利用超声波血脑屏障破坏结合锰增强磁共振成像进行功能性神经影像学研究

摘要

本文描述了一种利用微泡和超声在小鼠中广泛开放血脑屏障的技术。通过该技术，可将锰递送至小鼠脑内。由于锰是一种可在去极化神经元中蓄积的磁共振成像（MRI）对比剂，该方法可实现对神经元活动的成像。

摘要

尽管小鼠是研究神经科学遗传和分子基础的主要模型系统，但在小鼠中进行功能性神经成像仍面临技术上的挑战。其中一种方法——激活诱导的锰增强磁共振成像（Activation-Induced Manganese-enhanced MRI, AIM MRI）已成功用于绘制啮齿类动物的神经元活动^1-5。在AIM MRI中，Mn²⁺作为钙的类似物，在去极化的神经元中积累^6,7。由于Mn²⁺可缩短组织的T₁弛豫时间，因此神经元活动增强的区域在磁共振成像中会表现出信号增强。此外，Mn²⁺从激活区域清除较慢，因此可在成像前于磁体外进行刺激，从而提高实验的灵活性。然而，由于Mn²⁺难以穿过血脑屏障（BBB），必须打开血脑屏障的操作限制了AIM MRI的应用，尤其是在小鼠中的使用。

开放血脑屏障（BBB）的一种工具是超声。尽管超声可能具有损伤性，但如果将其与充满气体的微泡（即超声造影剂）联合使用，则打开BBB所需的声压显著降低。这种超声与微泡的组合可被用于可靠地开放血脑屏障，同时不引起组织损伤^8-11。

本文介绍了一种利用微泡和超声波开放血脑屏障（BBB）来实施活体脑功能磁共振成像（AIM MRI）的方法。在静脉注射全氟丁烷微泡后，对剃毛的小鼠头部施加非聚焦脉冲超声束，持续3分钟。为简便起见，我们将这种利用微泡和超声开放血脑屏障的技术简称为BOMUS¹²。通过BOMUS技术开放双侧大脑半球的血脑屏障后，使锰离子进入全脑。在对轻度镇静的小鼠进行实验刺激后，采用AIM MRI来绘制神经元反应图谱。

为了验证该方法，本文采用BOMUS和AIM MRI技术，在轻度镇静的小鼠中绘制单侧胡须机械刺激的脑激活图谱¹³。由于BOMUS可使双侧半球的血脑屏障均开放，因此未受刺激的大脑半侧可用于控制非特异性背景刺激的影响。所得的三维激活图谱与已发表的桶状皮层胡须区分布图高度一致¹⁴。超声开放血脑屏障具有快速、无创和可逆的特点，因此该方法适用于清醒小鼠的高通量和/或纵向研究。

方案

1. 组装并校准超声系统

1. 超声系统采用一个单元素超声换能器，其直径足以覆盖小鼠脑部，中心频率在2 MHz范围内。该换能器由一个50 dB功率放大器驱动，放大器连接至信号发生器，由后者产生超声脉冲序列。
2. 为校准超声系统的声压，使用水听器将施加的电压与产生的声压相关联。将换能器置于水箱中，并位于水听器正上方。向换能器施加一个简单脉冲（例如，以换能器频率产生的10周期正弦波，脉冲重复频率为10 Hz）。利用三轴平移台寻找峰值响应，该峰值应位于超声波束中心、换能器自然焦距处（对于本实验所用直径为13 mm、频率为2.15 MHz的换能器，焦距约为60 mm）。
3. 在输入电压范围（例如 50–400 mV）内进行多次测量_pp）以验证系统的线性度。采用简单的线性回归方法估算输入电压与声压之间的关系。在本系统中，输入电压分别为 258 和 167 mV_pp 对应于峰值负声压为0.52和0.36 MPa。
4. 将信号发生器设置为产生超声脉冲序列，该序列为在换能器频率下的正弦脉冲串，每串包含50000个周期，脉冲串周期为64 ms。根据校准测量结果，调节脉冲幅度，使换能器自然焦点中心处的峰值负声压达到0.36 MPa。

2. 准备试剂

1. 将四水合氯化锰（MnCl₂·4H₂O）溶于无菌水中，配制成....

讨论

本文介绍了一种利用超声波和微泡非侵入性开放小鼠全脑血脑屏障（BOMUS）的方法。在血脑屏障开放后，给予 Mn²⁺，并采用激活诱导的锰增强磁共振成像（AIM MRI）对轻度镇静小鼠在短时间刺激下的神经元反应进行成像。

通过0.36 MPa的负峰值声压实现了充分的血脑屏障开放。需注意，此压力值是指超声束中心在头皮表面处的压力。单阵元换能器声束剖面的测量结果表明，声束边缘处的声压仅为约0.12 MPa。随后，声波经颅骨衰减，预计到达脑组织的压力降低约25%（根据Choi et al. ²³ 的方法进行降额校正，并针对频率进行了调整）。这表明，血脑屏障的开放发生在0.09 MPa（位于声束中心）至0.03 MPa（位于声束边缘）的负峰值声压范围内。这些压力值低于文献中报道的其他研究通常采用的压力水平（通常为0.4至0.5 MPa）²⁴。这种较低的压力阈值可能是由于本研究中使用的脂质微泡剂量较高（约1.2 mL/kg）所致。尽管所用微泡剂量高于推荐的人体诊断剂量（10 μL/kg），但未观察到不良效应。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
水听器	Sonora Medical Systems, Longmont, CA	SN S4-251
平移台	Newport Corporation, Irvine, CA
超声换能器	Olympus NDT, Inc., Waltham MA	A306S-SU	查阅随换能器提供的制造商测试表，以确定该特定换能器的确切中心频率，该频率可能与目录中列出的标称频率不同。（例如，我们所用换能器的标称频率为 2.25 MHz，但实际中心频率为 2.15 MHz。）
Vevo 成像系统	VisualSonics, Inc. Toronto, Canada
50 dB 功率放大器	E&I, Rochester, NY	model 240L
信号发生器	Agilent Technologies, Santa Clara, CA	model 33220A
MnCl2-(H2O)4	Sigma		分子量因批次而异，需联系制造商获取精确数值
全氟丁烷脂质微球	Lantheus Medical Imaging, N. Billerica, MA	DEFINITY
微球振荡器	Lantheus Medical Imaging, N. Billerica, MA	VIALMIX
MR 成像线圈	m2m Imaging Corp., Hillcrest, OH		直径 35 mm 的四通道发射/接收容积线圈
MRI 系统	GE Healthcare, Milwaukee, WI		配备 7-T 水平孔径磁体的 GE EXCITE 控制台
图像分析环境	Visage Imaging, San Diego, CA, MathWorks, Natick MA	Amira MATLAB