）
- 加入300μl5 M氯化钠的细胞质部分（终浓度为150 mM氯化钠）。
- 等分包装链球菌Tactin琼脂糖珠每分数在15毫升锥形管100微升。
- 倒置管，珠链球菌洗涤缓冲液加入10卷（20毫米肝素钠pH值7.9，150 mM氯化钠（500 mM氯化钠为ch500样品），1毫米EDTA）混合，离心5分钟，在1000×Ğ在桌面离心。
- 弃上清，重复步骤3.3的两倍，然后悬浮在珠链球菌洗涤缓冲液等体积的颗粒。
- 加入200μL洗链球菌Tactin珠浆每个分数为nuceloplasmic 1.5毫升离心管，ch150，ch500分数和细胞质分数15毫升锥形管。
- 轮流管1H在4°Ç一个旋转的轮子上。
- 离心管1 4分钟1000×Ğ°C。弃上清。
- 每管加入1毫升的冷链球菌洗涤缓冲。转珠管（胞质分数）从15毫升到1.5毫升管。 4管1分钟°C间，在步骤3.7离心后洗净。重复此清洗步骤两次。
- 最后的洗涤步骤后，洗涤缓冲液中删除所有的痕迹，使用一个单位的枪头。加入100μL洗脱缓冲液（链球菌洗涤缓冲液2.5毫米desthiobiotin），轻轻混匀。
- 在冰上孵育15分钟。轻轻混珠偶尔轻敲管底部。
- 离心管1000×Ğ1分钟在4°C的离心。收集上清含洗脱链球菌标记vRNPs的的。
4。代表结果
分馏的效率是最好的分馏裂解免疫印迹使用antib分析的判断odies特定的亚细胞标记（ 图2）。具体来说，成功的亚核分馏应该表现出的核质很少或没有细胞的RNA聚合酶II（聚合酶II），或可溶性核分数，最应提取150毫米氯化钠5。聚合酶II退化也再现观察流感病毒感染的细胞，而未受感染的细胞，与文献6一致。
vRNPs净化是最好的判断银或考马斯染色，在图细胞质洗脱液所示。 3。在我们的经验，最链球菌PB2纯化的完全形成vRNP的一部分，即微溶于聚合酶捕获。这反映在高NP比：PA/PB1/PB2的比例由银或考马斯染色观察。较低的比率表明核糖核酸酶缓冲污染，几个无处不在的核糖核酸酶（如RNA酶A），以解离这样的方式被称为裂解病毒RNA吃了聚合酶的NP多聚体7。有趣的是，Benzonase单独处理，同时充分消化病毒RNA，似乎没有任何效果stochiometric比率vRNP蛋白质。虽然我们无法解释这种现象，我们观察到中断后与其他核糖核酸酶（数据未显示）表明Benzonase，消化vRNPs可能会留下一定的结构RNA的重要地区保持不变。 vRNPs细胞质和核质（无核酸的消化执行）净化后，8淡淡的，但离散带，分子量高，可以观察到银染，这对应于8个流感基因片段的预测分子量（见文献3 ）。
如图从每个部分纯化vRNPs在9小时后感染的相对含量。 4。的vRNPs分布因在感染过程中，最强的在ch150分数积累在早期的时间点，在年底的时间点，增加积累，在胞核和胞浆。
图1。亚细胞分离流程图。改编自文献。 3。
图2。西方blot分析流感病毒感染的细胞，亚细胞组分。 9小时之前，亚细胞分离流感病毒株的WSN 10 9 HeLa细胞感染。等量的总蛋白被装在每个通道使用的抗体显示和分析。 RNA聚合酶II（聚合酶II）的检测，使用克隆8WG16，承认所有形式的C-端结构域（的hypophosphorylated带最为突出）。改编自文献。 3。
图3。银染色分析纯化vRNPs的。 HeLa细胞感染rWSN（阴性对照）或9小时的rWSN-PB2-链球菌，链球菌净化从细胞质分数。星号表示带RNase消化后，这是不可见的。改编自文献。 3。
图4。银污渍分析，从不同的细胞组分纯化vRNPs。 10 9 HeLa细胞感染rWSN PB2-链球菌或rWSN的9小时其次是亚细胞分离和纯化链球菌。从各部分洗脱液等量加载。改编自文献。 3。
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Discussion
虽然最近已经有很多研究发现流感病毒感染的8所涉及的个别蛋白质或蜂窝网络，大多数这些相互作用的功能意义尚不清楚。鉴于流感病毒RNA的合成和复杂的生物物理和生物化学性质的核9基于染色质功能的绝对依赖，新技术将被要求澄清这些功能。我们在座的亚核分馏，加上亲和纯化的vRNPs，允许表征至关重要病毒RNA工厂这是以前无法进入的。
许多亚细胞分馏协议此前已在文学描述。我们观察到，这些传统的方法导致过早vRNPs的核泄漏，这种现象也聚合酶II 10。通过使用低C的预膨胀细胞潜伏期短弱洗涤剂，NP-40 oncentration，高效的细胞膜溶解发生无明显的核泄漏。有趣的是，执行我们使用A549和HEK293T细胞，而不是强vRNPs在两个细胞系的核泄漏导致HeLa细胞的亚细胞分离。 NP-40的浓度降低至约0.2％减少这个问题，但是，由于一些这些细胞株的变异，最优条件下，应根据经验来确定。另一个的可能altermative是MDCK细胞或Vero细胞，如使用非人类流感病毒的易感细胞株。
我们的盐提取协议不同于传统的染色质提取的程序，往往使用低盐分浓度和/或高EDTA的浓度。我们的协议分隔成两个具体的馏分，波尔II-high/histone-low的分数，其相互染色。然而，其他染色体的提取方法也可能与亲和纯化的VRN兼容PS。由于大多数染色提取程序集中DNA-蛋白质相互作用的蛋白质相互作用相比，新技术的需要紧紧地提取染色质结合的多蛋白复合物11。
在一般情况下，感染的长度应根据经验来确定病毒菌株和细胞株中的变化。 -PB2-链球菌菌株在3 MOI rWSN，我们已经完成了亚细胞分离，在3至10小时后感染不同的时间点。在我们的经验，不到3Ĥ感染产生有益的Western blot分析纯化vRNPs太少，而感染时间超过3小时，在强大的细胞病变效应的结果和随后的分数混合。
隔离完整，紧密的染色质结合的病毒复合物的能力开辟了几种可能性。虽然我们利用重组病毒表达链球菌的标签PB2，其他的亲和标签也可以被使用，以及TRADitional针对其他病毒蛋白免疫沉淀。此外，纯化复合物而被限制其蛋白质和RNA元件特性我们分析vRNPs的，也可以被用来进行体外合成实验的功能。最后，将通过亚核分馏粗功能物种vRNPs分离，也可以让几个最近描述高效的病毒RNA合成12,13所需的病毒蛋白的翻译后的修改，进一步仔细研究。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
作者要感谢为rWSN PB2-链球菌病毒纳达Naffakh和玛丽 - 安妮Rameix Welti（巴斯德研究所）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM-high glucose | GIBCO, by Life Technologies | 11965-092 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Protease inhibitor Mix G | SERVA Electrophoresis | 39101 | |
| Benzonase Nuclease | Novagen, EMD Millipore | 71206 | 25 U/μl |
| DNase I, RNase-free | Thermo Fisher Scientific, Inc. | EN0523 | 50 U/μl |
| Dounce homogenizer | Wheaton | 432-1271 | Use type "B" pestle |
| Strep-Tactin Sepharose | IBA GmbH | 2-1201-025 | 50% suspension column format can also be used |
| Desthiobiotin | IBA GmbH | 2-1000-002 |
References
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