Method Article

에서 복제와 베타 세포 기능을 평가 Adenovirally-transduced 절연 쥐 Islets

DOI:

10.3791/4080

⸱

June 25th, 2012

 ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, Indiana University School of Medicine, 2Department of Cellular & Integrative Physiology, Indiana University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 하나가 당뇨병 치료를위한 잠재적인 치료 표적을 찾기 위해 기능성 베타 세포 질량을 조절 요소를 식별할 수 있습니다. 프로토콜은 adenoviruses과 유전자 발현의 조작에 따라 분리된 쥐의 islets에 섬 복제 및 베타 세포 기능을 평가하기위한 간소화된 방법으로 구성되어 있습니다.

Abstract

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포도당 항상성은 주로 각각 췌장 베타와 알파 세포에서 분비 내분비 호르몬의 인슐린과 글루카곤에 의해 제어됩니다. 기능성 베타 세포 질량은 해부학 베타 세포 질량뿐만 아니라 영양 하중에 대응하는 베타 세포의 능력에 의해 결정됩니다. 기능적인 베타 세포 대량의 손실은 당뇨병 1-3의 두 주요 형태의 핵심이다. 제 1 형 당뇨병의 면역 공격의 감소 기능성 베타 세포 질량 결과 반해, 제 2 형 당뇨병에이 감소가 적절하게 인슐린을 분비하는 베타 세포의 무능력과 메커니즘의 간부로부터 베타 세포의 파괴 양쪽에서 개발하고 있습니다. 따라서 기능적인 베타 세포 질량을 복원하기위한 노력은보다 나은 치료 및 당뇨병에 대한 잠재적인 치료에 답해야합니다.

노력은 복제를 자극하고 베타 세포의 기능을 향상시키기 위해 악용될 수있는 분자 경로를 식별하는 진행되고 있습니다.이상적인 치료 목표는 베타 세포의 성장과 기능을 모두 향상시킬 것입니다. 하지만 아마도 더 중요한 베타 세포 성장을 자극 전략은 혼란 베타 세포 기능 (예 : 일부 oncogenes과 등)와 그 반대의 비용으로 오는지를 파악하는 것입니다.

고립된 쥐 islets에서 대상 유전자의 체계적 억제하거나 overexpressing 표현함으로써, 하나는 증가 기능성 베타 세포 대량 4-6에 대한 잠재적인 치료 표적을 식별할 수 있습니다. Adenoviral 벡터는 고립된 쥐 islets 4,7-15의 효율적 overexpress 또는 최저의 단백질로 근무하실 수 있습니다. 여기서는 adenoviral 형질 도입을 이용한 유전자 발현을 조작하고 고립된 쥐 islets (그림 1)의 섬 복제 및 베타 세포 기능을 평가하기위한 방법을 제시한다. 이 메소드는 베타 세포 복제 또는 기능 5,6,8,9,16,17 보죠 소설 대상을 식별하기 위해 이전에 사용되었습니다.

Protocol

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1. 쥐 Islets의 Adenoviral 형질 도입 및 Culturing

  1. 의 필요한 번호 미디어 2 ML (8 MM 포도당 10 % 태아 소 혈청, 50 단위 / ML 페니실린, 50 μg / ML의 스트렙토 마이신을 포함하는 RPMI 1640 미디어)를 추가하여 6 개 잘 아닌 조직 문화 코팅 플레이트를 준비 웰스. 노 바이러스 제어를위한 한 대씩, 바이러스 컨트롤 (예 : GFP-표현 아데노 바이러스)과 실험 집단 - 예를 들어, 일반적인 실험은 세 우물이 필요할 수 있습니다.
  2. 적어도 30 분 동안 조직 문화 인큐베이터에 그것을 배치하여 37 ° C로 접시를 따뜻하게.
  3. 바로 6 - 잘 아닌 조직 문화 코팅 플레이트의 개별 우물에 쥐 섬 절연 18,19, 장소 100-200 islets에 따라. 육십 islets은 인슐린 분비 및 thymidine의 정관 assays가 필요합니다. 남은 islets는 유전자 발현 연구 또는 immunoblotting을위한 단백질 분리를위한 RNA 분리에 사용할 수 있습니다.

[참고 :이 시점부터, biohazardous 재료의 취급, 사용 및 처분을위한 제도적 절차를 따르시기 바랍니다.]....

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Discussion

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복제를 자극하고 베타 세포의 기능을 향상시키기 위해 변조된 수 수립 경로는 당뇨병의 두 주요 형태와 관련이 있습니다. 기능적인 베타 세포 질량이 determinants을 평가, 인슐린 - secreting 세포의 존재와 기능에 종속되어 있기 때문에 동시에 그것의 장점이 있습니다. 이 프로토콜은 단백질의 overexpression 또는 억제 그러면 생체내에 효능에 대해 테스트할 수 체외에서 기능적인 베타 세포 질량의 변화로 연결 여부 확인을위한 간소화된 프로토콜을 설명합니다.

이 프로토콜 중 하나는 제한이 섬을 포함하여 여러 세포 유형으로 구성된 마이크로 기관이지만, 알파, 베타, 델타, 엡실론, 그​​리고 PP 세포에 국한되지한다는 것입니다. 쥐 섬에있는 세포의 80-90%은 베타 세포이기 때문에 섬 복제의 변경 내용이 완전히 베타 세포 복제의 변화로 번역되지 않을 수 있습니다. 가능성을 그 섬에서 관찰된 변화복제가 아닌 베타 세포 복제 존재 .......

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Disclosures

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관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.

Acknowledgements

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이 작품은 NIH (PTF까지)에서 부여 DK078732에 의해 지원되었다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
시약의 이름 회사 카탈로그 번호 댓글
RPMI 1640 미디어 Gibco 11,879
페니실린 / 스트렙토 마이신 Gibco 15,140
6 - 잘 플레이트 BD-팔콘 35-1146 비 TC 처리
[메틸-3 H]-thymidine Perkin 엘머 NET027Z001MC 한 MCI / ML
마이크로 원심 분리기 튜브 Denville C2170 1.7 ML
NaCl 시그마 59,888
KCl Acros 42,409
KH 2 </ 서브> PO 4 Acros 20,592
MgSO 4 Acros 41,348
CaCl 2 Acros 34,961
HEPES 시그마 H0887 1 M 솔루션
35% BSA 시그마 A7979
NaHCO 3 Acros 42,427
D-글루코오스 시그마 G8769
TCA 피셔 과학 SA9410-1 10% W / V
NaOH Acros 12,426
섬광은 튜브를 센다 Sarstedt 58.536 7 ML, PP
섬광 계수 튜브 캡 Sarstedt 65.816
이코노 - 안전 계수 칵테일 RPI 111,175
인슐린 RIA 지멘스 TKIN2
BCA 분석 키트 써모 과학 23,250
장비
원심 분리기 Eppendorf 5415R
섬광은 튜브 랙을 계산 Sarstedt 93.1431.001
액체 섬광 계수기 Perkin 엘머 트라이 수화물 2910TR

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ferrannini, E. beta-Cell function in subjects spanning the range from normal glucose tolerance to overt diabetes: a new analysis. J. Clin. Endocrinol. Metab. 90, 493-500 (2005).
  2. Weyer, C., Bogardus, C., Mott, D. M., Pratley, R. E.

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Beta Cell FunctionAdenoviral TransductionIsolated Rat IsletsInsulin Secretion AssayTritiated Thymidine IncorporationGlucose HomeostasisFunctional Beta Cell MassAdenoviral OverexpressionGene Expression ManipulationCell Replication Analysis

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