Het in kaart brengen Bacteriële Functionele Netwerken en Wegen in Escherichia Coli Gebruik van synthetische Genetische Arrays

Summary

Systematische, grootschalige synthetische genetische (gen-gen of epistase) interactie schermen kunnen worden gebruikt om genetische redundantie en route overspraak verkennen. Hier hebben we een high-throughput kwantitatieve synthetische genetische scala screening technologie te beschrijven, genoemd eSGA door ons ontwikkelde voor het ophelderen van epistatisch relaties en het verkennen van genetische interactie netwerken in Escherichia coli.

Abstract

Fenotypen bepaald door een complexe reeks fysieke (bv. eiwit-eiwit) en functionele (bijv. gen-gen of genetische) interacties (GI) ^1. Terwijl fysieke interacties kunnen aangeven welke bacteriële eiwitten worden geassocieerd als complexen, doen ze niet per se onthullen pad-level functionele relationships1. GI schermen, waarbij de groei van dubbele mutanten voorzien van twee genen verwijderd of geïnactiveerd wordt gemeten en vergeleken met de overeenkomstige enkelvoudige mutanten kunnen verlichten epistatisch afhankelijkheden tussen loci en dus een middel op te vragen en te ontdekken nieuwe functionele relaties ^2. Grootschalige GI maps gemeld voor eukaryote organismen zoals gisten ^3-7, maar GI informatie blijft dun voor prokaryoten ^8, dat de functionele annotatie van bacteriële genomen belemmert. Hiertoe hebben wij en anderen ontwikkeld high-throughput kwantitatieve bacteriële GI screeningsmethoden ^{9, 10} Hier presenteren we de belangrijkste stappen die nodig zijn om kwantitatieve E. uit te voeren coli Genetic Synthetic Array (eSGA) screening procedure op genoom-schaal ^9, met natuurlijke bacteriële conjugatie en homologe recombinatie systemisch genereren en de geschiktheid van grote aantallen dubbele mutanten in een array formaat kolonie te meten. kort wordt een robot gebruikt voor het doorschakelen , door middel van conjugatie, chlooramfenicol (Cm) - gemarkeerde mutante allelen van engineering HFR (hoge frequentie van recombinatie) "donor stammen 'in een geordende reeks van kanamycine (Kan) - gemarkeerde F-ontvanger stammen. Typische toepassingsgebieden loss-of-function enkele mutanten richting niet-essentieel gen deleties (bijvoorbeeld de 'Keio' collectie ¹¹⁾ en essentiële gen hypomorphic mutaties (bijvoorbeeld allelen verleent verminderde eiwitexpressie stabiliteit of activiteit ^{9, 12, 13)} te bevragen de functionele verenigingen van niet-essentiële en essentiële genen, respectively. Na conjugatie en daaropvolgende genetische uitwisseling gemedieerd door homologe recombinatie worden de resulterende dubbele mutanten geselecteerd op vast medium dat beide antibiotica. Na uitgroei worden de platen digitaal belicht en kolonie maten kwantitatief gescoord op een eigen geautomatiseerde beeldverwerkingsysteem ^14. GI's worden onthuld wanneer de groeisnelheid van een dubbele mutant is ofwel significant beter of slechter dan verwachte ^9. Verzwarende (of negatieve) GA vaak resulteren tussen loss-of-function mutaties in genen paren van compenserende pathways die van invloed zijn op dezelfde essentiële proces ^2. Hier wordt het verlies van een gen gebufferd, zodat zowel enkelvoudige mutant levensvatbaar is. Het verlies van beide routes schadelijk is en resulteert in synthetische letaliteit of ziekte (langzame groei). Omgekeerd kunnen verlichten (of positief) interacties optreden tussen genen in dezelfde route of eiwit complex ² alsdeletie van beide genen alleen is vaak voldoende om de normale functie van de signalisatieweg of complex zodanig dat aanvullende verstoringen niet activiteit te verminderen, waardoor groei verder verstoren. Overall kan systematisch identificeren en analyseren GI netwerken onpartijdige, wereldkaarten van de functionele samenhang tussen grote aantallen genen, waarvan pathway belangrijke informatie gemist andere benaderingen kunnen worden afgeleid ^9.

Protocol

1. De bouw van Hfr Cavalli Donor mutante stammen door Recombineering ^{15, 16}

De stappen voor het construeren van de donor eSGA vlekken worden hieronder beschreven. Kortom, we gebruiken gerichte λ - Rood gemedieerde homologe recombinatie ¹⁶ van geamplificeerd selecteerbare DNA-merker cassette fragmenten gegenereerd door PCR om niet-essentiële genen deletiemutanten (punt 1.1) of essentieel gen hypomorphic mutante donor stammen (paragraaf 1.2), die vervolgens worden gebruikt als te creëren 'vragen' om GI-netwerken te definiëren.

Opmerking: Tijdens h....

Results

GIs reveal functional relationships between genes. Similarly, since genes in the same pathway display similar GI patterns and the GI profile similarity represents the congruency of phenotypes, we can group functionally related genes into pathways by clustering their GI profiles. Integrating GI and GI correlation networks with physical interaction information or other association data, such as genomic context (GC) relationships can also reveal the organization of higher-order functional modules that define core bio.......

Discussion

We hebben geschetst een stapsgewijze protocol voor het gebruik van robotica eSGA screening voor bacteriële gen functies te onderzoeken op een pad niveau door ondervragen GI. Deze benadering kan worden gebruikt om individuele genen alsmede gehele biologische systemen te bestuderen in E. coli. Voorzichtig uitvoeren van de experimentele hierboven beschreven stappen, inclusief alle passende controles en grondig analyseren en onafhankelijk valideren van de gegevens GI belangrijke aspecten voor het succes van eSGA he.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
I. Antibiotics
Chloramphenicol	Bioshop	#CLR201
Kanamycin		#KAN201
Ampicillin		# AMP201
2. Luria-Bertani medium
LB powder	Bioshop	#LBL405
Agar	Bioshop	#AGR003
3. Bacterial Strains and Plasmids
Hfr Cavalli strain λred system (JL238)	Babu et al.14.
pKD3	E. coli Genetic Stock Centre, Yale
Keio E. coli F- recipient collection	National BioResource Project (NBRP) of Japan11
Hypomorphic E. coli F- SPA-tag strains	Open biosystems; Babu et al.14
4. Primers
pKD3-based desalted constant primers			F1: 5'-GGCTGACATGGGAATTAGC-3' R1: 5'-AGATTGCAGCATTACACGTCTT-3'
Desalted custom primers			Cm-R: 5'-TTATACGCAAGGCGACAAGG-3' Cm-F: 5'- GATCTTCCGTCACAGGTAGG-3'
Desalted custom primers			F2 and R2: 20 nt constant regions based on pKD3 sequence and 45 nt custom homology regions F2 constant region: 5'-CATATGAATATCCTCCTTA-3' R2 constant region: 5'-TGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3'S1 and S2: 27 nt constant regions for priming the amplification of the SPA-Cm cassette and 45 nt custom homology regions S1 constant region: 5'AGCTGGAGGATCCATGGAAAAGAGAAG -3' S2 constant region: 5'- GGCCCCATATGAATATCCTCCTTAGTT -3' KOCO-F and KOCO-C: 20 nt primers 200 bp away from the non-essential gene deletion site or the essential gene SPA-tag insertion site
5. PCR and Electrophoresis Reagents
Taq DNA polymerase	Fermentas	# EP0281
10X PCR buffer	Fermentas	# EP0281
10 mM dNTPs	Fermentas	# EP0281
25 mM MgCl2	Fermentas	# EP0281
Agarose	Bioshop	# AGA002
Loading dye	NEB	#B7021S
Ethidium bromide	Bioshop	# ETB444
10X TBE buffer	Bioshop	# ETB444.10
Tris Base	Bioshop	# TRS001
Boric acid	Sigma	# T1503-1KG
0.5 M EDTA (pH 8.0)	Sigma	# B6768-500G
DNA ladder	NEB	#N3232L
6. DNA isolation and Clean-up Kits
Genomic DNA isolation and purification kit	Promega	#A1120
Plasmid Midi kit	Qiagen	# 12143
QIAquick PCR purification kit	Qiagen	#28104
7. Equipment for PCR, Transformation and Replica-pinning
Thermal cycler	BioRad, iCycler
Agarose gel electrophoresis	BioRad
Electroporator	Bio-Rad GenePulser II
0.2 cm electroporation cuvette	Bio-Rad
42 °C water bath shaker	Innova 3100
Beckman Coulter TJ-25 centrifuge	Beckman Coulter
32 °C shaker	New Brunswick Scientific, USA
32 °C plate incubator	Fisher Scientific
RoToR-HDA benchtop robot	Singer Instruments
96, 384 and 1,536 pin density pads	Singer Instruments
96 or 384 long pins	Singer Instruments
8. Imaging Equipments
Camera stand	Kaiser
Digital camera, 10 megapixel	Any Vendor
Light boxes, Testrite 16" x 24" units	Testrite
9. Pads or Plates Recycling
10% bleach	Any Vendor
70% ethanol	Any Vendor
Sterile distilled water	Any Vendor
Flow hood	Any Vendor
Ultraviolet lamp	Any Vendor
10. Labware
50 ml polypropylene tubes	Any Vendor
1.5 ml micro-centrifuge tubes	Any Vendor
250 ml conical flaks	VWR	# 29140-045
15 ml sterile culture tubes	Thermo Scientific	# 366052
Cryogenic vials	VWR	# 479-3221
Rectangular Plates	Singer Instruments
96-well and 384-well microtitre plates	Singer Instruments	Nunc
Plate roller for sealing multi-well	Sigma	#R1275
plates	ABgene	# AB-0580
Adhesive plate seals	Fisher Scientific	# 13-990-14
-80 °C freezer	Any Vendor