تدخل الجيش الملكي النيبالي (رني) تمتلك مزايا عديدة أكثر من خروج المغلوب الجينات، واستخدمت على نطاق واسع باعتبارها أداة في دراسات الجينات الوظيفية. جعلت من اختراع تكنولوجيا الحمض النووي رني ناقلات القائم على المدى الطويل، ومحرض ضربة قاضية الجين ممكن، وزادت أيضا في جدوى إسكات الجينات في الجسم الحي.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
الحمض النووي الريبي التدخل ناقلات القائم على دراسة وظيفة الجينات في سرطان
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تدخل الجيش الملكي النيبالي (رني) يحول دون التعبير الجيني من قبل mRNAs الهدف المهينة على وجه التحديد. منذ اكتشاف المزدوج تقطعت بهم السبل الحمض النووي الريبي التدخل الصغيرة (سيرنا) في إسكات الجينات 1، وأصبح رني أداة بحث قوية في الدراسات وظيفة الجين. بالمقارنة مع حذف الجينية، [رني بوساطة إسكات الجينات تمتلك العديد من المزايا، مثل السهولة التي تتم فيها ومدى ملاءمتها لمعظم خطوط الخلية. وقد أظهرت دراسات متعددة في تطبيقات تكنولوجيا رني في أبحاث السرطان. على وجه الخصوص، جعلت تطوير تكنولوجيا مكافحة ناقلات القائم على الحمض النووي الريبي لانتاج صغير دبوس الشعر (shRNA) مدفوعا U6 أو مروج H1 على المدى الطويل والجينات محرض إسكات 2،3 ممكن. استخدامه في تركيبة مع النواقل الفيروسية وراثيا، مثل الفيروسة البطيئة، تسهل الكفاءة العالية للتسليم shRNA و / أو الاندماج في الحمض النووي الجيني للتعبير shRNA مستقر.
نحن تصف detaileد الإجراء باستخدام تكنولوجيا الحمض النووي رني ناقلات القائم على تحديد وظيفة الجينات، بما في ذلك بناء ناقلات lentiviral معربا عن shRNA، وإنتاج الفيروسة البطيئة وإصابة الخلية، والدراسات الفنية باستخدام نموذج الفأر طعم أجنبي.
تم الإبلاغ عن الاستراتيجيات المختلفة في توليد بنيات shRNA. وصف بروتوكول هنا توظيف تضخيم PCR وربط 3-شظية يمكن استخدامها لمباشرة وكفاءة توليد shRNA التي تحتوي على ثوابت lentiviral دون أن تترك أي المتاخمة اضافية النوكليوتيدات لتسلسل shRNA الترميز. حيث يمكن خفض الكاسيت shRNA التعبير عن هذه الاستراتيجية التي أنشأتها من قبل إنزيمات التقييد، ويمكن بسهولة انتقلوا إلى ناقلات أخرى مع مختلف علامات الفلورسنت أو المضادات الحيوية. ويمكن استخدام الكواشف ترنسفكأيشن معظم الإنتاج التجاري في الفيروسة البطيئة. ومع ذلك، في هذا التقرير، ونحن نقدم وسيلة اقتصادية باستخدام الكالسيوم فوسفات هطول الأمطار التي يمكن أن تحقق أكثر من 90٪ في كفاءة ترنسفكأيشن293T الخلايا. مقارنة التأسيسي ناقلات التعبير shRNA، نظام shRNA محرض هو مناسبة خاصة لاسقاط الجين ضروري لتكاثر الخلايا. علينا أن نبرهن على إسكات الجينات من يانغ يين 1 (YY1)، وهو الجين الورمي المحتملة في الاصابة بسرطان الثدي 4،5، من تيت، وعلى نظام shRNA محرض وآثارها على تكوين ورم. بحث باستخدام الفيروسة البطيئة يتطلب مراجعة والموافقة على بروتوكول السلامة الاحيائية من قبل لجنة السلامة من مؤسسة الباحث. بحث باستخدام نماذج حيوانية يتطلب مراجعة والموافقة على بروتوكول الحيوان من قبل لجنة رعاية الحيوان واستخدام (ACUC) من مؤسسة الباحث.
البروتوكول
1. جيل بنيات shRNA
- تحديد تسلسل سيرنا المستهدفة (20-23 النيوكليوتيدات) بناء على معايير سبق نشرها (6) او استخدام ملقم الخوارزمية على شبكة الإنترنت، مثل "سيرنا الباحث عن الهدف" من Ambion وGenScript.
- توليف [أليغنوكليوتيد] بناء على تصميم متواليات الشكل 1 والمثال في الجدول رقم 1. تنفيذ تضخيم PCR باستخدام P1 و P2 [أليغنوكليوتيد] (30 دورات من تبديل طبيعة في 94 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، الصلب عند 60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، والتطويل في 72 درجة مئوية لمد....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
هذا البروتوكول وصفا لطريقة لاسقاط الجين باستخدام shRNA ووضع تصور لتأثيره البيولوجية باستخدام التصوير bioluminescent من نمو الخلايا السرطانية في الجسم الحي. الموقع هدفا لshRNA يجب أن لا تحتوي على أي من مواقع تقييد الثلاثة (BamHI، HindIII وEcoRI) المستخدمة لsubcloning. في سيناريو نادر عند أي من هذه المواقع موجودة، ويمكن استخدام انزيم قيود إضافية ليحل محله في توليد بناء.
والخطوات الرئيسية عدة في هذا البروتو.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
وأيد هذا العمل في جزء من المنح باحث (116403-RSG-09-082-01-MGO) من الجمعية الأميركية للسرطان وصناديق جماعية من ويك فورست العلوم الصحية جامعة إلى ع. وأيد DBS بواسطة منحة لجنة التحقيق الوطنية 5T32CA079448 التدريب.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
بالإضافة إلى المعدات المختبرية التي يشيع استخدامها في الحمض النووي الريبي وتحليلات البروتين وزراعة الخلايا، ويطلب من المواد التالية والكواشف لهذا البروتوكول.
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| اسم كاشف | |||
| السلامة البيولوجية مجلس الوزراء مناسبة لاحتواء السلامة الأحيائية من المستوى 2 | |||
| PCR thermocycler | |||
| منبذة فائقة | |||
| التخدير التعريفي غرفة مع الزبالين isoflurane | |||
| الرقمية الورنية الفرجار | |||
| IVIS نظام التصوير | |||
| درجة عالية من الكفاءة DH5a كولاي | |||
| الانزيمات EcoRI، BamHI، وتقييد HindIII | |||
| T4 الحمض النووي يغاز | |||
| ثالث البلازميدات التعبئة والتغليف جيل الفيروسة البطيئة VSV-G، pRSV القس وpMDLg / pRRE |
قائمة المواد
المراجع
- Elbashir, S. M. Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature. 411, 494-498 (2001).
- Sui, G. A DNA vector-based RNAi technology to suppress gene expression in mammalian cells. Proc. Natl. Ac....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
