Utilizando o rato como um BLT humanizado baseado Stem Modelo Gene Therapy célula tumoral

Summary

A geração e caracterização de células T específicas de tumor utilizando ratinhos humanizados é descrita aqui. Tecido do timo humano e geneticamente modificadas de células-tronco hematopoiéticas são transplantadas em ratos imunocomprometidos. Isto resulta na reconstituição de um sistema imune humano permitindo engenharia para exame in vivo de anticorpos anti-tumorais respostas imunes.

Abstract

Modelos de pequenos animais, como ratos têm sido amplamente utilizados para estudar a doença humana e ao desenvolvimento de novas intervenções terapêuticas. Apesar da riqueza de informação obtida a partir destes estudos, as características únicas de imunidade do rato, assim como a especificidade de espécie de doenças virais, tais como o vírus da imunodeficiência humana (HIV), levou ao desenvolvimento de modelos de ratinhos humanizados. Os modelos anteriores envolveram a utilização de C. B 17 scid / scid ratos e o transplante de timo fetal humano e de fígado fetal denominados tua / liv (SCID-hu) ^{1, 2} ou a transferência adoptiva de leucócitos do sangue periférico humano (huPBL-IDCG ) ^3. Ambos os modelos foram utilizados principalmente para o estudo da infecção por HIV.

Uma das limitações principais de ambos os modelos foi a falta de reconstituição estável de células imunitárias na periferia para torná-los um modelo mais fisiologicamente relevante para estudar a doença de HIV. Para este fim, o zumbido BLTmodelo do rato anized foi desenvolvido. BLT significa medula óssea / fígado / timo. Neste modelo, de 6 a 8 semanas de idade NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl / SZJ (NSG) ratinhos imunocomprometidos receber o implante tua / liv como no modelo de ratinho SCID-hu apenas a ser seguido por um segundo transplante de células-tronco hematopoiéticas humanas ^4. A vantagem deste sistema é a reconstituição completa do sistema imune humano na periferia. Este modelo foi utilizado para estudar a infecção por HIV e de latência ^5-8.

Nós geramos uma versão modificada do modelo em que usamos geneticamente modificados células-tronco hematopoiéticas (HHSC) para construir o implante teu / liv seguido de injeção de transduzidas autólogo HHSC ^{7, 9.} Esta abordagem resulta na geração de linhagens geneticamente modificados. Mais importante ainda, adaptou-se este sistema para examinar o potencial de gerar funcionais As células T citotóxicas (CTL) que expressam um receptor de melanoma de células T específico. Usando esse modelo, pudemos avaliar a funcionalidade do nosso CTL transgênico vivo utilizando tomografia por emissão de tomografia (PET) para determinar a regressão do tumor (9).

O objetivo deste protocolo é o de descrever o processo de gerar esses camundongos transgênicos e avaliação de eficácia in vivo utilizando imagens de PET ao vivo. Como uma nota, uma vez que usamos tecidos humanos e vetores lentivirais, nossas instalações estão em conformidade com as diretrizes do CDC NIH para o Nível de Biossegurança 2 (BSL2) com precauções especiais (BSL2 +). Além disso, os ratos do NSG são severamente imunocomprometidos, assim, a sua habitação e manutenção devem estar de acordo com os mais elevados padrões de saúde ( http://jaxmice.jax.org/research/immunology/005557-housing.html ).

Protocol

A. Geração de ratos BLT

A geração de ratinhos BLT é dividido em três (3) partes: (1) de processamento de tecido fetal e preparação de CD34 humano de células-tronco hematopoiéticas, (2) transplante de tecido humano, e (3) transplantação secundária. Para todos os protocolos, fornecemos Tabela 1 com os dados de reagente.

1. Processamento de tecidos e Isolamento de CD34 Células-Tronco Hematopoéticas

Tecido fetal ou tecido fresco enviado durante a noite em gelo a partir de vários órgãos de aquisição de órgãos pode ser usado. Muitas vezes o tecido fetal não é estéril, como evidenciado pela produção de 1000 colónias bacterianas em ágar-sangue por mililitro de meio circundante. Rotineiramente lavar o tecido duas vezes em 40 ml de PBS estéril. Enquanto isso não remover todas as bactérias, que podem fazer a diferença entre uma série transplante bem-sucedido e um resultado em que a maioria dos ratos receptores sucumbir a bacteriana eminfecção. Como um passo adicional, para continuar a desinfectar o tecido, que a cultura da suspensão de células na presença de antibióticos.

1,1 Processamento de tecido tímico Fetal

1. Lavar timo por decantar o meio para um copo de água sanitária e utilizando bisturi para impedir o tecido de deslizar para dentro da água sanitária. Encha o tubo com PBS. Cap e inverter algumas vezes para lavar o timo. Decante o sobrenadante em lixívia. Repetir.
2. Colocar o tecido do timo, em 8 ml de RPMI + soro de vitela fetal a 10% em um prato de 60 mm e de cisalhamento em 1,5-2 mm com duas peças escalpelos. Cisalhamento com bisturis minimiza rasgar e danificando os pedaços de tecido. Tecido danificado tende a tornar-se inchado, pegajoso, e difícil de desenhar na agulha implante. O número de bits é obtido o primeiro limite superior em ratinhos transplantáveis.
3. Transferir os bits de suspensão com uma pipeta de 25 ml (para minimizar danos nos tecidos) para um frasco T25. Adicionar 70 ul de piptazo (Zosyn) ao balão e a cultura durante a noite, 2. Isto reduz consideravelmente as bactérias contaminantes. Se você deseja fazer tipagem de tecido ou de quaisquer outros ensaios de fenotipagem, retire 1 ml de células.

1.2 Processamento de tecido de fígado fetal

1. Lavar o fígado como no passo 1.1.1.
2. Adicionar 10 mL de meio de tudo e decantar Iscove numa placa de 100 mm de Petri.
3. Com dois bisturis, dado o fígado em pequenas (~ 3 mm) peças. Se você executar em tecido conjuntivo branco, raspe o fígado dele e descartá-lo na água sanitária.
4. Homogeneizar o tecido sugando a uma seringa 12 ml equipado com uma agulha de calibre 16 romba 3 ou 4 vezes e transferir para um tubo de 50 ml.
5. Preparar as enzimas para a digestão de tecidos como se segue: A 10 ml de Iscove em um tubo de 50 ml, adiciona-se 200 uL de cada um: colagenase tipo IV (1 mg / ml), hialuronidase (1 mg / ml), DNase I (2 U / ml).
6. Desenhar enzimas dentro de uma seringa 12 ml e se encaixar com um filtro de 0,22 μ. Filtra-se a enzimáticome / média directamente para a suspensão de células.
7. Cap e selar as células com Parafilm. Girar a 37 ° C durante 90 min.
8. Definir-se um tubo de 50 ml com um filtro de células 100 μ. Pipetar a célula digerir através desse filtro.
9. Adicionar PBS para as células para levar o volume até 50 ml. Dividir esta em dois tubos de 25 ml.
10. Forrar as células com 10 ml de Ficoll. Girar a 2.400 rpm por 20 minutos sem freio.
11. A interface deve ser grossa. Sugá-lo com uma pipeta de 5 ml e transferir para outro tubo. Você deve ter dois tubos de interface. Adicionar 50 ml de PBS a cada rotação e a 1.200 rpm durante 10 minutos.
12. Combinar pelotas em um tubo e lavar três vezes mais com PBS contendo 2% de FCS.
13. Finalmente suspender em 50 ml de RPMI + FCS a 10% e células de contagem, utilizando azul de tripano. Dependendo do tamanho do tecido, é possível obter a partir de ¹⁰ agosto - 10 setembro hepatócitos totais.
14. Transferir as células para um balão T150 e adicionar 30 ml de RPMI + FCS a 10% e 0,8 ml de piptazo.
15. Incubar durante 1 a 1,5 horas, a 37 ° C para remover as células aderentes.

1,3 Triagem e Transdução de CD34 Células-Tronco Hematopoéticas

1. Após a ligação de células do passo 1.2.15, agitar o frasco e para trás suavemente durante um minuto para desalojar as células soltas. Haverá uma grande quantidade de fibroblastos e preso como à superfície.
2. Contar novamente utilizando uma diluição de 1 a 20 e registar o número total de células. Salvar alguns décimos de um ml para posterior coloração. Você deve ter cerca de 30% menos células de contagem das suas células iniciais (etapa 1.2.13).
3. Girar para baixo e lavar duas vezes com 40 ml de tampão de MACS.
4. Células CD34 são classificados usando Kit Miltenyi Biotech CD34 direto. Seguimos exatamente o protocolo do fabricante utilizando colunas LS fornecidos pela mesma empresa.
5. As células recuperadas serão em 5 ml. Contar e células totais. O seu rendimento de células CD34 + devem ser de 3-5% das suas contagens de células totais. Isto varia de acordo com a poidade e do fígado fetal. Jovens fígados fetais tendem a dar um maior rendimento de células CD34 +.
6. Dividir o número de células por 1x10 ^6. Isto dá o segundo limite superior em ratinhos transplantáveis.
7. Contar o CD34 fracção (fluxo através e lavagens) e reserva de 6 x 10 ⁶ por ratinho a ser transplantado. Cultura destas células durante a noite em 50 a 80 ml de RPMI + 10% de Soro Fetal de Vitela piptazo + 1%.
8. Transdução de células CD34 + durante a noite com o seu vetor lentivírus. Usamos retronectin por Takara seguindo exactamente as instruções do fabricante.
9. No dia seguinte, a colheita das células CD34-, as células CD34 + transfectadas e contagem.
10. Dividir as células CD34 + no meio: Parte A e Parte B.
11. A rotação para baixo da peça de células CD34 + transduzidas e suspender em 4 a 6 ml de meio de congelação (RPMI + FCS a 10% + 10% de DMSO, 0,22 μ filtrado estéril). Colocar aliquotas de 1 ml em frascos de congelação e de etiqueta com "huFetalCD34", o número de células no frasco, a data, e suas iniciais.
12. Para cada rato misturar 0.5x10 Parte ⁶ B CD34 + e células transduzidas 4.5x10 ⁶ CD34-células num tubo de microcentrífuga estéril com tampa de rosca, granulada e manter em gelo. Também descongelar um tubo de Matrigel (BD Biosciences) em gelo. Todos estes tubos devem ser mantidos em gelo até usado (vá para o passo 2.10).

2. Transplante de Tecidos

O objetivo desta etapa é transplantar um timo fetais humanos / organóides fígado sob a cápsula renal NSG rato. Este organóides imita melhor o processo de selecção de células T humanas e os processos de maturação como as células estaminais hematopoiéticas usará o timo humano e não o rato como o local para a sua diferenciação de células T e outros diferentes linhagens linfóides. A utilização de células CD34 no processo de transplante é para voltar a gerar o estroma do fígado fetal e permitindo melhor o transplante e no crescimento do implante. A idade dos ratos utilizados NSG é de 6-8 semanas de idade.

1. Preparação de drogas para surgery:
   1. Isoflurano: Enrole uma gaze 2 polegada e enchê-lo em um tubo de centrífuga screwcap 15 ml. Verter em cerca de 1 ml de isoflurano directamente a partir da garrafa.
   2. Cetamina / zylazine: Adicionar 0,52 ml de cetamina (Ketaset) (100 mg / ml) e 0,52 ml de xilazina (Anased) (100 mg / ml) para um frasco de 20 ml de solução salina para injecção. Etiqueta com a data de vencimento da primeira componente de expirar e manter congelado a -20 ° C até ser necessário.
   3. Carprofeno (Rimadyl). Diluir esta pouco antes de um procedimento cirúrgico. Diluir 1:100 retirando 0,1 ou 0,2 ml do frasco com uma seringa de 1 ml e uma agulha de 25G. Injetar um de 10 ou 20 ml de solução salina para injecção. Rótulo e data. Mantenha na geladeira por um dia só. Carga em seringas de 3 ml com agulhas 25G.
2. Configure a tabela para cirurgias. Cubra-o com estéreis almofadas azuis, e uma toalha estéril para cada cirurgião. Cada cirurgião recebe a partir de sua caixa de instrumentos esterilizados: 4 "tesouras, pinças curvas cegas, precisamle-nariz fórceps, pinça hemostática, trocarte embotada 16G e aplicador clipe ferida. Além disso, eles precisam de uma curva-agulha de sutura Vicryl, uma pilha de isopropanol limpar pacotes, de 35 mm de prato de Petri PBS, e uma seringa de 1 ml, cheio com PBS.
3. Situado no meio da mesa de vidro frasco Coplin com 2 cm de Betadine e 2 cotonetes. Verter os bits do timo em uma placa de Petri de 60 mm.
4. A anestesia é efectuada sobre uma mesa separada ou numa cobertura coberta com estéreis pastilhas azuis. Configure dois racks pequenos e uma balança eletrônica com uma taça para manter os ratos. Use uma cremalheira para prender 0,5 ml X seringas de insulina 28G carregados com cetamina / xilazina e a outra para segurar as seringas de 3 ml de carprofeno. Também mover o recipiente de resíduos de risco biológico perto para manter a pele raspada.
5. Pesar todos os ratinhos (6-8 semanas de idade) em uma gaiola de obter o peso médio e seringas de carga com uma dose de 15 ^ L / g de cetamina / xilazina. Injectar todos os ratos na gaiola.
6. Depois que os ratos tornam-se lentos raspar seu left lado do quadril ao ombro entre o centro das costas e barriga com um cortador de Oster com lâmina n º 40. Registar o seu peso, e perfurar os ouvidos para a numeração.
7. Injectar 0,3 ml por via subcutânea carprofeno sobre o ombro.
8. Verifique o nível de anestesia do mouse, apertando uma pata. Se o rato recua, administrar isoflurano a partir de um tubo de cerca de 12 seg. Então tente o aperto pata novamente. Continue dando tiros curtos de isoflurano até o reflexo pata desaparece. Coloque o mouse sobre o seu lado direito virado para a esquerda.
9. Uma agulha de calibre 16-implante do cancro, com a ponta redonda depositado é usado para inserir o tecido. Lave o trocarte algumas vezes no prato de PBS. Segurando-o horizontal com a vara dentro da ponta. Adicionar um pedaço de timo com a pinça needlenose e chupar-lo dentro
10. Um auxiliar adiciona 5 ul de Matrigel frio para um tubo de células (passo 1.3.12) com uma pipeta de deslocamento positivo Eppendorf, e mistura-se por agitação suave. O cirurgião holds trocarte o horizontalmente e puxa a haste para trás lentamente como o ajudante pipetas a mistura Matrigel no trocarte. A mistura gelifica à temperatura ambiente.
11. Limpe a pele nua com Betadine. Em seguida, limpe-as com uma mistura de isopropanol wipe. Repetir.
12. Localize o baço sob a pele. É o mais escuro mancha. Rim do rato está localizada cerca de 5 mm dorsal para o baço, o que pode ser visto através da pele raspada.
13. Pegue a pele sobre este ponto com a pinça sem corte e fazer um corte paralelo ao baço cerca de 15 mm de comprimento. Fazer um corte semelhante na camada muscular do peritoneu abaixo. Nos machos, o rim deve ser diretamente visível e você simplesmente tem que apertar o abdômen para que ele fique exposto. No feminino, você pode ter que pegar o ovário com a pinça hemostática e arrastar para fora do rim. Isto pode ajudar a reter o rim para fora do corpo. Para os homens, você vai ter que manter alguma pressão sobre o abdômen com a mão esquerda para manter o rim exposto.
14. Arrancar um pequeno buraco no posterior extremidade da cápsula do rim. Pode sangrar um pouco.
15. Deslize o trocarte dentro deste furo e ao longo do rim até que o orifício do trocarte é completamente coberta pela cápsula renal. Em seguida, usando o dedo mínimo de sua mão direita, injetar o tecido.
16. Empurre o rim de volta suavemente com a pinça hemostática fechado. Coloque um ponto no peritônio amarrado com um saber dupla. Aperte a pele para cima como uma bolsa e colocar em dois grampos de sutura.
17. Coloque uma gota de PBS em cada olho e colocar o mouse em seu lado na cama gaiola. Certifique-se de todos os ratos voltaram a colocar em suas barrigas antes de deixá-los.
18. No dia seguinte, dar a cada um rato outro tiro de carprofeno.

3. Transplante secundário

O objectivo deste passo na geração de ratinhos BLT é povoar a medula óssea moue com células estaminais hematopoiéticas. O implante transplantado de processo (2) não é suficiente para suportar a reconstituição completa do the sistema imunológico humano nestes ratinhos. Durante o transplante secundária, sub-letalmente irradiar os ratos para esgotar as células da medula óssea de murinos gerando assim um "espaço" para a implantação das células CD34 + humanas.

1. Quatro a seis semanas mais tarde, os ratinhos irradiar com 2,7 Gy. Os ratinhos são injectados no mesmo dia com a Parte A CD34 + transduzidas. O prazo é baseada na criação e crescimento do implante teu / liv transplantadas no passo 2. Normalmente, durante este tempo o implante tem crescido significativamente nos permitindo avançar para as próximas etapas.
2. Descongelar a Parte A células CD34 + transduzidas, lavar e suspender em meio a uma concentração de 5x10 ⁶ / ml.
3. Carregar 0,5 ml x 28G seringas de insulina com 0,1 ml de células (10 ⁵ a 5x10 ⁵ células por 0,1 ml por ratinho) para uma gaiola de ratos (cada gaiola contém um máximo de 5 ratinhos) e colocá-las sobre um suporte de costas.
4. Anestesiar um rato com um tubo de isoflurano por scruffing-lo e realizar a suanariz nos tubos de cerca de 20 seg. Conte para manter o controle do tempo.
5. Então, enfrentá-lo para a direita e puxe a pele ao redor de seu pescoço apertado com o polegar eo indicador da mão esquerda. Pressione sob sua mandíbula com o seu localizador de terceiro, de modo que seu olho direito protrai para fora. Segurando a seringa paralela ao longo eixo da cabeça do rato, deslizar a agulha por trás do olho e deslize-o suavemente até parar. Não pressione qualquer outra, mas a carga de injetar mais de cerca de 2 segundos.
6. Dois ou três meses mais tarde os ratinhos são sangrados retroorbitally usando pipetas de vidro revestidos com EDTA. Você só pode ter um máximo de 200 l de sangue por mês por mouse. 50-100 ul de sangue deve ser suficiente para a análise FACS. Estratégias alternativas incluem sangramento sangra veia faciais e sangra veia da cauda. Este último vai lhe dar volumes muito pequenos de sangue que pode não ser suficiente para múltiplos ensaios.
7. As amostras de sangue foram coradas para a expressão do marcador de linfócitos humanos CD45 para avaliar a reconstituição. BAs amostras são adicionadas Lood em um tampão vermelho sangue ml de lise celular (160 mM NH ₄ Cl, 100 mM _KHCO3, 0,01 mM de EDTA) e incubou-se durante 5 min à temperatura ambiente.
8. Lave as células em tampão de lise, 5 min a 1.200 rpm, e, se necessário, repetir.
9. Centrifugar as células como em 3.8 e lavar com PBS suplementado com 3% de soro fetal de vitelo (FACS-PBS).
10. Remover o sobrenadante e re-suspensão em 100 uL pelotas FACS-PBS.
11. Adicionar anticorpos para avaliar a reconstituição de linfócitos humanos. Nós normalmente incluem o seguinte CD45 (marcador de linfócito humano), CD8, CD4, CD14 e CD16 para macrófagos e monócitos, CD19 para células B e CD56 para células NK.
12. Incubar a 4 ° C durante 30 min.
13. Lavar como no passo 3.9 e suspender novamente as células em paraformaldeído a 2% para a análise FACS.
14. Se os ratos são reconstituídos, prosseguimos com injeções de tumor. Níveis de reconstituição de linfócitos humanos variam desde menos de 1% a 40% do total de células sanguíneas. Os níveis e tipos de lymphoclinhagens YTE são comparáveis ​​ao que seria de esperar de doadores de sangue saudáveis ​​humanos. No entanto, não esperar que as flutuações no número de linhagens de células não-T. Se os números não são aceitáveis ​​dentro do prazo de 12 semanas você pode repetir o procedimento de transplante secundário a partir do passo 3.1.
15. Linhas de células tumorais são cultivadas de acordo com as recomendações do fabricante ou de laboratório. As células são colhidas, lavadas e ressuspensas em matrigel a uma razão de 1:1 (50 ul matrigel células/50 ul). As amostras são mantidas em gelo em todos os momentos.
16. Os ratos são anestesiados e raspado na zona de injecção. A área é esterilizado com uma compressa de isopropanol. Um ajudante de cargas celulares suspensões em pré-resfriados 23g seringas de 1 ml. As células tumorais são injectadas por via subcutânea. Tratar o local de injecção com pomada antibiótica. Tumores deve estabelecer e começar a crescer em 4 semanas.

B. Em Positron Emission Tomography vivo (PET)

Para nossos estudos exame quecaptação de glicose ine ^([18 F]-fluorodeoxiglicose ^([18 F] FDG), assim, ratos são 4-6 horas em jejum antes da imagem. MicroPET / CT é feita usando o microPET Inveon scanner (Soluções Siemens pré-clínica) e MicroCATII CT scanner ( PreclinicalSolutions Siemens). A análise das imagens é feita usando software OsiriX (Pixmeo, Suíça). O objectivo é medir a actividade metabólica do tumor e, finalmente, a utilização de imagens PET como uma alternativa para medir fisicamente a regressão do tumor. Como visto na Figura 2, nós Os tumores que se depararam com base na aparência física e tamanho não são orientados mas imagiologia PET vivo revelaram necrose tecidual. Essa metodologia pode servir como um indicador mais sensível e precisa de regressão do tumor.

1. Designar uma câmara para anestesiar (2% isofluorano) os ratos, e uma câmara como a captação de 60 min de FDG PET antes de varredura ("Câmara de espera"). Coloque almofadas azuis em ambas as câmaras.
2. Como os animais são Anesthetized sobre um longo período, elas devem ser mantidos aquecidos a 30 ° C através da utilização de luvas cheios de água que são aquecidas num forno de microondas e de colocação das gaiolas em almofadas de aquecimento.
3. Vire o fluxo isoflurano para esta câmara em. Permitir que o isoflurano para encher a câmara de anestesia para cerca de 5-10 minutos, antes de colocar qualquer rato para a câmara. Verifique se a tampa está bloqueado e bem fechada para evitar vazamento isoflurano.
4. Coloque o primeiro mouse na câmara de anestesia e bloqueie a tampa firmemente. Permitir 5-10 minutos ou até que o mouse é inconsciente.
5. Remover o rato da câmara anestesiante, etiqueta da cauda do rato (cor diferente por gaiola) e injetar o rato por via intraperitoneal com ^[18 F] FDG (80 iCi). Tome nota do que o mouse foi injetado. O mouse será novamente anestesiados 50 min a partir deste ponto no tempo, permitindo por 10 min para configurar para PET scan (para o total de 60 minutos ^[18 F] captação de FDG antes de PET scan).
6. Colocar o rato injectado na câmara de espera, permitindo ^[18 F] captação de FDG durante 1 h antes de varrimento de PET. Não trave a tampa. Deixe a tampa frouxa para permitir o fluxo de ar.
7. Imediatamente coloque o mouse próximo para injeção de FDG na câmara anestesiante. Injecções posteriores ratos devem ser espaçadas de 10 minutos de distância, porque o processo de digitalização PET é de 10 min. Imediatamente após um mouse é digitalizado, a 60 min captação de FDG para o mouse próximo a ser digitalizado estará pronto exatamente 10 minutos de distância.
8. Continuar anestesiar e injectando ratinhos como indicado nos passos 7-9.
9. Após 50 minutos do primeiro ponto no tempo de injeção do mouse, coloque o mouse primeiro injetado na câmara de anestesiante novamente (enquanto continua para anestesiar e injetar camundongos).
10. Conecte o mouse para a cama de oxigênio e linhas de isoflurano, e transformar o fluxo de isoflurano em para a cama. Coloque uma almofada de azul sobre a cama.
11. Posicione o mouse pronto para PET scan em cima da cama, esticando os braços epernas e mantendo esta posição com fita adesiva. Coloque lubrificante sobre os olhos. Este passo é o mais importante uma vez que o posicionamento do animal podem afectar a qualidade da sua imagem.
12. Desconecte as linhas de isoflurano e oxigênio e, rapidamente, montar a cama na máquina PET scan. Coloque as linhas de isoflurano e oxigênio. Verifique se o fluxo de isoflurano em que a máquina PET scan. Conecte o cabo de PET scan e iniciar a digitalização.
13. Uma vez que o PET scan estiver completa, então mover o animal para o scanner CT. Seguindo essa varredura mover o animal para sua gaiola respectiva.

Representative Results

Um diagrama de fluxo do processo de transplante é mostrado na Figura 1A. Uma imagem do implante teu / liv é mostrado na Figura 1B. O tecido tímico desenvolve normalmente e tem uma distribuição fisiológica de CD4 humano e células T CD8. Após a reconstituição, os animais carregam um sistema imune humano com distribuição normal de CD4, CD8, células T e outras linhagens de células imunes.

A discrepância entre o tamanho do tumor e do tecido vivo é mostrada na Figura 2. Embora a tomografia (área cinzenta) indicou um crescimento de tumor de grande porte, in vivo PET mostrou que era principalmente necrótico e tecido de cicatriz (Fig. 2). Isso ressalta a utilidade de imagens PET como uma forma mais sensível e preciso para avaliar a regressão do tumor e desembaraço.

Figura 1. (A) Um diagrama esquemático do modelo BLT modificado utilizada nestes estudos para a produção de ratinhos quiméricos que transportam MART-1 células T específicas. O implante Thy / Liv foi reconstruída a partir de transduzidas e não transduzidas células CD34 isoladas de um fígado fetal autólogo. A fracção das células transduzidas é congelada e injectado nos ratinhos irradiados 4-6 semanas mais tarde. (B) Uma imagem representativa do implante tua / liv em ratinhos humanizados. Os implantes têm uma distribuição do tecido fisiológico e relações CD4/CD8 como mostrado pelo IHQ e figuras de citometria de fluxo. Clique aqui para ver maior figura .

Figura 2. Uma imagem PET e CT de um rato carregando um tumor melanoma. Oárea cinza indica o tamanho físico do tumor, enquanto a cor vermelha indica a actividade metabólica do tumor, o que é muito limitado.

Discussion

O modificado BLT modelo de rato humanizado juntamente com in vivo PET são ferramentas poderosas para estudar doenças crônicas humanos. Este sistema tem o modelo do rato BLT e avança para além do escopo limitado para pesquisa do HIV. Além disso, é um excelente sistema em que podemos examinar diversos protocolos de terapia de genes, bem como técnicas de diagnóstico, antes de poderem atingir o ambiente clínico. Este último acoplado com o baixo custo do uso de ratos contra os primatas torna este modelo muito útil.

A tecnologia de imagem PET nos permitiu avaliar a eficácia da nossa abordagem. Se dependeu exclusivamente de medições físicas do tumor, que teria subestimado a potência da resposta anti-tumoral gerado pelas nossas células T transgénicas. A cicatriz extensa e tecido necrótico deu a aparência de um tumor grande, o que, na realidade, foi tecido morto.

Em conclusão, a utilidade do BLT modificado rato modelo pode ser estendida a outros modelos de doenças. Enquanto algumas desvantagens ainda persistem como o tempo mais curto de ratos, o que pode ser uma ferramenta muito forte para avaliar in vivo muitos aspectos da imunidade humana, teste e desenvolver novas intervenções terapêuticas.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS	Invitrogen	10010049
RPMI 1640		A1049101
Iscove's		12440061
Fetal Calf Serum		16000085
Collagenase type IV	Sigma Aldrich	C5138
Hyaluronidase		H3506
DNAse I	Roche Diagnostics	10104159001
Piptazo (Zosyn)	Pfizer		Piperacillin/tazobactam combination
Ficoll (Ficoll-Paque Plus)	Ge Healthcare Life Sciences	17-1440-02
MACS Buffer	Miltenyi Biotech	See comments	MACS buffer: PBS supplemented with 0.5% fetal bovine serum and 2 mM citrate dextrose formula-A
CD34 Microbead Kit		130-046-702
LS Columns		130-042-401
Retronectin	Takara	T100A
Matrigel	BD Biosciences	354263
Isofluorane	Baxter		http://www.baxter.com/healthcare_professionals/products/forane.html
Carprofen (Rimadyl)	Pfizer Animal Health		https://www.rimadyl.com/default.aspx