Summary
我们描述了一种方法，初级人类T细胞的转基因使用的非病毒基因修饰
Abstract
piggyBac转座子系统自然是积极的，最初来自甘蓝尺蠖蛾1,2。质粒基于此非病毒的系统，是最常用的利用两个质粒与表达一个的piggyBac转座酶和转座子的质粒转染的基因（s）之间的反向重复元件所必需的基因转移活性景点PiggyBac转介导的基因转移通过“剪切和粘贴”机制转座整合到基因组中的目标小区（s）的权益。转座子段PiggyBac转已表现出高效率的基因转运活性在多种昆虫1,2，哺乳动物3-5，和人cells6包括初级人类T细胞7,8。近日，“恨铁不成钢”的座子转座产生，提高转基因效率9,10。
人类T淋巴细胞的临床欢迎有兴趣过继免疫治疗癌症的11日。值得注意的是，第一次临床试验涉及使用睡美人转座子系统的人类T细胞的转座子修改已批准12。我们先前已经评价piggyBac的人类T细胞的遗传修饰的非病毒方法的效用。我们发现piggyBac转是高效率的在带记者基因和非免疫原性诱导的自杀基因7的人类T细胞的遗传修饰。基因组的整合位点的分析，揭示了缺乏或称为原癌基因附近的偏好整合到13。我们使用piggyBac转基因修改细胞毒性T淋巴细胞，以进行针对肿瘤抗原的HER2的嵌合抗原受体，并发现，基因修饰的T细胞介导的有针对性的杀害在原位小鼠模型的HER2阳性肿瘤细胞在体外和体内 14。我们也使用座子以产生耐雷帕霉素的人类T细胞，这应该是有用的癌症疗法，其中雷帕霉素是利用15。
在这里，我们描述了使用座子基因修饰初级人类T细胞的方法。这包括分离的外周血单核细胞（PBMCs）培养，基因修饰，和活化的T细胞随后从人类血液。对于本报告而言，T细胞进行了修改与一个报告基因（EGFP）基因表达的流式细胞仪分析和量化。
PiggyBac转可用于与感兴趣的基因的各种修改的人T细胞。虽然我们已经使用piggyBac转指示T细胞对肿瘤抗原14，我们也使用piggyBac转添加诱导型安全开关，以消除基因修饰的细胞，如果需要7。大货的piggyBac的能力，也使转基因的大雷帕霉素抗mTOR的分子（15 KB）15。因此，我们提出了一种稳定的基因改性的初级人T细胞，用于各种各样的目的的非病毒方法。
Protocol
0天
1。从人血中分离单核细胞
- 收集20毫升的人新鲜血液，使用静脉穿刺到的Na-肝素的真空采血管管。
- 混合血液和高级的RPMI 1640，在1:1（体积/体积）的比例。
- 加入到50ml离心管中（25℃）的20毫升淋巴制剂介质。慢慢层25-30毫升血液RPMI 1640混合的lymphoprep顶部。
- 在400 XG离心40分钟，没有踩刹车。
- 收集到10毫升的1×PBS（25℃）用一次性移液管的两个不同的和模糊的层，使体积达50毫升用1×PBS。
- 离心450 xg下10分钟。
- 完全吸出上清液，加入20毫升的高级RPMI 1640。
- 400×g离心5分钟离心。
- 吸取上清液。在37℃下预热5纳克/毫升的rhIL-15的完整的T细胞的培养基中加入10毫升
- 计数的细胞的数量和板在24孔组织培养外套编板上，在2×10 6细胞/孔的完整的T细胞的介质补充有5纳克/毫升的rhIL-15添加无菌水对周围井。孵育过夜可增湿培养箱中在37℃下，5％CO 2。
第1天
2。涂层板的抗-CD28和抗-CD3抗体的刺激T细胞
- 稀释在无菌水中的抗-CD28和抗-CD3抗体的浓度为1微克/毫升每个。
- 加入500μl每种抗体溶液5标记非涂覆的组织培养的24孔板的孔中。
- 添加无菌水休息的井。包装板的收缩包装，并在4℃冰箱中。
3。未刺激T细胞的核转染的
- Prewarm T细胞介质，在37°C和5 ng / ml的重组人IL-15的补充。准备完整的nucleofector的解决方案，通过添加500微升至2.25毫升的Nucleofector解决方案的Nucleofector补充1。
- 一liquot 5微克每个座子（Zeo的-的pT-CMV-eGFP的）和转（在1.5毫升微量离心管中的pCMV-piggyBac转 ）。 注意：这可能是必要的，以优化为最佳的基因传递转座酶和转座子的DNA量，并尽量减少的细胞毒性。质粒可以从作者获得请求。
- 入50毫升的管的24孔组织培养板中收获的PBMC。计数细胞的数目。下次作为流式细胞仪的控制中使用的2×10 6细胞。
- 7-10×10 6个细胞加入到一个15毫升的试管，在400×g离心5分钟离心，吸出上清液和手指轻拂颗粒。
- T细胞完整的核转染的解决方案松开细胞沉淀中加入100μl。
- 添加的溶液细胞混合物的管含有质粒。
- 加入细胞质粒的溶液的混合物的核转染反应杯底部。要小心，不要实施任何气泡。
- Nucleofect使用专业的细胞克U-014（未刺激T细胞，人力， http://bio.lonza.com/resources/product-instructions/protocols/ ）的。
- 立即加入500μl预热的媒体与重组人IL-15的比色皿。将细胞转移到24孔平板的孔中，与1.5毫升预热的媒体与rhIL15。
- 孵育过夜可增湿培养箱中在37℃下，5％CO 2。
第2天
4。非特异性刺激T细胞
- 收获细胞，并确定手机号码。设置留出0.5×10 6个细胞的流式细胞仪来确定的GFP阳性细胞的频率。使用的非转染的外周血单个核细胞作为对照。
- 吸干CD3/28抗体溶液从非组织培养涂板，并与T细胞介质冲洗各孔。
- 。重悬nucleofected的细胞以0.5×10 6个细胞每毫升中完整的CTL媒体补充有5纳克/毫升的rhIL-15。加入2.0毫升每个的nucleofected 4非组织培养板的孔中的细胞。加入0.5×10 6个的非nucleofected细胞的第 5以及。
- 孵育3天可增湿培养箱中，在37℃，5％CO 2。
第5天
- 收获的刺激的T细胞的未涂覆的组织培养板中。
- 计数和replate细胞在24以及涂覆的组织培养板中，在0.7×10 6细胞/ ml在与5 ng / ml的IL-15的T细胞介质。
7天
7。基因表达分析
- 收获细胞和染色用抗人CD8抗体（也可以使用抗-CD3和抗-CD4）和％GFP表达的流式细胞仪分析。
第8天（可选）
8。扩大T细胞
- 在转染后的第8天，T细胞可以在T再铺平板在密度为0.7×10 6个细胞每孔的进一步扩大16与IL-15的细胞培养基。
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Representative Results
遗传修饰与报告基因（绿色荧光蛋白）的人T淋巴细胞中的步骤的示意性展示图1中所示。这些质粒可根据作者的要求。展示的步骤与报告基因（EGFP）转基因人类T淋巴细胞是一个schemtic舒如图2所示。激活T细胞，以获得它们分裂，扩大和传播文化，这是必要的。修改人类T细胞，然后培养，并用流式细胞仪分析的第1天，7天的基因表达。所示的结果在图3中从一个供体细胞进行染色，用Cell Quest软件与别藻蓝蛋白（APC）标记的抗-CD8，由FACSCalibur配备的过滤器组4的荧光信号的eGFP（转基因）和APC荧光分析（Becton Dickinson公司）。我们先前已观察到CD4和CD8阳性T细胞的基因修饰，和本文中妖strate作为一个实施例7中的 CD8阳性细胞。虽然我们分析为单一的转基因表达这里，piggyBac转也被用于在人类细胞中17（或复用）的多基因的基因转移。 eGFP表达在第1天，第7天之间的减少可能是由于这一事实，并非所有的转染的细胞进行转座子的DNA稳定整合。
图1示意图用于piggyBac转的人T细胞介导的基因修饰的质粒。 CMV，巨细胞病毒启动子，内含子，SV40内含子的mRNA的稳定; piggyBac转 ，转座的cDNA; SV40 pA的，多聚腺苷酸化的网站; pUC的，复制原点;β-内酰胺酶，氨苄青霉素抗性基因; PB3'IR，piggyBac的 3'倒位重复; PB5' IR中，piggyBac5'反向重复; ZeoR，Zeocin抗性基因，复制原点; R6K大利，“个人游”，插入序列，绿色荧光蛋白，荧光报告基因。 注：抗生素被用于细菌的选择和成长，但都没有使用在T细胞的培养。 查看大图 。
图2描述的变形例使用piggyBac转座子系统的初级人T细胞的示意图 。
图3在T细胞中的表达。稳定的转基因修改的piggyBac转座子系统·米。左图：在第1天的绿色荧光蛋白表达。右图 ：绿色荧光蛋白的表达第7天。 点击此处查看大图 。
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Discussion
本文所描述的方法，使稳定的转基因修饰的初级人T淋巴细胞。我们之前测试过的piggyBac转座子系统的使用，修改T细胞表达的报告基因（超过4周），一个非免疫原性自杀的基因，过继免疫治疗的嵌合抗原受体（超过100天），工程师免疫抑制药物的抗7,13-15。非病毒的T细胞过继免疫治疗和其他应用程序的修改应该是更便宜，因此，更广泛地利用比逆转录病毒转导。新的过动座子元件的使用应增加稳定的转基因修饰的人T细胞制造的可行性。虽然这里没有描述的，一个可以实现必要的潜在的临床应用的稳定转染的T细胞的数目。利用piggyBac转介导的基因转移和AK的组合562（人工抗原呈递）饲养细胞，约2×10 6稳定转染的T细胞的初始屈服可以扩大至超过10 10转导的T细胞在4〜5周，并在6至7至10 12 4至5日志周7。在人类T细胞的座子整合位点分析显示，没有偏向原癌基因，但是，它没有表现出偏爱融入活化的T细胞中高表达的基因时使用的核转染技术，上面列出13。 座子是一个很有前途的方法稳定遗传修饰的人类T细胞为各种各样的应用。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
SS支持到研究生培训津贴由霍华德休斯医学研究所医学通过TBMM计划的一部分。 MHW是支持的，部分的职业发展奖的博士和夫人的Harold M. Selzman从退伍军人事务部的大力支持。也支持这项工作是由美国国立卫生研究院淋巴瘤SPORE授予P50CA126752和NIH R01 DK093660。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lympholyte | Cedarlane | CL5015 | |
| Advanced RPMI 1,640 | LifeTechnologies | 12633020 | |
| Hyclone Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | SH3008803 | |
| GlutaMAX-I Supplement | LifeTechnologies | 35050-061 | |
| Human IL-15 Recombinant Protein | eBioscience | 14-8159 | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
| Amaxa Nucleofector | Lonza | AAD-1001S | |
| Human T Cell Nucleofector Kit | Lonza | VPA-1002 | |
| CD8-APC | Southern Biotech | 9536-11 | |
| Anti-Human CD3 | eBioscience | 16-0037-81 | |
| Anti-Human CD28 | BD Pharmingen | 555725 | |
| 24 Well Tissue Culture Treated Plate | BD Falcon | 353047 | |
| 24 Well Non Tissue Culture Treated Plate | BD Falcon | 351147 | |
| Complete T cell media composition 1x Advanced RPMI 1,640 5% Heat Inactivated Fetal Bovine Serum 2 mM GlutamaxIM-I |
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References
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