Summary
B7-H1（PD-L1）和PD-1的结合提供了重要的肿瘤引起的免疫抑制肿瘤的微环境中的信号。免疫组织化学技术的特点B7-H1在胰腺癌组织中的表达和定位的描述。
Abstract
B7-H1/PD-L1，免疫调节的细胞表面蛋白的B7家族的成员，在负调控的细胞介导的免疫反应中起着重要的作用通过其与其受体的相互作用，程序性死亡-1（PD -1）1,2。已注意到在一个数量的人类癌症，包括黑色素瘤，胶质母细胞瘤，肺癌，乳腺癌，结肠癌，卵巢癌，肾细胞癌B7-H1由肿瘤细胞中的过表达，并已被证明是损害抗肿瘤T细胞免疫3-8。
近日，B7-H1表达的胰腺癌组织已被确定为一个潜在的预后标志物9,10。此外，封锁的B7-H1在胰腺癌的小鼠模型中已被证明产生的抗肿瘤反应11。这些数据表明，B7-H1的重要性，作为一个潜在的治疗靶。因此，抗-B7-H1阻断抗体在临床试验中被测试MULtiple人类固体肿瘤，包括恶性黑色素瘤及癌症的肺，大肠，肾，胃和胰腺12。
为了最终能够确定患者将受益于B7-H1靶向疗法，重要的是调查的表达和定位的B7-H1和B7-H1阻断抗体治疗病人的反应之间的相关性。检查通过免疫组化的人类胰腺癌组织中B7-H1的表达，将能够更好地了解如何共同抑制信号分子有助于抑制肿瘤的微环境中的抗肿瘤免疫。抗B7-H1的单克隆抗体（克隆5H1）由Chen和他的同事开发已被证明在冷冻切片的多种类型的人类肿瘤组织4,8产生可靠的染色结果，但染色石蜡包埋的幻灯片已经是一个挑战，直到最近13-18。我们必须开发私奔的B7-H1染色协议，石蜡包埋胰腺癌组织中的幻灯片。这里描述的B7-H1染色协议产生一致的膜和胞质染色B7-H1的一些背景知识。
Protocol
B7-H1/PD-L1，免疫调节的细胞表面蛋白的B7家族的成员，在负调控的细胞介导的免疫反应中起着重要的作用通过其与其受体的相互作用，程序性死亡-1（PD -1）1,2。已注意到在一个数量的人类癌症，包括黑色素瘤，胶质母细胞瘤，肺癌，乳腺癌，结肠癌，卵巢癌，肾细胞癌B7-H1由肿瘤细胞中的过表达，并已被证明是损害抗肿瘤T细胞免疫3-8。
近日，B7-H1表达的胰腺癌组织已被确定为一个潜在的预后标志物9,10。此外，封锁的B7-H1在胰腺癌的小鼠模型中已被证明产生的抗肿瘤反应11。这些数据表明，B7-H1的重要性，作为一个潜在的治疗靶。因此，在临床试验中被测试多种人体抗-B7-H1阻断抗体实体肿瘤，包括恶性黑色素瘤及癌症的肺，大肠，肾，胃和胰腺12。
为了最终能够确定患者将受益于B7-H1靶向疗法，重要的是调查的表达和定位的B7-H1和B7-H1阻断抗体治疗病人的反应之间的相关性。检查通过免疫组化的人类胰腺癌组织中B7-H1的表达，将能够更好地了解如何共同抑制信号分子有助于抑制肿瘤的微环境中的抗肿瘤免疫。抗B7-H1的单克隆抗体（克隆5H1）由Chen和他的同事开发已被证明在冷冻切片的多种类型的人类肿瘤组织4,8产生可靠的染色结果，但染色石蜡包埋的幻灯片已经是一个挑战，直到最近13-18。我们已经开发了B7-H1 staini的纳克协议石蜡包埋胰腺癌组织中的幻灯片。这里描述的B7-H1染色协议产生一致的膜和胞质染色B7-H1的一些背景知识。
1。去parafinization
- 烘烤20分钟，在55℃下滑动。
- 以一种化学遮光罩，浸泡在二甲苯中滑动10分钟。
- 新鲜的二甲苯10分钟浸入滑动。
- 浸没在100％乙醇中滑动5分钟。
- 在新鲜的5分钟的100％乙醇中的浸入滑动。
- 浸在95％乙醇中滑动5分钟。
- 浸在80％乙醇中滑动5分钟。
- 浸没在去离子水中滑动5分钟。
2。抗原修复
- 浸入滑动的Tris-EDTA缓冲液（pH9.0）中和在高压锅热至125℃，持续30秒，然后在90℃下持续10秒。
- 让幻灯片冷却60分钟。
- TBST 5分钟的浸泡幻灯片; REPE的两倍。
3。染色法
- 擦去周围组织幻灯片上的解决方案。标记一圈的组织与疏水性笔。
- 放置在湿度室中滑动，并避免在整个染色过程中的组织上的滑动的干燥。将一滴（约200μl或多个完全覆盖组织区域）的过氧化物酶块内的疏水圈上滑动并孵育过氧化物酶滑动块5分钟。
- 用TBST冲洗幻灯片，然后在TBST 5分钟。
- 将一滴的BLOCK ACE阻断缓冲每张幻灯片上孵育15分钟。
- 用TBST冲洗幻灯片，然后在TBST 5分钟。
- 将一滴每张幻灯片上的抗生物素蛋白溶液孵育15分钟。
- 用TBST冲洗幻灯片，然后在TBST 5分钟。
- 将一滴每张幻灯片上的生物素溶液孵育15分钟。
- 冲洗SLIDES，然后用TBST TBST 5分钟。
- 孵育1:1,000稀释的小鼠抗-B7-H1单克隆抗体（克隆5H1）或小鼠IgG1滑动κ型控制在200μlTBST中在4℃下22小时+ / - 1小时过夜。 TBST最后的抗体浓度为2.57微克/毫升。
- 用TBST冲洗幻灯片，然后在TBST 5分钟。重复两次。
- 孵育幻灯片与生物素共轭大鼠抗小鼠IgG1二次抗体在1:500浓度（在200μl2％山羊血清溶液）30分钟。
- 用TBST冲洗幻灯片，然后在TBST 5分钟。重复两次。
- 将一滴链霉亲和素生物素复合物（每张幻灯片上孵育15分钟，必须准备至少前30分钟使用）。
- 用TBST冲洗幻灯片，然后在TBST 5分钟。重复两次。
- 将一滴扩增试剂（2:1，TBST稀释），每张幻灯片上孵育4分钟。
- 冲洗幻灯片与TBST，然后TBST 5分钟。重复两次。
- 将一滴每张幻灯片上的链霉亲和素-HRP孵育15分钟。
- 用TBST冲洗幻灯片，然后在TBST 5分钟。重复两次。
- 将1滴3,3 - 二氨基联苯胺（DAB）的基板和色原体在每个幻灯片和发展的颜色，持续2分钟。
- 后，立即发色，洗幻灯片DDH 2 O为1-2分钟。
- 孵育90秒与一滴苏木滑动。
- DDH 2 O清洗1-2分钟。
- 用肥皂水自来水冲洗1-2分钟。
- DDH 2 O清洗1-2分钟。
4。脱水和安装
- 沉浸在80％乙醇3分钟的幻灯片。
- 浸泡在95％乙醇3分钟的幻灯片。
- 沉浸在100％乙醇5分钟的幻灯片。重复以上步骤。
- 沉浸在二甲苯中5分钟的幻灯片。重复以上步骤。
- 加入一滴Cytoseal 60幻灯片和盖玻片。
表1列出了在上述的程序中使用的试剂。
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Representative Results
一个成功的免疫组化染色B7-H1在胰腺癌会表现出异质性表达B7-H1（茶色的信号DAB显色）。有些胰腺癌细胞有主要是膜表达B7-H1（ 图1A），而另一些具有要么主要细胞质表达B7-H1或很少表达B7-H1（ 图2和图3）。一般的胰管上皮表达一点B7-H1（ 图4）。抗B7-H1的抗体与小鼠IgG1κ型对照抗体染色，而不是示出小的背景染色（ 图1B）。
图1。 A.免疫组化染色克隆5H1抗体与抗-B7-H1，在某些胰腺癌细胞的细胞膜表达。免疫组织同型对照IgG1 hemical染色显示小DAB显色在同一胰腺癌组织的发展。
图2。B7-H1表达的胰腺癌细胞的细胞质中。
图3。一些小胰腺癌细胞表达B7-H1。
图4。正常胰腺导管上皮细胞的B7-H1表达。
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Discussion
B7-H1对冷冻切片的免疫组织化学染色，已报道在以前的研究中，用于各种癌症的3,4。然而，临床肿瘤样本通常只适用于石蜡包埋块的形式。 5H1单克隆抗体已被成功地应用到染色的石蜡包埋的肿瘤组织，包括肾细胞癌，宫颈癌，膀胱癌，黑色素瘤13-18。 B7-H1染色石蜡包埋9,19或低温恒温器20内的与其他单克隆抗体的胰腺癌组织上也有报道。这里，我们已经示出成功染色石蜡包埋的胰腺癌组织，B7-H1与5H1单克隆抗体。 B7-H1在胰腺癌组织中的表达是异构的，类似的，在许多其他类型的恶性肿瘤如恶性黑色素瘤4,21。 B7-H1表达的AR膜和细胞质ë观察与腺癌细胞（ 图1和图2）。膜B7-H1表达其生物学功能是一致的。细胞质中B7-H1在肿瘤组织中的作用还有待探索。正常胰腺导管上皮细胞或腺泡细胞不表达B7-H1（ 图4）。
在该协议中的所有以下步骤在室温下发生，除了为在4℃下孵育过夜B7-H1染色过程中所使用的抗原修复条件没有报道在上述出版物9,19。扩增步骤，也没有采用这些研究。我们发现，在该协议中的关键步骤包括抗原修复，与第一抗体孵育过夜，扩增，和DAB显色的发展。稀释的初级抗体可能需要稍微滴定，对于每个不同的一批5H1。完全扩增一直保持在4分钟稀释扩增试剂。这些修改提供了足够的放大积极的信号，在不增加背景。的开发时间一般为2分，但在显微镜下观察，以确保最佳染色，最小的背景，我们经常留意事态发展。随着每一轮的染色，我们从上一个批次，包括一张幻灯片一张幻灯片的扁桃体组织作为阳性对照。副皮质染色B7-H1在扁桃体先前已经4。如果背景或时间超过5分钟，以发展为典型的信号在这些控制幻灯片，我们建议更换试剂的关键步骤，并检查所有的染色步骤。
使用这种染色技术可以定性和半定量分析肿瘤胰腺癌细胞的B7-H1表达和定位。随着变形例的主要抗体稀释，长度和稀释的amplificati步骤，和彩色显影的时间，该协议可以被应用于其他类型的组织。我们已经修改了这个协议，并用它为乳房癌和肉瘤组织。作为B7-H1和其绑定到PD-1提供一个主要肿瘤诱导的免疫抑制信号在肿瘤的微环境中，此染色技术将促进肿瘤的微环境在肿瘤起始，进展和抗肿瘤免疫反应的作用的理解。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
EB，九巴，和HX的贡献相同。这项研究是由国家癌症研究所SPORE在胃肠道癌症P50 CA062924，NIH K23 CA148964，勒斯特加滕基金会，Viragh基金会，美国临床肿瘤学会青年研究者奖，美国国立卫生研究院5T32 CA0090701-28培训津贴，溶胶高盛胰腺癌中心，国立胰腺基金会的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CSA System | Dako | K1500 | Includes the following reagents mentioned in the protocol: peroxidase block, streptavidin-biotin complex, amplification reagent, streptavidin-HRP, and DAB substrate and chromogen |
| Avidin/Biotin Blocking Kit | Vector | SP-2001 | |
| Block ACE | Serotec | BUF029 | |
| Biotin anti-mouse IgG1 | BD | 553441 | |
| Mouse IgG1 K Isotype Control | eBioscience | 14-4714-85 | |
| TBS(Tris-buffered saline), 10X | Cellgro | 46-012-CM | 10xTBS contains 80 g/L NaCl and 24.2 g/L Tirs; Diluted to 1X with ddH2O for washes; |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | 1 ml added to 1 L of 1X TBS to make TBST |
| Target Retrieval, 20x | Celerus Wave | 014-3000-000 | Diluted to 1x with ddH2O |
| 190 Proof Ethyl Alcohol | Pharmco-Aaper | 111000190 | |
| 200 Proof Ethyl Alcohol | Pharmo-Aaper | 111000200 | |
| Xylene | VWR | 95057-827 | |
| Hematoxylin | Richard-Allan Scientific | 72804 | |
| Cytoseal 60 | Richard-Allan Scientific | 8310-4 | |
| Coverslips | Corning | 2940-245 | |
| Humidity chamber | Sigma | H6644 | |
| Table 1. Reagents and equipment. | |||
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