离体小鼠心脏线粒体通透性转换孔开放的多参数测量

摘要

本文介绍了一种利用光谱荧光法测定分离的小鼠心脏线粒体中线粒体通透性转换孔开放的实验方案。该检测方法包括同时测量线粒体的Ca²⁺处理能力、线粒体膜电位以及线粒体体积。同时，还描述了获取高质量且具有功能活性的心脏线粒体的操作步骤。

摘要

线粒体通透性转换孔（mtPTP）是一种非特异性通道，形成于线粒体内膜，可转运分子量小于1.5 kDa的溶质。尽管该通道的确切分子身份仍有争议，但已有研究表明亲环素D、VDAC和ANT等蛋白质参与了mtPTP的形成。虽然mtPTP开放在细胞死亡中的作用已得到充分证实¹，但越来越多的证据表明，mtPTP在线粒体Ca²⁺稳态²、生物能量学和氧化还原信号传导³过程中也发挥着生理功能。

mtPTP 的开放由基质 Ca²⁺ 触发，但其活性可受多种其他因素调节，如氧化应激、腺苷酸耗竭、高浓度无机磷酸盐（Pi）、线粒体膜去极化或解偶联以及长链脂肪酸⁴。体外实验中，可通过外源性添加 Ca²⁺ 提高线粒体基质内 Ca²⁺ 浓度（钙保留能力）来诱导 mtPTP 开放。当线粒体内 Ca²⁺ 水平达到一定阈值时，mtPTP 开放，促进 Ca²⁺ 释放，导致质子驱动力耗散、膜电位崩溃以及线粒体基质体积增加（肿胀），最终引起线粒体外膜破裂和细胞器功能的不可逆丧失。

本文介绍一种荧光测定法，可用于对分离的小鼠心脏线粒体中线粒体通透性转换孔（mtPTP）开放进行全面表征。该检测方法可同时测量 mtPTP 开放时发生的三个线粒体参数变化：线粒体 Ca²⁺ 处理能力（通过测定反应体系中 Ca²⁺ 浓度反映其摄取与释放）、线粒体膜电位以及线粒体体积。用于测定反应体系中 Ca²⁺ 和线粒体膜电位的染料分别为 Fura FF 和 JC-1。Fura FF 是一种膜不通透性、比率型指示剂，在 Ca²⁺ 存在时其激发波长发生偏移；JC-1 是一种阳离子性、比率型指示剂，在膜电位较低时形成绿色单体，在膜电位较高时形成红色聚集体。线粒体体积的变化通过记录线粒体悬液的光散射来测定。由于 mtPTP 开放检测需要高质量且功能完整的线粒体，本文还描述了获得完整、高度偶联且功能正常的分离心脏线粒体所必需的操作步骤。

方案

1. 小鼠心脏线粒体的分离

1. 为分离心脏线粒体，根据当地机构动物护理与使用委员会批准的程序，对小鼠进行麻醉并实施安乐死。

注意：线粒体分离方案的所有步骤都必须在冰上进行。使用预冷的缓冲液以及预冷的培养皿、Falcon 管和 Eppendorf 管。本方案中提供的体积适用于含有 2 个小鼠心脏的样本。

2. 取出心脏，置于冰冷的线粒体分离缓冲液（300 mM 蔗糖，10 mM Na-HEPES，200 μM EDTA，pH 7.4）中，冲洗去除血液。

注意：为获得最佳结果，应使用 KOH 和乙酸调节线粒体缓冲液的 pH。

3. 将心脏置于冰冷的培养皿上，去除脂肪和心房，用刀片充分剪碎，直至获得均匀的组织样品。
4. 将剪碎的心脏组织转移至50 ml Falcon离心管中，加入10 ml含有0.1 mg/ml胰蛋白酶的线粒体分离缓冲液，冰上孵育消化10分钟。

注意：在分离过程中使用胰蛋白酶可提高线粒体的分离得率，因此在不同线粒体制备过程中应保持胰蛋白酶的用量一致。我们....

讨论

本文所述方案介绍了评估分离心脏线粒体中通透性转换孔开放所必需的实验步骤（图1 和图4）：小鼠心脏线粒体的分离方法、确保其完整性和功能性的呼吸控制、监测线粒体通透性转换孔（mtPTP）开放过程中涉及的线粒体参数及其检测所用染料、荧光分光光度计仪器的设置，以及mtPTP开放的表征。本方案所用的荧光分光光度计可同时快速测量这三个参数。然而，基本方案也可使用其他市售仪器完成，尽管时间分辨率会有所降低。也可使用非比率型染料，但无法对Ca²⁺浓度和线粒体膜电位进行定量测定⁵。

在检测线粒体通透性转换孔（mtPTP）开放时，获得高质量的线粒体样品至关重要，因为线粒体积累 Ca²⁺ 的能力以及维持膜电位的能力密切相关。例如，我们发现呼吸控制比（RCR）较低的线粒体表现出 JC-1 聚集减少以及 Ca²⁺ 转运能力下降。我们用于分离心脏线粒体的方法是在先前发表的方案^{6, 7}基础上改进而来，经呼吸控制比和细胞色素 c.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
胰蛋白酶	Sigma-Aldrich	T3030
胰蛋白酶抑制剂（大豆）	Sigma-Aldrich	T9128
连二亚硫酸钠	Sigma-Aldrich	71699
鱼藤酮	Sigma-Aldrich	R8875
细胞色素 c	Sigma-Aldrich	C7752
阿莱霉素	Sigma-Aldrich	A4665
CCCP	Sigma-Aldrich	C2759
环孢素 A	Calbiochem	239835
Fura FF	Invitrogen	F14180
JC-1	Invitrogen	T3168
15 ml 玻璃-聚四氟乙烯匀浆器（Potter-Elvehjem 型）	Wheaton Industries
顶置式搅拌器	Wheaton Industries	903475
Oxytherm（带温度控制的氧电极）	Hansatech Instruments
QuantaMaster 80 双发射光谱荧光仪	Photon Technology International, Inc.