Summary
טפיל הצלה והמהפך assay עם THP1 תאים הנגועים
Abstract
Leishmaniasis הוא אחת המחלות המוזנחות ביותר בעולם, במידה רבה, המשפיע על העניים שבעניים, בעיקר במדינות מתפתחות. מעל 350 מיליון בני אדם נחשבים בסיכון להידבקות leishmaniasis, וכ 2 מיליון מקרים חדשים מתרחשים 1 שנתי. ישמניה donovani הוא הסוכן סיבתי לleishmaniasis הקרבי (VL), הצורה הקטלנית ביותר של המחלה. הבחירה של תרופות זמינות לטיפול בleishmaniasis מוגבלת 2; טיפולים שוטפים לספק יעילות מוגבלת ורבים מהם רעילים במינונים טיפוליים. בנוסף, רוב התרופות לטיפול הקו הראשונות כבר אבד השירות שלהם בשל הגדלת עמידות לתרופות מרובה 3. הצינור הנוכחי של תרופות הנוגדות leishmanial גם כן מתרוקן בחומרה. מאמצים מתמשכים יש צורך להעשיר את צנרת גילוי חדשה נגד leishmanial סמים, ומאמץ זה מסתמך על הזמינות של דגמים מתאימים בהקרנה חוץ גופייה.
ילדה = "jove_content"> בpromastigotes המבחנה 4 מבחני amastigotes axenic 5 משמשים בעיקר לסריקת תרופות אנטי leishmanial עם זאת, ייתכן שאינו מתאים בשל הבדלים משמעותיים סלולריים, פיסיולוגיים, ביוכימי ומולקולרי בהשוואה לamastigotes התאי. מבחנים עם מודלי macrophage-amastigotes נחשבים קרוב ביותר לתנאי pathophysiological של leishmaniasis, ולכן הם המתאימים ביותר להקרנה חוץ גופייה. תאים מובחנים, בלתי מתחלק, אדם חריפים monocytic וקמיה (THP1) (להפוך אטרקטיביים) חלופה למקרופאגים העיקריים המבודדים וניתן להשתמש בו לפעילות אנטי assaying leishmanial של תרכובות שונות נגד amastigotes התאי.
כאן, אנו מציגים assay טפיל הצלה והמהפך עם THP1 תאים מובחנים נגועים במבחנה עם ישמניה donovani לסינון תרכובות טהורות ולדרבן טבעייםתמציות ucts וקביעת היעילות נגד amastigotes ישמניה התאית. הבדיקה כוללת את השלבים הבאים: (1) בידול של THP1 תאי המקרופאגים לבלתי מתחלק-, (2) דלקת של מקרופאגים עם ל ' donovani metacyclic promastigotes, (3) טיפול בתאים נגועים בסמי בדיקה, (4) תמוגה מבוקרת של מקרופאגים נגועים, (5) שחרור / הצלת amastigotes ו( 6) טרנספורמציה של amastigotes החי לpromastigotes. Assay היה מותאם באמצעות טיפול חומר ניקוי לתמוגה מבוקרת של תאים THP1 ישמניה נגועים כדי להשיג הצלה כמעט מוחלטת של amastigotes התאי קיימא עם השפעה מינימאלית על היכולת שלהם להפוך לpromastigotes. מקרופאג השונה: יחסי promastigotes נבדקו להשיג זיהום מרבי. כימות הזיהום בוצעו באמצעות הפיכתה של חיה, הציל ישמניה amastigotes לpromastigotes והערכה של הצמיחה שלהם על ידי עלאםassay fluorometric arBlue בmicroplates 96-כן. בדיקה זו היא להשוות בשימוש כיום גן המיקרוסקופי, המהונדס כתב ומבחני ניתוח דיגיטליים של תמונות. בדיקה זו היא איתנה ומודדת את amastigotes תאי החיות בהשוואה לגן הכתב ומבחני ניתוח תמונה, שלא יכול להבדיל בין חיים והמתים amastigotes בלבד. כמו כן, הבדיקה אומתה עם פנל נוכחי של תרופות הנוגדות leishmanial ויושמה בהצלחה להקרנה בקנה מידה הגדולה של תרכובות טהורות וספרייה של שברי מוצרים טבעיים (Tekwani et al. לא פורסם).
Protocol
1. לשמור ותת תרבות תאים THP1
- לשמור THP1 תאים ב- 1640 RPMI בינוני (עם 10% FBS ו-pH 7.4) על 37 מעלות צלזיוס בCO 2 חממה 5%.
- תאים תת פעמים בשבוע כדי למנוע חריגה מספירת תאי 1x10 6 תאים / מ"ל. זה חשוב כדי לשמור על יכולת השינוי שלהם.
2. לשמור ותת ישמניה donovani Promastigotes תרבות
- לשמור על L. donovani promastigotes (S1, מתח סודאן) בRPMI-1640 בינוני (ללא סודיום ביקרבונט ופירובט נתרן) עם 10% FBS ב26 ° C.
- ל 'תת תרבות donovani promastigotes פעמים בשבוע, עם ריכוז הגבוה ביותר תאים בטווח של 20-25x10 6 / promastigotes ml.Caution: כל אמצעי התקשורת והפתרונים יש להביא לטמפרטורת החדר לפני השימוש.
3. זריעה והתמיינות של התאים בTHP1 9Microplate 6-היטב ושקופיות תרבות זכוכית 16-קאמריות.
- הכן THP1 תרבות מדוללת עם ספירת תאים של 2.5x10 5 תאים / מ"ל מתרבית תאים של ארבעה ימים בן (ספירת תאים לא תעלה על 10 6 תאים / מ"ל) בRPMI-1640 עם FBS 10% חום מומת. הכין 20 מ"ל של תרבות לכל צלחת 96 היטב ו4 מ"ל של תרבות לכל שקופית קאמרית 16-כן.
- הוסף phorbol 12-13-myristate יצטט (PMA) (לבידול של THP1) להשעית תרבית תאים בדילול מלאה (10 מ"ל μl/20 תרבות מהמניות של 50 מיקרוגרם / מ"ל בDMSO) (PMA ריכוז סופי בתרבות תאים צריך להיות מדוללת 25 ng / ml).
- כדי להשוות את תמונת הניתוח-ספירת Assay-Digital---הישיר והטפיל-Rescue-טרנספורמציה-Assay, להגדיר את המבחנים בו זמנית בצלחת ברורה, שטוחה תחתונה, 96-16-וגם קאמריים, זכוכית, שקופית התרבות מיקרוסקופית.
- לוותר 200 μl של תאי THP1-PMA-טופלו לכל באר או קאמרי.
- דגירת עמ '96-היטבlates ושקופיות קאמריות 16-גם ב37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 חממת הלילה כדי לאפשר בידול כמעט מוחלט של התאים.
הערה: THP1 התאים, אשר בדרך כלל גדלים בהשעיה, הם מובחנים למקרופאגים חסיד.
4. זיהום של תאי THP1 השתנו עם Promastigotes donovani ישמניה
- לזיהום של תרבית תאים מובחנות THP1 עם promastigotes donovani ישמניה, רוב הטפילים צריכים להיות בשלב metacyclic תולעת (צורות גליליות ארוכות, ~ יום 5-6 תרבות הישנה).
- THP1 תא 1:10 ליחס הטפיל הוא אופטימלי לזיהום הוא ב- Assay הדיגיטלי-ישיר-ספירת Image-ניתוח וPromastigote-Rescue-טרנספורמציה-Assay.
- הכן תרבות מדוללת ל ' donovani promastigotes עם ספירה טפילה של טפיל 2.5x10 6 / מ"ל (לTHP1 תאים: יחס טפילים = 1:10) מתרבות 5-6 בגיל יום ב- 1640 RPMI בינוני עם 2% FBS.
- מהשלב 3.5 (לאחר התמיינות הלילה של תרבית תאים THP1) להוציא את הצלחות ושקופיות קאמריות, להסיר את המדיום ולשטוף את תרביות תאי פעם עם 1640 RPMI בינוני סרום ללא.
- לאחר שטיפה קפדנית של PMA-טופל THP1 תאים עם סרום נטול חמים RPMI-1640 (~ 37 ° C) בינוני,, החלף את מדיום סרום ללא עם 200 μl של התרבות המדוללת ל ' promastigotes donovani (2.5x10 6 טפילים / מ"ל) מצעד 4.3. הגדר את בארות הבקרה של THP1 תאים ללא טפיל והטפיל בלי THP1 תאים בכל צלחת ושקופיות קאמריות 16-כן.
- לאחר הוספת הטפיל לתרבית תאי THP1, דגירת הצלחת ושקופיות על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 24 שעות כדי לאפשר את הטפילים להדביק את THP1 תאים המובחנים.
5. טיפול בהמקרופאגים נגועים בסמי בדיקה / תרכובות
- מבחןAmphotericin B, Pentamidine וMiltefosine כתרופות נוגדות leishmanial סטנדרטיות להקרנה. הכן פתרוני מניות של התרופות / תרכובות בדיקה במים או DMSO כאמורים בטבלה מגיבה. בדוק כל מתחם סמים בגיל 6 ריכוזים.
- סדרתי לדלל (1:5) את התרופות הרגילות ותרכובות בדיקה בצלחת טריה 96 היטב או 2 צינורות מ"ל (עבור שקופיות קאמריות) עם 1640 RPMI בינוני עם 2% FBS. התרופות / הריכוז מתחם בדיקה בצלחת זה הן 2X של ריכוזים סופיים.
- שוטף את כלי התרבות והשקופיות קאמריות נגועים בL. promastigotes donovani (מצעד 4.5) לפחות 5 פעמים עם, בינוני סרום ללא RPMI-1640. הוסף מדיום התרבות μl 100 (RPMI-1640 עם 2% FBS) לכל באר / קאמרי. את הכביסות המרובות נחוצות כדי להבטיח הסרה מלאה של promastigotes שאינו מופנם.
- הוסף בינוני μl 100 מסמי סדרה מדוללים תקניים אנטי leishmanial או תרכובות בדיקה לכל באר או קאמרי. הגדרת infecתאי THP1 טד שולטים ללא תרופות בו זמנית בכל שקופית צלחת / קאמרית.
- דגירת הצלחות והשקופיות קאמריות על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 ל48 שעות.
6. כתמי שקופיות קאמריות, הדמית פלורסנט מיקרוסקופ וניתוח תמונה לכימות זיהום והשפעה של טיפול תרופתי
- לאחר דגירת שעה 48, לשטוף השקופית הקאמרית 3 פעמים ב- 1640 RPMI בינוני סרום ללא. לקלף את תאי פלסטיק מהשקופיות ולתקן את התאים על ידי טבילת השקופיות במתנול למשך 30 שניות. השאר את השקופיות ביו ברדס מתחת לזרימת אוויר לייבוש.
- הכן הירוק פתרון מכתים SYBR (5X) על ידי דילול (1:2,000) המניות (10,000 X) עם מים.
- להכתים את השקופיות בתנאים חשוכים עם גרין SYBR המדולל אני כתם פתרון במשך 15 דקות בטמפרטורת חדר, לשטוף פעם אחת עם מים ולהשאיר את השקופיות תחת זרימת האוויר לייבוש.
- הנח coverslip כוס מלאה מעל staiשקופית נד בעזרת מדיום גובר.
- ללכוד את התמונות הדיגיטליות של THP1 תאים: ללא זיהום (ריק), עם זיהום (שליטה), תאים נגועים טופלו בתרופות שונות סטנדרטיות או תרכובות בדיקה בדילולים שונים (3 איור, 5 ו 6)) באמצעות מיקרוסקופ ניקון אקליפס 90i ניאון ליווי על ידי תוכנת 3.2 אלמנט AR ש"ח.
- לספור את גרעיני מקרופאג (גדול) וגרעינים הטפילים (קטן עם kinetoplast) באמצעות ImageJ (איור 7), שהיא תכנית בפומבי זמינה, מבוססת ג'אווה עיבוד תמונה שפותחה במכון הלאומי לבריאות (http://rsb. info.nih.gov / ij / download.html). בטא את הנתונים כמספר amastigotes כל 100 הפך THP1 תאים.
7. הטפיל-Rescue-טרנספורמציה-Assay: תמוגה מבוקרת של L. המקרופאגים donovani Amastigotes נגועים
- שטוף microplate 96-היטב מצעד 5.5 3 פעמים עם התרבות בינונית סרום ללא RPMI-1640.
- בין חומרי ניקוי שונים שנבדקו בריכוזים שונים, 0.05% טיפול SDS למשך 30 שניות הן אופטימליות עבור תמוגה מבוקרת (תמוגה תא מרבית עם אובדן מינימאלי של הכדאיות הציל 'טפילים).
- הסר את מדיום סרום ללא מכל באר אחרי השטיפה האחרונה ולהוסיף 20 μl של RPMI-1640 (עם 0.05% SDS) לכל באר. נער את הצלחת למשך 30 שניות ולהוסיף 180 מלאים μl RPMI-1640 (עם 10% FBS) לכל באר.
- דגירת הצלחות ב 26 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות לטרנספורמציה של amastigotes חולץ לpromastigotes.
8. ניתוח הכמות של Promastigote שינה (alamarBlue assay)
- לאחר דגירת 48 שעות ב 26 ° C, כל amastigotes החיות חולצה הופכים לpromastigotes (1D איור). הוסף 10 μl של alamarBlue לכל באר בעמ '96-היטבlates.
- דגירת הצלחות ב 26 ° C למשך הלילה.
- לאחר דגירת הלילה, לקרוא את הצלחות לפלואורסצנטי הסטנדרטי בFluostar גלקסי fluorimeter (טכנולוגיות מעבדת BMG) בעירור ננומטר 544, פליטת 590nm.
- הכן את עקומות תגובה במינון (צמיחת אחוזים לעומת ריכוז של מתחם תרופה או בדיקה) עם ExcelFit (תרשימים 7-9) והמחשוב IC 50/90 ערכי IC מהעקומות האלה (טבלה 1).
9. תקינה של תאי THP1 יחס טפילים
- אחידויות בTHP1 תאים ליחס טפילים כדי לקבוע רגישות של assay. הערה: זיהום נמוך / גבוה מספרי טפילים / עלול לפגוע ברגישות ובהסלקטיביות של ההקרנה.
- אחידויות בTHP1 תאים ליחס טפילים על ידי ביצוע הפרוטוקול שתואר לעיל עבור זריעת THP1 תאים וזיהום promastigote ישמניה (סעיף 3 ו 4) מלבד שימוש הבדליחסי erent של THP1 תאים לטפילים כמו 1:1.25, 1:2.5, 01:05 ו1:10.
- להגדיר את הניסוי בשתי שקופיות 16-קאמריים (לניתוח תמונה) וצלחת 96-היטב (עבור assay טפיל הצלה) פורמטים להשוואת הצלת הטפיל ומבחני ניתוח תמונה.
10. סטנדרטיזציה של חומרי ניקוי שונים לתמוגה תא מבוקרת
- המטרה העיקרית של ניסוי זה היא לייעל את הפרוטוקול לתמוגה מבוקרת של תאי THP1 להשיג THP1 תמוגה תאים מרביות / שלמה מבלי להשפיע על הכדאיות של טפילי amastigote חולצו באופן משמעותי.
- בדוק את חומרי ניקוי שונים כגון 20 Tween, Tween 80, טריטון X-100, NP-40 וSDS בריכוזים שונים ומשך זמן שונה של טיפול (איור 2).
- THP1 תאים ליחס טפילים הם 1:10 ותנאים אחרים הם דומים כמו 1-8 סעיפים לעיל.
- בדוק 0.05% SDS טיפול נוסף לזמן טיפול שונהs כדי לבצע אופטימיזציה נוספת תמוגה התא המבוקרת.
Representative Results
ניתוח הכמותי נעשה עבור שניהם---ספירה-Assay תמונה דיגיטלי-ניתוח הישיר והטפיל-Rescue-טרנספורמציה-Assay ל24, 48, 72 ו 96 שעתי טיפול שלאחר תרופה
בשיטה, זיהום הספירה הישירה של L. מקרופאגים donovani נגועים (THP1 תאים) מחושבים על ידי המשוואה הבאה:
את amastigotes (שנקבע על ידי ספירת גרעיני amastigotes) / 100 הפך THP1 תאים (שנקבע על ידי הספירה נספר בגרעין התא THP1) (איור 7) הוא מדד מדויק יותר כדי לנתח את ההשפעה של תקן שונה או תרכובות בדיקה מאחוז THP1 התאים נגועים , כפי שדווח בכמה מאמרים קודמים, כי מספר זה קשור באופן ישיר להשפעה כוללת של תרכובות, בין אם באמצעות ירידהבטפילים בתאי macrophage או הסרה מוחלטת של טפיל מcells.Infection macrophage חושב מתמונות דיגיטליות של THP1 תאים נגועים טופלו בתרופות סטנדרטיות שונות בדילולים שונים למרווחי זמן שונים (איור 10 ולוח 1). קריאה החוצה ל---הספירה-Assay Image-הניתוח הדיגיטלי הישיר היה amastigotes infection/100 הפך THP1 תאים, לטפיל-Rescue-טרנספורמציה-Assay תוך קריאה החוצה היה יחידות יחסיות קרינה (RFU), שהוא ביחס ישר למספר amastigotes החי ישמניה חולצה ממקרופאגים הנגועים ולהפוך לpromastigotes. Assay alamarBlue משמש באופן שגרתי לסריקת תרופות אנטי leishmanial ישמניה promastigotes.
הבדיקה הייתה בתחילה טופלה ומותאם לתמוגה מבוקרת של תאים THP1 ישמניה-נגועים. המטרה הייתה לייעל את התנאים לאבקה treatment, שיניב תמוגה כמעט מוחלטת של תאי THP1 עם השפעה מינימאלית על הכדאיות של amastigotes חולץ. איור 1 מתאר מבט מיקרוסקופי של פרוטוקול בדיקה המלאה. THP1 התאים שלמים נגועים בamastigotes ישמניה שניתן לראות באיור 1 א. 1B האיור מראה תמוגה של THP1 תאים לאחר טיפול חומר ניקוי. התרשים 1C מראה הציל ישמניה amastigotes, שכבר הפך באופן חלקי ולpromastigotes 1D האיור מראה שינוי כמעט מוחלט של amastigotes אל promastigotes וההפצה הבאה שלהם. הצמיחה של promastigotes הפך אלה ניתן לפקח כמותית עם תוספת של alamarBlue ומדידה של קרינה על קורא microplate. טיפול עם NP-40 (איור 2 א) וטריטון X-100 (האיור 2B) lysed את THP1 תאים הנגועים, עם זאת, זה גם השפיע על הכדאיות והפיכתם של amastigotes חולץ. טיפול עם 20 Tween (האיור 2C) וTween 80 (האיור 2D) לא גרם תמוגה אופטימלית של THP1 תאים שנוצרו לתוך הצלה חלקית של amastigotes כפי שעולה מספרים נמוכים של promastigotes מותמרים. טיפול עם 0.05% SDS למשך 30 שניות (2E איור) הניב תמוגה כמעט מוחלטת של תאים THP1 ישמניה נגועים ולא השפיע על יכולת קיום ושינוי של amastigotes הציל. אופטימיזציה נוספת הראתה כי טיפול בתאים עם 0.05% SDS למשך 20-30 שניות הניבו הצלה הגבוהה ביותר של amastigotes ישמניה קיימא (האיור 2F). בניסויים הבאים, טיפול עם 0.05% SDS למשך 30 שניות היה בשימוש. נוהל לטיפול SDS הוא זהה עבור צלחות בודדות או מרובות. בצלחות מרובות, טיפול SDS יושם טור לפי עמודה עם פיפטה רבת ערוצים. מדיום סרום ללא הוסר מכל 8 בארות של עמודה אחת של הצלחת ו20 & mu, שאני של 0.05% SDS נוסף ב8 בארות של אותה העמודה ונחלש לאחר 30 שניות עם RPMI-1640 עם 10% FBS. במהלך סטנדרטיזציה ראשונית של assay, הצלחות נבדקו במיקרוסקופ לpromastigotes שאינו מופנם. מינימום של 5 כביסות היו הכרחי להסרת טפילים לפני השלב 5 של טיפול בתאי macrophage נגועים תרכובות רגילות ושלוש כביסות היו הכרחיים לפני השלב 7 בטיפול SDS. לכן, התאים נשטפו 8 פעמים ולא promastigotes הגלוי שאינם מופנם נשאר לפני תמוגה שליטת THP1 תאים נגועים.
ניתוח תמונה דיגיטלי וספירה ישירה
את התמונות הדיגיטליות של THP1 תאים ישמניה נגועות נתפסו במיקרוסקופ ניקון אקליפס 90i ניאון לאחר צביעה עם SYBR הירוק I. שניהם גרעינים וגרעיני macrophage ישמניה תאיים עם DNA kinetoplast האופייני נצפו תחת מסנני הניאון (איור 3). יתר על כן, את התמונות של THP1 תאים נגועים גם נלכדו תחת דסק"ש. כאשר שתי התמונות מוזגו, את קווי המתאר של THP1 תאים עם amastigotes התאי נראו בצורה ברורה יותר (איור 4). תוכנת ImageJ שמשה כדי לנתח את התמונות האלה. ImageJ היא נחלת כלל תכנית, מבוססת ג'אווה, עיבוד תמונה שפותחה במכון הלאומי לבריאות (http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html). ImageJ תוכנן עם ארכיטקטורה פתוחה המספקת יכולת רחבה באמצעות תוספי ג'אווה ופקודות מאקרו לצריבה. תוספי רכישה מותאמת אישית, ניתוח ועיבוד ניתן לפתח באמצעות מובנה העורך של ImageJ ומהדר ג'אווה. לספירת הפרש של גרעיני תאים וגרעיני THP1 מזיק באמצעות ImageJ, התמונה נפתחה בImageJ. דלפק התא נמצא באופצית ניתוח בתוסף של התוכנה. התמונה אותחלה ובסוג דלפק תא 1 נבחר לTHP1 גגרעיני ell וסוג דלפק תא 2 נבחרו לגרעינים טפילים (איור 3). ספירת הפרש נעשתה לפחות 200 THP1 גרעין תא ואת amastigotes התאי המצויים בגרעין תא THP1 אלה. השוואה של assay טפיל הצלה ושיטת ניתוח תמונה נעשתה להערכת infectivity של THP1 תאים עם macrophage שונה:. יחסי promastigotes (איור 4) איור 5 מייצג infectivity ההפרש בTHP1 תאים במקרופאג השונה: יחסי promastigote. שתי השיטות הראו תוצאות דומות וmacrophage: היחס של 1:10 promastigote הניב infectivity האופטימלי לשחזור.
ברגע שהתנאים לassay parasite-rescue/transformation וניתוח התמונה הדיגיטלי היו מותאמים, התועלת של מבחנים אלה הוערכה לסריקת תרופות אנטי leishmanial. את THP1 תאי ישמניה הנגועות טופלו בריכוזים שונים של תקןתרופות NTI-leishmanial כלומר Amphotericin B, Pentamidine וMiltefosine למרווחי זמן שונים החל 24-96 שעות. הניסוי לטפיל הציל assay / שינוי שנעשה בשלושה עותקים והניסוי לתאים ישירים שיטת ספירה נעשה בשני עותקים. איור 6 מציג תמונות מיקרוסקופיות של השליטה, השליטה אינה נגועה נדבקה המטופל וישמניה נגועה, טופלה THP1 תאים. עקומות מינון התגובה הוכנו מטפיל הצלה והמהפך assay (ריכוז של התרופה נגד טפילים שינו) וassay ניתוח התמונה (מספר amastigotes/100 THP1 תאים) (איורים 7-9). 50 IC של התרופות חושבו על ידי ExcelFit ומוצגים בטבלת 1. ספירה-Assay הדיגיטלי-Image-ניתוח-ישיר וטפיל-Rescue-טרנספורמציה-Assay הראו תוצאות דומות. ספירה-Assay הדיגיטלי-Image-ניתוח-ישיר היה פחות אופטימלי בנקודתי הזמן המוקדמות של 24 שעות והתרופה t 48reatments, בעוד הטפיל-Rescue-טרנספורמציה-Assay הראה תוצאות עקביות יותר עם הערכים שדווחו בכל נקודתי הזמן במהלך 24-96 השעות לאחר טיפולים תרופתיים. זה הבדל בתוצאות עם----ספירה-Assay תמונה הדיגיטלי ניתוח ישיר וטפיל-Rescue-טרנספורמציה-Assay יכול להיות בגלל הנוכחות של amastigotes הלא קיימא בתקופות המוקדמות של טיפול תרופתי ב- ישירה-ספירת תמונה דיגיטלית-ניתוח -Assay.
איור 1. מבט מיקרוסקופי של ישמניה donovani amastigotes הצלה והפיכה לpromastigotes. - THP1 התאים חסידים נגועים בשושנת יריחו amastigotes; B - נדבק, THP1 תאים נגועים לאחר תמוגה C המבוקר - שינו promastigotes ישמניה donovani מamastigotes חולץ מנגוע THP1 macrophage תאי D - צמיחה ושגשוג של טראןsformed ישמניה donovani promastigotes.
איור 2. אופטימיזציה של תמוגה מבוקרת של תאים נגועים THP1 להשיג הצלה מרבית של amastigotes החיים ישמניה donovani והפיכתם לpromastigotes. ניתוח תמוגה של THP1 תאים והצלה של amastigotes מTHP1 תאים הנגועים בשושנת יריחו עם חומרי ניקוי שונים. שני ריכוזים (0.05% ו -0.1%) של אבקת כביסה ושתי תקופות זמן (30 שניות ו 60 שניות) לטיפול נבדקו. RFU = יחידות קרינה יחסית. כל עמודה מייצגת הממוצע של תצפיות כפולות. [] טיפול NP-40 גרם תמוגה של THP1 תאים והשפיע גם על יכולת הקיום של טפילי amastigote חולצו. [B] טריטון X-100 treatment גרם תמוגה של THP1 תאים והשפיע גם על יכולת הקיום של טפילי amastigote הצילו [ג] Tween 80 גרם תמוגה חלקית של THP1 תאים להציל את amastigotes. [ד] Tween 80 גרם תמוגה חלקית של THP1 תאים להציל את amastigotes. [E ] טיפול SDS גרם תמוגה כמעט מוחלטת של THP1 תאים ולא השפיע על יכולת הקיום של amastigotes חולץ ב0.05% / 30 שניות. [F] טיפול עם 0.05% SDS למשך 20-30 שניות גרמו תמוגה כמעט מוחלטת של THP1 תאים והצילו טפיל קיימא amastigotes להפוך לpromastigotes. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
איור 3. פלורסנט תמונה דיגיטלית של THP1 תא מובחן נגועים במבחנה עם Leishmanidonovani amastigotes. KDNA האופייני אפשר לראות גם עם כל גרעין טפיל. גרעין מקרופאג (Mn) (1) והגרעינים הטפילים (PN) (2) יכולים להיות מסומן באופן דיפרנציאלי ואופן דיפרנציאלי נספרו על ידי תוכנת ניתוח ImageJ להערכה כמותית של הזיהום. הכימות נעשה כמספר amastigotes/100 THP1 התאים.
איור 4. השוואה בין ספירה-Assay דיגיטלי-Image-ניתוח הישיר (פנל תחתון) והטפיל-Rescue-טרנספורמציה-Assay (פנל העליון). Macrophage: היחס של 1:10 promastigote הניב זיהום אופטימלי. הן הראו תוצאות דומות. Assay טפיל ההצלה הראה כמה ערכי רקע. כל מופעי בר אומרים של ערכים כפולים.
איור 5 THP1 תאים נגועים בpromastigotes ישמניה ידי THP1 השונה:. יחס promastigote. תוצאות כמותיים כמספר amastigotes/100 THP1 התאים מוצגות באיור 4.
האיור 6. תמונות דיגיטליות (פלורסנט + דסק"ש) של THP1 תאים נגועים בשושנת יריחו donovani amastigotes לאחר טיפול בתרופות סטנדרטיות נגד leishmanial לתקופות זמן שונות. תוצאות היו לכמת כמספר amastigotes/100 THP1 התאים ומשמשות לחישוב אחוזי הצמיחה בהשוואה לקבוצת ביקורת שלא טופל ולקבוע את ערכי IC 50.
איור 7. השוואה דיגיטלי-Image-ניתוח-ספירה-Assay הישיר וטפיל-Rescue-טרנספורמציה-Assay לסריקת תרופות אנטי leishmanial (Amophotericin B). המקרופאגים הנגועים טופלו בריכוזים שונים של תרופה הסטנדרטית הנוגדת leishmanial לתקופות שונות. IC 50 (מיקרוגרם / מ"ל) ערכים חושבו מעקומת תגובת המינון ידי Excelfit. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
איור 8. השוואה----ספירה-Assay תמונה הדיגיטלי ניתוח הישיר וטפיל-Rescue-טרנספורמציה-Assay עבורסריקת תרופות NTI-leishmanial (Pentamidine). המקרופאגים הנגועים טופלו בריכוזים שונים של תרופה הסטנדרטית הנוגדת leishmanial לתקופות שונות. IC 50 (מיקרוגרם / מ"ל) ערכים חושבו מעקומות מינון התגובה על ידי Excelfit. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
איור 9. השוואה דיגיטלי-Image-ניתוח-ישיר-Assay ספירה וטפילה-Rescue-טרנספורמציה-Assay לסריקת תרופות אנטי leishmanial (Mitefosine). המקרופאגים הנגועים טופלו בריכוזים שונים של תרופה הסטנדרטית הנוגדת leishmanial לתקופות זמן שונות. IC 50 ערכים (מיקרוגרם / מ"ל) חושבו מעקומות מינון התגובה על ידי Excelfit.לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
| תרופות מבחן | 24 שעות | 48 שעות | 72 שעות | 96 שעות | ||||
| IACA ב | PRTA ג | IACA ב | PRTA ג | IACA ב | PRTA ג | IACA ב | PRTA ג | |
| Amphotericin B | 0.24 ± 0.03 | 0.17 ± 0.01 * | 0.12 ± 0.04 | 0.20 ± 0.07 | 0.06 ± 0.01 | 0.06 ± 0.01 | 0.11 ± 0.03 | 0.10 ± 0.03 |
| Pentamidine | > 10 | 2.55 ± 1.16 * | 2.88 & plusmn; 0.58 | 1.43 ± 0.91 | 1.24 ± 0.35 | 1.52 ± 0.16 | 0.71 ± 0.63 | 0.98 ± 0.33 |
| Miltefosine | 0.38 ± 0.02 | 0.19 ± 0.08 * | 0.24 ± 0.06 | 0.30 ± 0.08 | 0.36 ± 0.02 | 0.16 ± 0.06 | 0.21 ± 0.15 | 0.17 ± 0.10 |
טבלת 1. השוואה----ספירה-Assay תמונה הדיגיטלית ניתוח הישיר והטפיל-Rescue-טרנספורמציה-Assay לסריקת תרופות אנטי leishmanial. המקרופאגים הנגועים טופלו בריכוזים שונים של תרופה הסטנדרטית הנוגדת leishmanial לתקופות שונות. IC 50 ערכים (מיקרוגרם / מ"ל) חושבו מעקומות מינון התגובה על ידי Excelfit (תרשימים 7-9) שעות לאחר טיפול תרופתי;. ב IACA = ניתוח תמונה וישירה ספירהAssay; ג PRTA = טפילה-הצלה וAssay טרנספורמציה. הערכים שניתנו הם IC 50 (ריכוז של התרופה גורמת לעיכוב של 50% בצמיחת הטפיל) כמיקרוגרם / מ"ל והם מתכוונים ± SD של לפחות שלושה ניסויים. * בחינה סטטיסטית שונה (<0.05) בהשוואה ל 50 ערכי IC עם IACA.
Discussion
ישנן מספר שיטות זמינות לסריקת תרופות אנטי leishmanial מבוססת על מודלי macrophage-amastigote. מבחנים ניתן לעשות עם מקרופאגים שנאספו מחיות מארחות תאים כלומר הצפק exudate (PEC), תאי דם היקפיים (monocyte PBMC) 6 או עצם מקרופאגים מח נגזרות (BMM) או בשורות תאי monocytic כגון עכבר (J774 וRAW264.7 ) 7 ואנושיים (THP1, U937, HL-60) 8 תאי monocytic. המבחנים, המשתמשים בחלוקת תאי מארח, חייבים לוודא שהתופעות המבלבלות של פעילות תרופה בטפיל והן מספר תאי מארח נחשבות. המקרופאגים העיקריים הבדיל שנאספו ממקורות שונים כגון עכברים וחולדות שאינם מפרידים-בטבע, אבל הכנות התאים האלה לא יכולות להיות אוכלוסיות תאים הומוגניים. שורות תאי Monocytic תאים שמקורם-הן הומוגני בטבע והנם מודל טוב יותר להקרנה macrophage-amastigote המבוססת. מתוך שורות תאים monocytic שונות, diffeTHP1 תאי rentiated (קו אנושי חריף monocytic וקמיה של תאים) יכולים להיוצר monolayer הלא חלוקה, ומציעים חלופה אטרקטיבית למקרופאגים מבודדים ראשוניים.
הקרנת macrophage-amastigote מבוססת ניתן לעשות זאת בכמה דרכים. הערכה מיקרוסקופית קלסית המבוססת על תא וטפיל ישיר לספור 9 היא עבודה אינטנסיבית. העדר האוטומציה מגביל את התועלת של בדיקה זו. ספירת התאים היא זמן רב ועשויה לתת קביעה מדויקת של 50 ערכי IC מאז קביעת כדאיות טפיל באמצעות הליך הכתמה קשה. צבעי ניאון רבים ונוגדנים חד שבטיים יכולים להיות מועסקים למבחני זרימת cytometric 10, 11, אבל המבחנים האלה הם גם מוגבלים בגלל רגישות והגבלה של פחות מרווח הזמן של תרופה לטיפול ליום אחד בלבד. ישנם מספר מבחני גן הכתב זמין לכימות הצמיחה של amastigotes התאי 12,13,14. אוטומטהקרנת אד עשויה להיות אפשרית באמצעות גנים מדווחים, אבל המבחנים הללו יש גם חסרונות מסוימים. ראשית, רוב המבחנים אלה מחייבים בחירת תרופה לשמירה על ביטוי episomal של הגנים המדווחים, שלא יכול להיות אידיאלי לניסוי הקרנת סמים. הדרך שבה גן הכתב הוא הציג יכול גם להשפיע על התכונות הפיזיולוגיות של הטפיל ולהשפיע על ההקרנה. אם גן הכתב הוא חלק מפלסמיד episomal, התפוקה היחסית של כתב יכולה להיות תלויה במספר העותק של פלסמיד transfected (אשר משתנה מתא לתא) ולא בפעילות של התרופה 14. חלק מטפילי הכתב אשר הפכו טפילים לא צריכים ללחץ ברירה כדי לשמור על גן הכתב, אולם יכול להיות שיש השלכות ביולוגיות או על ידי שיבוש הארכיטקטורה הגנטית או רק על ידי הנוכחות של חלבוני הכתב הזר 15. בחלק ממבחנים מבוססי גן כתב, ישסוגיות של פעילות רגישות ורקע 16. והכי חשובים, רבים ממבחני כתב ביטוי הגנים, במיוחד אחד עם GFP כתב gene15, לא יכולים להבדיל בין amastigotes תאי החיים והמתים. מבחנים מבוססים על גן הכתב לוציפראז יכולים להבחין בין חיים והמתים amastigotes התאי, אבל מצע וחיץ תמוגה תא למבחנים אלה הם יקרים להקרנה בקנה מידה גדולה 17. כדי להתגבר על חסרונות ומגבלות של מבחני מיון קודמים macrophage-amastigote מבוסס אלה, פתחו ואופטימיזציה assay טפיל ההצלה והשינוי הזה. בדיקה זו מבוססת על THP1 תאים, אשר יש הומוגניות טובה והם אינם מפרידים-בטבע, כמו תאי מארח.
Assay הטפיל-Rescue-טרנספורמציה-Assay המתואר כאן הוא להשוות את assay המבוסס על ספירת תמונה דיגיטלית-ניתוח ישיר של amastigotes התאי. מיקרוסקופיה פלורסנט ודסק"ש, דיגיטלי ולדמייןניתוחי דואר על ידי ImageJ לספירת הפרש של גרעיני מקרופאג וגרעיני הטפיל שפרו את assay הספירה המיקרוסקופית נוספים. לכידת התמונות תחת מסנני אור ניאון וניגודיות פער התערבות (DIC) מסננים שפרה את איכות התמונה הדיגיטלית לספירה מדויקת יותר של טפילים תוך תאיים. תמונות שניהם ניאון ודסק"ש ניתן התמזגה כדי להשיג את התמונות הדיגיטליות בקווי מתאר ברורים macrophage סלולריים וגרעינים תאיים ניאון. גרעיני מקרופאג וגרעיני הטפיל יכולים להיות מוכרים באופן דיפרנציאלי עם ImageJ. לכן, שניהם---ספירה-Assay תמונה דיגיטלי-ניתוח ישיר וטפיל-Rescue-טרנספורמציה-Assay יש פוטנציאל לאוטומציה ויישום להקרנה בקנה מידה גדולה. השלבים הקריטיים בטפיל-Rescue-טרנספורמציה-Assay הם: (א) כביסות חוזרות ונשנות של THP1 תרביות תאים לאחר חשיפה לpromastigotes ישמניה, כדי להבטיח הסרה מוחלטת כמעט שאינם מתמחהpromastigotes alized ו( ב) תמוגה מבוקרת של התאים הנגועים THP1 עם SDS. שני הצעדים עלולים גם להיות נשלטו עם אוטומציה ולא צריך להתפשר עם תפוקה של assay. השלב השני של כביסות, לאחר חשיפה של ישמניה THP1 התאים הנגועים לבדיקת הסמים / התרכובות מסיר את הטפילים הנותרים אינם מופנמים, אם בכלל. הטפיל-Rescue-טרנספורמציה-Assay מציע יתרונות משמעותיים על פני, גן קיים מיקרוסקופי כתב ומבחני ניתוח תמונה. הבדיקה היא פשוטה, חזקה, ושחזור, יכולה להיות אוטומטית להקרנה בקנה מידה גדולה, ולכן צריך להיות יישום חשוב בהקרנה של ספריות תרכובות גדולות לגילוי סמים אנטי leishmanial חדש. יתר על כן, הבדיקה יכולה להיות מיושמת גם להערכת infectivity של קליני, כמו גם, שבודדה במעבדה של ישמניה במבחנה.
Disclosures
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
Acknowledgments
הסכם NCNPR-USDA-ARS המדעי המספר 58-6408-2-0009; פרס CDMRP מענק # W81XWH-09-2-0093 על ידי הצבא האמריקאי למחקר רפואי ואמצעי פיקוד.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phorbol 12-Myristate 13-Acetate (PMA) | Sigma-Aldrich USA | P1585 | Required for differentiation of THP1 cells. |
| RPMI-1640 Medium | Invitrogen | 23400021 | |
| Lab-TeK Chamber Slide System (16 Chamber) | Thermo Scientific Nunc | 178599 | |
| Clear, Flat-Bottom, 96-Well Plates | BD Falcon | 353075 | Plates to perform 96-well plate assay |
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich USA | A4888 | Standard anti-leishmanial drug dissolve in DMSO (2 mg/ml) |
| Pentamidine Isothionate Salt | Sigma-Aldrich USA | P 0547 | Standard anti-leishmanial drug dissolve in DMSO (2 mg/ml) |
| Miltefosine | EMD Biosciences USA | 475841 | Standard anti-leishmanial drug dissolve in serum-free RPMI-1640 medium (prepare fresh) (2 mg/ml) |
| Sodium Stibogluconate | EMD Biosciences USA | 567565 | Standard anti-leishmanial drug prepare in RPMI-1640 with 4% FBS. (1 mg/ml) |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma-Aldrich USA | L 5750 | |
| Fluorescence Microscope | NIKON | ECLIPSE 90i | |
| Fluorescence Microplate Reader | BMG | Polar Star Galaxy | |
| Mounting Medium | Sigma-Aldrich USA | M 1289 | |
| alamarBlue | AbD Serotec | BUF012 B | |
| SYBR Green I | Sigma-Aldrich USA | S 9430 | |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Sci. | 523500 | |
| Sodium Pyruvate | Sigma-Aldrich USA | P2256 | |
| 2-Mercapt–thanol | Sigma-Aldrich USA | M6250 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11050H | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich USA | P9416 | |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich USA | P6474 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich USA | T8787 | |
| NP-40 | Calbiochem | 492016 |
References
- WHO. Control of the leishmaniasis: report of a meeting of the WHO Expert Committee on the Control of Leishmaniasis. Xii, Geneva. 22-26 (2010).
- Croft, S. L., Seifert, K., Yardley, V. Current scenario of drug development for leishmaniasis. Indian J. Med. Res. 123 (3), 399-410 (2006).
- Croft, S. L., Sundar, S., Fairlamb, A. H.
- Mikus, J., Steverding, D. A simple colorimetric method to screen drug cytotoxicity against Leishmania using the dye AlamarBlue. Parasitology International. 48 (3), 265-269 (2000).
- Callahan, H. L., Portal, A. C., Devereaux, R., Grogl, M. An Axenic Amastigote System for Drug Screening. Antimicrob. Agents Chemother. 41 (4), 818-822 (1997).
- Seifert, K., Escobar, P., Croft, S. L. In vitro activity of anti-leishmanial drugs against Leishmania donovani is host cell dependent. J. Antimicrob. Chemother. 65 (3), 508-511 (2010).
- Kolodziej, H., Kiderlen, A. F. Antileishmanial activity and immune modulatory effects of tannins and related compounds on Leishmania parasitized RAW 264.7 cells. Phytochemistry. 66 (17), 2056-2071 (2005).
- Maia, C., et al. Infectivity of five different types of macrophages by Leishmania infantum. Acta Tropica. 103 (2), 150-155 (2007).
- Neal, R. A., Croft, S. L. An in vitro system for determining the activity of compounds against the intracellular amastigote form of Leishmania donovani. J. Antimicrob. Chemother. 14, 463-475 (1984).
- Abdullah, S. M., Flath, B., Presber, H. W. Comparison of different staining procedures for the flow cytometric analysis of U-937 cells infected with different Leishmania-species. J. Microbiol Methods. 37 (2), 123-138 (1999).
- Giorgio, C. D., et al. Flow Cytometric Detection of Leishmania Parasites in Human Monocyte-Derived Macrophages: Application to Antileishmanial-Drug Testing. Antimicrob Agents Chemother. 44 (11), 3074-3078 (2000).
- Mandal, S., et al. High throughput screening of Leishmania donovani clinical isolates against drug using a colorimetric β Lactamase assay. Indian J. Exp. Biol. 47 (6), 475-479 (2009).
- Chan, M. M. Y., Bulinski, J. C., Chang, K. P., Fong, D. A. Microplate assay for Leishmania amazonensis promastigotes expressing multimeric green fluorescent protein. Parasitol. Res. 89 (4), 266-271 (2003).
- Buckner, F. S., Wilson, A. J. Colorimetric assay for screening compounds against Leishmania Amastigote Grown in macrophages. Am. J. Trop. Med. 72 (5), 600-605 (2005).
- Sereno, D., et al. Advances and perspectives in Leishmania cell based drug-screening procedures. Parasitol. Int. 56 (1), 3-7 (2007).
- Gupta, S., Nishi, Visceral leishmaniasis: experimental models for drug discovery. Indian J. Med. Res. 133, 27-39 (2011).
- Roy, G., et al. Episomal and stable expression of the luciferase reporter gene for quantifying Leishmania spp. Infections in macrophages and in animal models. Mol. Biochem. Parasitol. 110 (2), 195-206 (2000).
