ويتم تنظيم الطوبوغرافي الدوائر العصبية في المقصورات وظيفي مع التشكيلات الجزيئية محددة. هنا، ونحن نقدم الخطوات العملية والتقنية للكشف عن العالمية تضاريس الدماغ باستخدام تنوعا wholemount نهج تلطيخ المناعى. نحن إثبات فائدة من طريقة استخدام التهندس الخلوي مفهومة جيدا والدوائر المخيخ.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
Wholemount المناعية للكشف عن تضاريس دماغية معقدة
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
بنية متكررة ومفهومة جيدا الخلوية من المخيخ جعله نظاما نموذج مثالي لاستكشاف تضاريس الدماغ. الكامنة وراء التهندس الخلوي بصورة موحدة نسبيا هي مجموعة معقدة من المجالات مجاور للسهمي من الجينات والبروتينات. وينعكس هذا التقسيم الجزيئية للمخيخ من قبل المنظمة التشريحية والوظيفية للألياف وارد. لنقدر تماما مدى تعقيد منظمة المخيخ نحن صقلها من قبل نهج تلطيخ wholemount لتحليل إنتاجية عالية من العيوب الزخرفة في المخيخ الماوس. هذا البروتوكول يصف بالتفصيل الكواشف، والأدوات، والخطوات العملية التي هي مفيدة للكشف عن أنماط التعبير بنجاح بروتين في المخيخ فأر بالغ باستخدام wholemount المناعية. سلط الضوء على خطوات تثبت هنا فائدة هذه الطريقة تستخدم للتعبير عن zebrinII / aldolaseC كمثال على الكيفية التي يمكن بها كشف تضاريس الدقيقة للدماغ في تقريرهاأصلي ثلاثي الأبعاد التشكل. كما وصفت هي التعديلات على البروتوكول الذي يسمح لتصور من بروتين تعبير وارد في التوقعات ومخيخات كبير للدراسات المقارنة للالتضاريس الجزيئية. لتوضيح هذه التطبيقات، يتم تضمين البيانات من تلطيخ وارد من المخيخ الفئران.
البروتوكول
1. الإرواء الحيوانية والتشريح المخيخ
- اعتمادا على البروتين، قد نضح تكون ضرورية ل1،2 تلطيخ ناجحة. Transcardiac نضح هو الغازية، وعدم بقاء الإجراء الذي يتطلب الاستخدام السليم للأدوية التخدير. التدريب الصحيح، وموافقة المؤسسية، والموافقة IACUC كلها ضرورية قبل محاولة هذا الإجراء. هو دائما فكرة جيدة للتشاور مع الأطباء البيطريين في المؤسسة للحصول على مساعدة في تحديد متطلبات التجريبية والحصول على التدريب الصحيح. قبل هذا الإجراء، يجب أن يكون هذا الحيوان تخدير عميق، وليس استجابة للمؤثرات مثل الأقدام أو قرصة الذيل. مقص باستخدام يجعل قطع في ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
وقد وصفت لنا التفاصيل الفنية اللازمة لتلطيخ wholemount ناجحة باستخدام نهج متعدد الاستعمالات المناعى للتعبير عن بروتين كاشفة في الدماغ النامية وتعليم الكبار. باستخدام هذا النهج، يمكن تحليل معقد أنماط التعبير الجزيئية وتضاريس الدماغ تقدير من دون الحاجة إلى شاقة وتستغرق وقتا طويلا الإجراءات باجتزاء الأنسجة.
وقد استخدم هذا البروتوكول للكشف عن التعبير نمط من عدة بروتينات الخلايا العصبية في البالغين على حد سواء في وقت .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدينا ما يكشف.
شكر وتقدير
ويدعم RVS بواسطة محقق جديد لبدء الأموال من كلية ألبرت اينشتاين للطب في جامعة يشيفا.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| المواد | وظيفة في بروتوكول | ||
| مضخة نضح (فيشر Scientific/13-876-2) | يسمح لنضح بما يتفق وبطيئة. | ||
| مقص حاد الطرف (FST/14081-08) | الاستخدام العام في نضح وتشريح. | ||
| كليل معلومات سرية الملقط (FST/91100-12) | لتحقيق الاستقرار في قلب لإدخال الإبرة نضح. | ||
| ملقط (FST بواسطة دومون AA/11210-10) | لاستخدامها خلال تشريح الدماغ من الجمجمة وفصل المخيخ عن بقية الدماغ. هذه ضرورية لأن لديهم معلومات سرية مقربة قليلا أن يساعد على التقليل من الأضرار التي لحقت المخيخ خلال تشريح. | ||
| Nutator (فيشر العلمية) | تستخدم للحفاظ على النسيج في الحركة خلال فترات حضانة. | ||
| 1.5 مل أنبوب (Sarstedt / المكسرات سقف مايكرو أنبوب) | كل الخطوات من لهtochemistry بروتوكول تجري في هذه microtubes. أسفل تقريب يضمن أن يبقى في المخيخ الحركة. | ||
| مثقب ملعقة (FST/10370-17) | تستخدم للحفاظ على wholemounts في microtubes بينما الصب بلطف خارج الحل قضى. | ||
| مجهر لايكا MZ16 FA | تستخدم لفحص تلطيخ wholemount. | ||
| لايكا DFC3000 FX الكاميرا | تستخدم لالتقاط الصور wholemount. |
الجدول رقم 1.
| تقويم مثال لتجربة نموذجية wholemount | ||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| اليوم 1 | دنت في الإصلاح، درجة حرارة الغرفة، 8 ساعات | دنت في التبييض، و 4 درجات مئوية، بين عشية وضحاها | ||||||
| اليوم 2 | 100 MeOH٪، درجة حرارة الغرفة، 2X، كل 30 دقيقة | 100 MeOH٪، تجميد / الذوبان، 4X، 30 دقيقة min/15 | ن = "2"> MeOH 100٪، -80 درجة مئوية، بين عشية وضحاها | |||||
| اليوم 3 | 50٪ MeOH/50٪ PBS، درجة حرارة الغرفة، 60-90 دقيقة | 15٪ MeOH / PBS 85٪، درجة حرارة الغرفة، 60-90 دقيقة | 100 PBS٪، درجة حرارة الغرفة، 60-90 دقيقة | 10μg/mL بروتين كاف في برنامج تلفزيوني، درجة حرارة الغرفة، 2-3 دقيقة | 100 PBS٪، درجة حرارة الغرفة، 3X، 10 دقيقة كل | PMT، 4 درجات مئوية، بين عشية وضحاها | ||
| يوم 4-5 | PMT + 1 ° الضد + 5٪ DMSO، 4 درجات مئوية، 48 ساعة | |||||||
| 6 أيام | PMT، 4 درجات مئوية، 2-3X، 2-3 ساعات كل | PMT + 2 ° الضد + 5٪ DMSO، 4 درجات مئوية، 24 ساعة (أو تبدأ خطوات التضخيم مع مجمع ABC) | ||||||
| يوم 7 | PMT، 4 درجات مئوية، 2-3X، 2-3 ساعات كل | PBT، درجة حرارة الغرفة، 2 ساعات | في احتضان DAB جديدة في برنامج تلفزيوني حتى تلطيخ الأمثل هو تصور | |||||
| وصفات (* = إعداد جديد في كل مرة) | |
|---|---|
| برنامج تلفزيوني (الفوسفات مخزنة المالحة) | مخزنة 0.1M فوسفات المالحة في الماء منزوع الأيونات. درجة الحموضة 7.2 (أقراص سيغما، P4417) |
| PFA (لامتصاص العرق) | أدلى والمجمدة تخزين كحل 20٪ ومن ثم تخفيفه إلى 4٪ في برنامج تلفزيوني من أجل حل العمل (فيشر العلمية؛ T353) |
| دنت ومثبت 3 * | 4 أجزاء الميثانول 1 dimethylsulfoxide جزء (DMSO؛ فيشر العلمية؛ D159-4) |
| دنت في بليتش 3 * | 4 أجزاء الميثانول 1 dimethylsulfoxide جزء (DMSO؛ فيشر العلمية؛ D159-4) 1 بيروكسيد الهيدروجين جزء 30٪ |
| الأنزيمية الهضم | 10 ميكروغرام / مل من K بروتين (روش تشخيص، 03115828001) في برنامج تلفزيوني. |
| PBST | برنامج تلفزيوني وعلى متنها: 0.1٪ توين-20 (Fisheالبحث العلمي، BP337، ويمكن أيضا أن تستخدم تريتون في مكان توين-20 في جميع الحالات). |
| PMT 25 * | برنامج تلفزيوني وعلى متنها: 2٪ دهن مسحوق الحليب الخالي من الدسم (قرنفل فضل) 0.1٪ توين-20 (فيشر العلمية؛ BP337) |
| PBT 25 * | برنامج تلفزيوني وعلى متنها: 0.2٪ البقري (سيغما؛ B9001S) مصل 0.1٪ توين-20 (فيشر العلمية؛ BP337) |
| DAB * | حل 1 10 ملغ من diaminobenzidine-3،3 (سيغما الدريخ؛ D5905) في 40 مل من برنامج تلفزيوني. إضافة 10 ميكرولتر من بيروكسيد الهيدروجين بنسبة 30٪ لبدء رد فعل). |
| ABC حل معقد | Vectastain مجموعة (المتجهات المختبرات، وشركة؛ PK-4000) |
الجدول 3.
المراجع
- Sillitoe, R. V., Hawkes, R. Whole-mount Immunohistochemistry: A high-throughput screen for patterning defects in the mouse cerebellum. J. Histochem. Cytochem. 50, 235-244 (2002).
- Kim, S. -H., Che, P., Chung, S. -H., Doorn, D., Hoy, M., Larouche, M., Marzban, H., Sarna, J., Zahedi, S., Hawkes, R.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
