Summary
Vi presenterer en flowcytometri-basert metode for å undersøke T celle utvikling
Abstract
Et sunt immunsystem krever at T-cellene reagerer på utenlandske antigener mens resterende tolerant til selv-antigener. Tilfeldig omorganisering av T-celle reseptor (TCR) α og β loci genererer en T-celle repertoar med stort mangfold i antigen spesifisitet, både til seg selv og utenlandske. Utvalg av repertoaret under utvikling i thymus er kritisk for å generere sikre og nyttige T-celler. Defekter i thymisk utvalget bidrar til utvikling av autoimmune og immunsvikt sykdommer 1-4.
T celle progenitors angir thymus eksempel doble negative (DN) thymocytter som ikke uttrykker CD4 eller CD8 co-reseptorer. Ekspresjon av αβTCR og begge ko-reseptorer forekommer på den doble positive (DP) stadium. Samspillet av αβTCR med self-peptid-MHC (pMHC) presentert av thymus celler bestemmer skjebnen til DP thymocyte. Høy affinitet interaksjoner føre til negativ seleksjon og eliminertsjon av selvreaktive thymocytter. Lav affinitet interaksjoner resultat i positiv utvelgelse og utvikling av CD4 eller CD8 enkeltstående positive (SP) T-celler som er i stand til å gjenkjenne fremmede antigener presentert av self-MHC 5.
Positiv utvelgelse kan studeres i mus med en polyklonalt (wildtype) TCR repertoar ved å observere den generasjonen av modne T-celler. Men de er ikke ideelle for studiet av negativ seleksjon, som innebærer sletting av små antigenspesifikke populasjoner. Mange modell systemer har vært brukt til å studere negativ seleksjon men varierer i deres evne til å rekapitulere fysiologiske hendelser 6. For eksempel, i vitro stimulering av thymocytter mangler thymisk miljø som er nært involvert i valg, mens administrasjon av eksogent antigen kan føre til ikke-spesifikk sletting av thymocytter 7-9. Foreløpig de beste verktøyene for å studere in vivo negativ seleksjon er mus som uttrykker en transgENIC TCR spesifikk for endogen self-antigen. Imidlertid er mange klassiske TCR transgene modellene prematur ekspresjon av transgene TCRα kjeden ved DN stadiet, som resulterer i for tidlig negativ seleksjon. Vår lab har utviklet HY CD4 modell hvor den transgene HY TCRα er betinget uttrykkes på DP stadiet, slik negativ seleksjon å oppstå under DP til SP overgang som forekommer i wildtype mus 10.
Her beskriver vi en flowcytometri-basert protokoll for å undersøke thymic positiv og negativ seleksjon i HY CD4 mus modell. Mens negativ seleksjon i HY CD4 mus er svært fysiologisk, kan disse metodene også brukes til andre TCR transgene modeller. Vi vil også presentere generelle strategier for å analysere positiv utvelgelse i et polyklonalt repertoar som gjelder for alle genetisk manipulerte mus.
Protocol
Se Figur 1 for en samlet ordning av den eksperimentelle protokollen.
1. Disseksjon
- Sted sterile stålnett skjermen i 60 x 15 mm petriskål. Én enhet er nødvendig per vevsprøve.
- Tilsett 5 ml av Hanks balanserte saltløsning (HBSS) for å hver tallerken. Hold retter på isen.
- Avlive mus med CO 2.
- Sikker musen til disseksjon overflaten, ventral side vendt opp. Spray mus med 70% etanol for sterilisering og for å sikre at pelsen matted ned.
- Ved hjelp av kirurgisk saks, begynner disseksjon ved å lage en ventral innsnitt i buk huden like over kjønnsorganer. Utvide snittet oppover til haken.
- Fra midtlinjen, forlenge snittet ned langs alle lemmer. Trekk tilbake løs hud og pin det ned til disseksjon overflaten.
- Høste thymus:
- Løfte den nederste spiss av sternum å gjøre et snitt.
- Unngå leveren, kuttet mellomgulvet å løsne brystkassen og deretter kutte brystkassen til hver side. Skjær brystkasse oppover på hver side, ta vare å unngå lunger og hjerte.
- Dra forsiktig i brystkasse tilbake med tang. Thymus er en hvit, bilobed organ plassert over hjertet. Bruke den flate kanten av pinsett til å ta tak i bunnen av lapper, dra forsiktig thymus og plassere den på mesh-skjermen.
- Høste milten:
- Milten er en rød, surfebrett-formet organ som ligger på venstre side av musens bukhule under leveren.
- Gjør et snitt i bukhulen. Trekk forsiktig ut milten med en pinsett, ved hjelp av det andre paret å erte bort bindevev. Plasser milten på en separat mesh sikt.
2. Celleforberedelsen
- Ved hjelp av et stempel fra en 3 ml sprøyte, slipeorganer inn i mesh skjermen til bare bindevev og fett rester. Skyll mesh med HBSS fra parabolen tre ganger. Bruk en ny stempel for hver vevsprøve.
- Andre alternativer for homogenisering vev kan bli brukt i stedet for denne metoden.
- Telle celler ved hjelp av en hemocytometer.
- Pellet celler ved sentrifugering ved 335 xg i 5 min ved 4 ° C.
- Resuspender splenocyttene i 500 pl ACK lyseringsbuffer (0,15 M NH4Cl, 10 mM KHC0 3, 0,1 mM Na 2 EDTA, pH 7,2) i 10 min ved romtemperatur. Resuspender thymocytter ved 20 x 10 6 celler / ml i FACS-buffer (PBS, 1% FCS, 0,02% natriumazid) og avsatt på is.
- Returner splenocyttene til isotonisitet ved å tilsette 5 ml HBSS. Pellet splenocyttene ved sentrifugering og resuspender ved 20 x 10 6 celler / ml i FACS buffer. Hvis cellene trenger for å forbli sterile, kan du bruke sterilt RPMI + 10% FCS.
3.Farging Cells for flowcytometri
Formålet med denne protokollen er å skissere strategier for analyse av positive og negativ seleksjon ved hjelp wildtype (WT) og HY CD4 mus. For generelle betraktninger om flowcytometri eksperimentell design, anskaffelse, og analyse, henviser vi leserne til en utmerket vurdering av Tung et al. 11
- Aliquot 4 x 10 6 thymocytter pr flowcytometri prøven til hver brønn av en 96-brønns plate, samt en x 10 6 vekt splenocyttene pr kompensasjon kontroll. Hvis du bruker transgene mus, bør du ta en WT mus som en kontroll i eksperimentet.
- Blokkere Fc-reseptorer ved å inkubere celler med anti-CD16/32 (klon 2.4G2) i 10 minutter på is.
- Spin plate på 335 xg ved 4 ° C i 5 min. Fjern lokket og fjerne væske fra brønnene ved å flikke platen en gang, med ansiktet ned i en vask. Resuspender hver brønn i 200 ul FACS-buffer. Gjenta vask.
- Forbered antistoff cocktailer som listet nedenfor, ved hjelp av den optimale konsentrasjon av hvert antistoff basert på fortynning i 200 ul FACS buffer per brønn. Den optimale konsentrasjon av hver antistoff er definert som den laveste konsentrasjon som trengs for å gi den største separasjon av positive og negative populasjoner. Hvis det ikke er negative populasjonen for en gitt antistoff, bør en isotype antistoff være inkludert. Det totale volumet per brønn kan skaleres ned (f.eks til 100 ul per brønn) hvis ønskelig.
- WT thymus: anti-TCRβ, anti-CD4, anti-CD8, anti-CD69 eller anti-CD5, anti-CD24
- HY CD4 thymus: anti-HY TCR (T3.70), anti-CD4, anti-CD8, anti-CD69 eller anti-CD5, anti-CD24
For å oppnå bedre separasjon av CD69 lo og CD69 hi befolkninger i thymocytter, anbefales det at en biotinylert anti-CD69 primære antistoff brukes, etterfulgt av en sekundær flekk inneholdende fluorokrom-konjugert streptavidin. Vi use den samme strategien for CD5 farging.
- Inkuber celler med 200 pl av antistoff cocktail i FACS buffer i 30 min på is i mørket.
- Samtidig med antistoff cocktail farging, beis hver kompensasjon kontroll med et enkelt fluorokromkonjugerte antistoffet. Ideelt, innebærer kompensasjon farging de samme antistoffer som brukes i antistoff cocktail. Imidlertid kan farging for enkelte antigen ikke være mulig for større eksperimenter når mange antigener blir analysert. Derfor er farging for enten anti-CD4 eller anti-CD8 anbefalt grunnet høy ekspresjon av disse antigenene, eller bruk av kompensasjons perler. Flekken i FACS buffer for 30 min på isen i mørket. La én kompensasjon kontroll unstained.
- Vask cellene to ganger med FACS buffer.
- Resuspender celler i FACS buffer og overføring til FACS rør.
- Erverve prøver på flowcytometer. Inkluder oppkjøpet av FSC-A og FSC-W til enllow for dublett diskriminering.
4. Analyse av flowcytometrisystemer Data - Ikke-TCR transgene mus
Vi bruker FlowJo for flowcytometri data analyse. Se Figur 2A for gating strategi for ikke-TCR transgene mus.
- Bruke FSC-A ved SSC, elektronisk gate på "lymfocytt" befolkning.
- Innenfor "lymphocyte" befolkning, bruker FSC-A ved FSC-W til elektronisk gate FSC-W lo befolkningen å utelukke celle dubletter og aggregrates. Dette er den "singlett" gate.
- Bruke hendelsene i "singlet" gate, plot CD8 av CD4. Tegn porter for DN, DP kjedelig, DP lyse, CD4 + CD8 lo, CD4SP og CD8SP populasjoner som avbildet i figur 2B.
- Under CD4SP og CD8SP porter, lage TCRβ av CD24 tomter. Bruk kvadranten gating verktøyet til å tegne porter som vist i figur 2C.
- Lag en new tomten fra "singlet" gate: TCRβ av CD69. Tegn porter A, B, C, D som vist i figur 2D.
- Lag en annen tomt fra "singlet" gate: TCRβ av CD5. Tegn porter I, II, III, IV, som vist i figur 2E. Dette er en annen strategi for behandlingen positiv utvelgelse.
- Påfør DN, DP kjedelig, DP lyse, CD4 int, CD4SP og CD8SP porter fra under «singlett" til porter I, II, III, IV, A, B, C, D (fig. 2D, E).
- Beregne antall celler i en bestemt undergruppe ved å multiplisere organ cellularitet av frekvensen av hver etterfølgende gate til du når målet befolkningen. For eksempel vil antall TCRβ hi CD69-CD8SP thymocytter bestemmes ved thymus cellularitet x% TCR BHI CD69-(fraksjon D) x% CD8SP.
- Telle tar allerede hensyn til levende og døde celler så ikke inkludere "lymphocyte "gate i beregningene.
5. Analyse av flowcytometrisystemer Data - TCR transgene mus
Se Figur 3A for gating strategi for TCR transgene mus.
- Følg trinn 4,1 og 4,2 som i forrige avsnitt.
- Under "singlett" gate, opprette en T3.70 etter SSC plot og gate på T3.70 + cellepopulasjon å analysere antigen-spesifikke T-celler (Figur 3B). I noen tilfeller, kan det være av interesse å sammenligne denne populasjonen til den ikke-antigenspesifikk (T3.70-) T-celle-populasjonen.
- Innenfor T3.70 + befolkningen, tegne DN, DP, CD4SP og CD8SP porter (figur 3C).
- For WT kontrollprøver, tegne disse portene under "singlet" gate eller opprette en T3.70-gate som det vil være svært få T3.70 + celler.
- Under CD8SP gate, opprette enT3.70 av CD24 tomt. Bruk kvadrant gating verktøy for å dele celler i fire populasjoner (figur 3F).
- Lag en overlagt histogram viser CD69 uttrykk i DP kupé av WT mus og T3.70 + DP kupé av HY CD4 mus (figur 4A). Gjenta undersøke CD5 uttrykk (figur 4B).
- Beregning av den absolutte antall celler i hvert delsett av interesse som i 4.8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I fysiologiske TCR transgene modeller og WT mus, begynner positiv utvelgelse på DP lyse scenen før du flytter inn i DP kjedelig scenen etter antigen møte. DP kjedelig thymocytter deretter inn en overgangsperiode CD4 + CD8 lo scenen før han ble CD4SP eller CD8SP thymocytter (figur 2B). Eldre SP thymocytter er preget av høy TCR uttrykk og tap av CD24 (figur 2C). Mens CD8 av CD4 profilen kan avsløre feil i positiv seleksjon, undersøke TCRβ av CD69 eller CD5 kan gi ytterligere innsikt i hvor feilen ligger. Både CD69 og CD5 er oppregulert etter TCR stimulering, med sterkere samhandling kjører høyere uttrykk av disse markørene.
På TCRβ av CD69 tomten, gate A (TCRβ lo CD69-) representerer en befolkning på pre-utvalg DP thymocytter, gate B (TCRβ int CD69 +) representerer en transitional befolkningen rett etter TCR engasjement, gate C (TCRβ hi CD69 +) representerer populasjonen av celler direkte etter positiv seleksjon, og gate D (TCRβ hi CD69 -) representerer en mer moden populasjon av celler (figur 2D). I en WT mus, gate A består av DP lyse cellene, mens port b består i hovedsak av DP lyse med noen DP kjedelig og CD4 + CD8 lo celler. Gate C består hovedsakelig av DP kjedelig, CD4 + CD8 lo og CD4SP celler, mens gate D består i hovedsak av CD4SP og CD8SP. Fravær av befolkningen B og C kan være en indikasjon på svekket positiv utvelgelse. Endringer i forholdet mellom CD4SP til CD8SP innen befolkningen D kan foreslå endringer i avstamning engasjement. Tapet av populasjoner C og D kan gjenspeile overlevelse problemer etter positiv utvelgelse.
Undersøke TCRβ av CD5 er en annen strategi to identifisere pre-og post-positive utvalg populasjoner. Befolkning i (TCRβ lo CD5 lo) representerer pre-valg DP thymocytter og befolkningen ii (TCRβ lo CD5 int) er celler initiere positiv utvelgelse (figur 2E). Disse populasjonene består hovedsakelig av DPbright thymocytter. Befolkning iii (TCRβ int CD5 hi) representerer thymocytter i prosessen for å gjennomgå positiv utvelgelse og består i hovedsak av DP kjedelig og CD4 + CD8 lo thymocytter. Befolkning iv (TCRβ hi CD5 hi) består i hovedsak av post-positive utvalg SP thymocytter. Svekket generasjon av befolkningen II og III antyder defekt positiv utvelgelse. Endringer i forholdet mellom CD4SP til CD8SP innen befolkningen iv tross for normal foregående populasjoner kan foreslå endringer i avstamning engasjement. Et fravær av befolkningen iv kan indikere redusert overlevelse etter positive selecsjon. For eksempel, i Tox - / - mus, fører defekt CD4SP differensiering til en drastisk reduksjon i populasjoner iv, C og D, mens positiv utvelgelse forblir intakt 12. Sanne defekter i positiv utvelgelse kan sees med Bcl11b inaktivering under DP scenen, noe som fører til tap av bestander B, C og D 13,14. RasGRP1-mutante mus har en tidligere defekt i positiv seleksjon, som resulterer i nærvær av bare populasjon (upubliserte data).
Som negativ seleksjon innebærer sletting av små antigen-spesifikke populasjoner, er defekter i denne prosessen best observert med TCR transgene mus. I HY CD4 mus kan thymocytter uttrykker transgene HY TCR påvises med det monoklonale antistoff T3.70 (figur 3B). HY TCR anerkjenner den mannlige-spesifikke HY antigen fremmes innen MHC klasse ID b. Dermed HY CD4 mannlige (M) mus gjennomgår negative utvalg av HY TCR
En påminnelse av TCR transgene modeller er at den transgene TCR er uttrykt sterkt gjennom thymocyte utvikling. Som et resultat, er det vanskelig å ytterligere karakterisere positiv utvelgelse ved å identifisere populasjoner basert på TCR og CD69/CD5 uttrykk. Men korrelerer CD69 og CD5 uttrykk gjøre med styrken av TCR signalering. I WT mus, de fleste DP thymocytter ikke gjennomgår positive eller negative valg, som krever TCR engasjement pMHC, og dermed ikke upregulate CD69 eller CD5. HY CD4 F mus har en stor populasjon av T3.70 + DP thymocytter som gjennomgår positiv utvelgelse, som indikert av en økning i CD69 + populasjonen sammenlignet WT (figur 4A). Negativ seleksjon innebærer en høyere affinitet TCR stimulans enn positiv utvelgelse, dette vises ved høyere uttrykk av CD69 på T3.70 + DP thymocytter i HY CD4 M mus, noe som resulterer i en forskyvning of histogrammet topp til høyre. Lignende trender er sett med CD5 uttrykk (figur 4B). Ved å analysere thymic utvalg i genetisk manipulerte mus, undersøke CD69 eller CD5 uttrykk kan avgjøre om mangelen ligger hos TCR signal eller en nedstrøms utfallet av TCR stimulering.
Figur 1. Generelle ordningen med den eksperimentelle protokollen.
Figur 2. Analysere thymic utvalg i ikke-TCR transgene mus. (A) Gating strategi for å analysere thymisk utvalg i ikke-TCR transgene mus. (B) CD8 av CD4 profilen til en WT thymus. (C) Undersøke forfall av SP thymocytter av TCRβ og CD24 uttrykk. (D) Stadier av positiv utvelgelse kan være preget avCD69 etter TCRβ uttrykk sammen med CD8 og CD4 profilerer i hver undergruppe. (E) TCRβ av CD5 er en annen strategi som kan brukes til å skille utviklingsstadier. Klikk her for å se større figur .
Figur 3. Analysere thymic utvalg i HY CD4 mus. (A) Gating strategi for å analysere thymic utvalg i TCR transgene mus. (B) Hyppigheten av thymocytter uttrykker HY TCR (T3.70 +) i WT, HY CD4 F og HY CD4 M mus. (C) CD8 etter CD4 profiler av T3.70 + populasjonen på angitte mus. I tillegg til frekvenser, det absolutte antallet T3.70 + DP (D) og spesielt T3.70 + CD8SP (E) thymocytter er viktige indikatorer for negativ seleksjon. (F) Undersøkeløpetid på CD8SP thymocytter i angitte mus. Klikk her for å se større figur .
Figur 4. Expression of aktivering markører CD69 (A) og CD5 (B) på totalt DP thymocytter fra WT og T3.70 + DP thymocytter fra HY CD4 F og HY CD4 M mus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen presenteres her kan brukes til å undersøke positiv og negativ seleksjon i ikke-TCR transgene og TCR transgene mus. Denne protokollen beskriver farging av overflateantigener. For ytterligere analyse av molekylære mekanismer, er det ofte nødvendig å utføre intracellulær farging. Vi bruker BD Biosciences Cytofix / Cytoperm Kit for de fleste intracellulære proteiner og BD Biosciences Foxp3 Staining Kit for transkripsjonsfaktorer. Vi vanligvis skaffe våre prøver umiddelbart etter farging. Imidlertid kan prøvene oppbevares over natten i FACS buffer med 1% formaldehyd ved 4 ° C i mørke. Vær oppmerksom på at enkelte fluorokromer og antistoffer ikke kan være kompatible med fiksering.
For analyse av positiv utvelgelse, anbefaler vi at du bruker biotinylert anti-CD69 eller anti-CD5 å gi bedre separasjon av negative, middels og høyt uttrykke populasjoner (figur 2). Som beskrevet i Representant Resultater,Dette gating strategien vil hjelpe skille defekter i positiv utvelgelse fra avstamning engasjement, som de to kan kreve ulik oppfølging. I tillegg til produksjon av modne SP thymocytter, kan positiv utvelgelse bekreftes ved oppregulering av IL-7Rα og CCR7. Imidlertid er disse markørene uttrykkes på et lavt nivå på post-valg DP thymocytter sammenlignet SP thymocytter 15,16. For detaljert analyse av modning stadier innenfor DP kupeen, kan intracellulær Zap70 uttrykk måles 17. Dette kan være spesielt nyttig i å demonstrere at populasjoner med liknende uttrykk for modning markører, for eksempel I og II på TCRβ x CD5 tomten (figur 2E), representerer ulike stadier av utviklingen.
HY CD4 modellen har fordelene av representerer både positive og negativ seleksjon, samt fysiologisk uttrykk av transgene TCR. Imidlertid, kan disse metodene brukes tilandre TCR transgene modeller med visse hensyn. Alltid omfatte et antistoff mot den transgene TCR av valget for å muliggjøre undersøkelse av antigen-spesifikke T-celler. For enkelte analyser, kan det være av interesse å sammenligne det antigen-spesifikke befolkningen til den ikke-spesifikke populasjon som en intern kontroll. Studerer negativ seleksjon i andre TCR transgene modeller krever ytterligere hensyn. Stadium av thymocyte utvikling der negativ seleksjon foregår varierer mellom de ulike TCR transgene modeller. HY CD4 thymocytter engasjere pMHC på DP stadium, således analyse av HY-spesifikke CD8SP avkom befolkningen er riktig avlesning for negativ seleksjon 10,18 (fig. 3). Hvis negativ seleksjon oppstår under DN til DP overgang som i klassiske HY mus 19, ville analysen av interesse være tilstedeværelse eller fravær av antigen-spesifikke DP thymocytter. Seleksjon mot den allestedsnærværende HY antigenet oppstår i thymiskcortex 20. I kontrast, oppstår negativ seleksjon mot vev-bundne antigener i thymisk medulla 21,22. OT-I RIP-mOva mus rekapitulere denne type seleksjon som Ova antigenet uttrykkes under kontroll av den rotte insulin promotoren, som er aktiv bare i thymisk medulla og bukspyttkjertelen 23. Siden positiv utvelgelse av DP thymocytter i thymic cortex er første kreves for innvandring til medulla, fravær av modne (CD24 lo) OT-I TCR + CD8SP thymocytter indikerer vellykket negativ seleksjon i OT-I Rip-mOva mus 24.
Mens bruk TCR transgene mus har fordelen av å være i stand til å studere en stor populasjon av antigenspesifikke celler, er en potensiell påminnelse endret T celle utvikling grunnet begrenset ligander som kan formidle positiv og negativ seleksjon av transgene TCR. I RAG-tilstrekkelige HY CD4 mus, er en annen påminnelse at co-uttrykk for endogenous TCRα kjedene har potensial til å modulere positiv og negativ seleksjon på et mindretall av HY TCR + thymocytter. Dette forbeholdet er ikke unik for HY CD4-modellen, men snarere TCR transgene modeller generelt. De representative HY CD4 presenteres er hentet fra HY CD4 mus på en Rag-tilstrekkelig bakgrunn. Selv om noe mer komplisert i naturen, er det mange måter å studere thymocyte utvalg i en mer fysiologisk innstilling av begrenset forløper frekvens. For eksempel, kan TCR transgene og WT blandede beinmargen chimeras genereres for å redusere det antigen-spesifikke thymocyte forløper frekvens. Tillegg kan man bruke mus som uttrykker bare en transgen TCRβ kjede, eksempel Vb8 kjede av HY TCR 25 eller VB5 kjede av OT-I TCR 26 å begrense forløper frekvens. Fordi transgene TCRβ kjeden er sammenkoblet med ulike endogene TCRα kjeder, sporing av antigen-spesifikke thymocytter rekrever bruk av pMHC tetramers. En begrensning ved denne metoden er at TCR uttrykk er for lavt på DP thymocytter å tillate deteksjon med tetramerer. Dette begrenser videre studier av de molekylære mekanismer i DP thymocytter som fører til positive og negative valg. Mer nylig har en kombinasjon av pMHC tetramerer og magnetiske bead berikelse blitt brukt til å nummerere små, antigen-spesifikke populasjoner av CD4 + T-celler i mus unmanipulated 27.
Negativ seleksjon er i hovedsak mediert av klonal sletting av selvreaktive thymocytter via den iboende apoptose veien. Apoptotiske thymocytter kan oppdages ved strømningscytometri hjelp intracellulær farging for spaltet caspase-3. Den BH3-Bare Bcl-2 familiemedlem Bim er avgjørende for kaspase-3 aktivering i thymocytter i respons til TCR stimulering 18,28. Ved å krysse Bim-mangelfull mus til forskjellige TCR transgene modeller, har vår lab fant at Bim er nødvendig for negativ selecsjon mot allestedsnærværende selv-antigener, men ikke vev-restricted antigener, som indikerer eksistensen av flere negative seleksjonsmekanismer 18,29. Lignende tilnærminger har impliserte foreldreløs steroid reseptor Nur77 som en annen viktig formidler av thymic negativ seleksjon 30,31. Transcriptional analyse av DP thymocytter fra HY CD4 mus har generert en liste av gener spesifikt induserte under positiv og negativ seleksjon 32. Anvende metodene som presenteres her til mus manipulert i disse genene kan gi innsikt i de molekylære mekanismene for thymic utvalg.
Det er ideelt å følge opp undersøkelse av thymic utvalg med en analyse av det perifere immun kupé. Imidlertid er det ofte vanskelig å skille sentrale og perifere sletting. Negativ seleksjon er slutt reflektert av fravær av autoimmunitet. Selv om de har begrensninger, TCR transgene mus er et kraftig og praktisk måte åstudere fysiologiske negativ seleksjon. Crossing TCR transgene mus til mus som mangler bestemte gener er en effektiv måte å undersøke de molekylære mekanismene for negativ seleksjon. Det er viktig å være klar over, kan imidlertid som perifer betennelse grunnet en gen defekt forårsake uspesifikk thymocyte sletting mediert av kortikosteroider og cytokiner 7-9. I slike tilfeller kan den strategi presenteres her bli brukt til analyse av Thymi fra neonatale mus før utbruddet av betennelse. Positiv utvelgelse, på den annen side, kan studeres i enten TCR-eller ikke-TCR transgenic modeller, sparer undersøkere problemene i crossbreeding. En bedre forståelse av molekyler involvert i positiv og negativ seleksjon vil føre til nye strategier for diagnostisering og behandling av autoimmune og immunsvikt lidelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke Bing Zhang for hans teknisk assistanse. Dette arbeidet ble finansiert av kanadiske Institutes for Health Research (MOP-86595). TAB er en CIHR New Investigator og AHFMR Scholar. QH er støttet av en CIHR Canada Graduate Scholarship - Doctoral og en AIHS heltid studieplass. SAN er støttet av en dronning Elizabeth II Graduate Scholarship. AYWS støttes av en NSERC Postgraduate stipend - Doctoral.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HyClone Hank's balanced salt solution | Thermo Scientific | SH30030.02 | |
| Metal mesh screens | Cedarlane | CX-0080-E-01 | |
| Petri dishes (60 x 15 mm) | Fisher Scientific | 877221 | |
| Syringes (3 ml) | BD Biosciences | 309657 | |
| Conical tubes (15 ml) | Sarstedt | 62.554.205 | |
| Microscope | Zeiss - Primo Star | 415500-00XX-000 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3110 | |
| 96-well plate | Sarstedt | 82.1582.001 | |
| Multichannel pipette | Fisherbrand | 21-377-829 | |
| Fetal calf serum | PAA | A15-701 | |
| Phosphate buffered saline | Fisher Scientific | SH3025802 | |
| Sodium azide | IT Baker Chemical Co. | V015-05 | |
| FcR blocking reagent | Clone 2.4G2 | ||
| Anti-mouse HY TCR | eBioscience | XX-9930-YY* | Clone T3.70 |
| Anti-mouse CD4 | eBioscience | XX-0042-YY* | Clone RM4-5 |
| Anti-mouse CD8α | eBioscience | XX-0081-YY* | Clone 53-6.7 |
| Anti-mouse CD24 | eBioscience | XX-0242-YY* | Clone M1/69 |
| Anti-mouse TCRβ | eBioscience | XX-5961-YY* | Clone H57-597 |
| Anti-mouse CD69 Biotinylated | eBioscience | 13-0691-YY* | Clone H1.2F3 |
| Anti-mouse CD5 Biotinylated | eBioscience | 13-0051-YY* | Clone 53-7.3 |
| Streptavidin | eBioscience | XX-4217-YY* | |
| Flow cytometer | BD Biosciences - FACS Canto | 338962 | |
| FACS tubes | BD Biosciences | 352052 | |
| Flow cytometry analysis software | TreeStar - Flowjo | FlowJo v7/9 | |
| HyClone RPMI - 1640 medium | Thermo Scientific | SH30027.01 | |
*XX varies by fluorochrome and YY varies by vial size. |
|||
References
- Liston, A., Lesage, S., Wilson, J., Peltonen, L., Goodnow, C. C. Aire regulates negative selection of organ-specific T cells. Nat. Immunol. 4, 350-354 (2003).
- Liston, A. Gene dosage--limiting role of Aire in thymic expression, clonal deletion, and organ-specific autoimmunity. J. Exp. Med. 200, 1015-1026 (2004).
- Hogquist, K. A., Baldwin, T. A., Jameson, S. C. Central tolerance: learning self-control in the thymus. Nat. Rev. Immunol. 5, 772-782 (2005).
- Liston, A., Enders, A., Siggs, O. M. Unravelling the association of partial T-cell immunodeficiency and immune dysregulation. Nat. Rev. Immunol. 8, 545-558 (2008).
- Starr, T. K., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of T cells. Annu. Rev. Immunol. 21, 139-176 (2003).
- McCaughtry, T. M., Hogquist, K. A. Central tolerance: what have we learned from mice. Seminars in immunopathology. 30, 399-409 (2008).
- Zhan, Y. Without peripheral interference, thymic deletion is mediated in a cohort of double-positive cells without classical activation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 1197-1202 (2003).
- Brewer, J. A., Kanagawa, O., Sleckman, B. P., Muglia, L. J. Thymocyte apoptosis induced by T cell activation is mediated by glucocorticoids in vivo. J. Immunol. 169, 1837-1843 (2002).
- Martin, S., Bevan, M. J. Antigen-specific and nonspecific deletion of immature cortical thymocytes caused by antigen injection. European journal of immunology. 27, 2726-2736 (1997).
- Baldwin, T. A., Sandau, M. M., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. The timing of TCR alpha expression critically influences T cell development and selection. J. Exp. Med. 202, 111-121 (2005).
- Tung, J. W. Modern flow cytometry: a practical approach. Clinics in laboratory medicine. 27, 453-468 (2007).
- Aliahmad, P., Kaye, J. Development of all CD4 T lineages requires nuclear factor TOX. J. Exp. Med. 205, 245-256 (2008).
- Kastner, P. Bcl11b represses a mature T-cell gene expression program in immature CD4(+)CD8(+) thymocytes. Eur. J. Immunol. 40, 2143-2154 (2010).
- Albu, D. I. BCL11B is required for positive selection and survival of double-positive thymocytes. J. Exp. Med. 204, 3003-3015 (2007).
- Van De Wiele, C. J. Thymocytes between the beta-selection and positive selection checkpoints are nonresponsive to IL-7 as assessed by STAT-5 phosphorylation. J. Immunol. 172, 4235-4244 (2004).
- Ueno, T. CCR7 signals are essential for cortex-medulla migration of developing thymocytes. J. Exp. Med. 200, 493-505 (2004).
- Saini, M. Regulation of Zap70 expression during thymocyte development enables temporal separation of CD4 and CD8 repertoire selection at different signaling thresholds. Science signaling. 3, ra23 (2010).
- Hu, Q., Sader, A., Parkman, J. C., Baldwin, T. A. Bim-mediated apoptosis is not necessary for thymic negative selection to ubiquitous self-antigens. J. Immunol. 183, 7761-7767 (2009).
- Kisielow, P., Bluthmann, H., Staerz, U. D., Steinmetz, M., von Boehmer, H. Tolerance in T-cell-receptor transgenic mice involves deletion of nonmature CD4+8+ thymocytes. Nature. 333, 742-746 (1988).
- McCaughtry, T. M., Baldwin, T. A., Wilken, M. S., Hogquist, K. A. Clonal deletion of thymocytes can occur in the cortex with no involvement of the medulla. J. Exp. Med. 205, 2575-2584 (2008).
- Derbinski, J., Schulte, A., Kyewski, B., Klein, L. Promiscuous gene expression in medullary thymic epithelial cells mirrors the peripheral self. Nat. Immunol. 2, 1032-1039 (2001).
- Anderson, M. S. Projection of an immunological self shadow within the thymus by the aire protein. Science. 298, 1395-1401 (2002).
- Kurts, C. Constitutive class I-restricted exogenous presentation of self antigens in vivo. J. Exp. Med. 184, 923-930 (1996).
- Nitta, T., Nitta, S., Lei, Y., Lipp, M., Takahama, Y. CCR7-mediated migration of developing thymocytes to the medulla is essential for negative selection to tissue-restricted antigens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 17129-17133 (2009).
- Bouneaud, C., Kourilsky, P., Bousso, P. Impact of negative selection on the T cell repertoire reactive to a self-peptide: a large fraction of T cell clones escapes clonal deletion. Immunity. 13, 829-840 (2000).
- Gallegos, A. M., Bevan, M. J. Central tolerance to tissue-specific antigens mediated by direct and indirect antigen presentation. J. Exp. Med. 200, 1039-1049 (2004).
- Moon, J. J. Naive CD4(+) T cell frequency varies for different epitopes and predicts repertoire diversity and response magnitude. Immunity. 27, 203-213 (2007).
- Bouillet, P. BH3-only Bcl-2 family member Bim is required for apoptosis of autoreactive thymocytes. Nature. 415, 922-926 (2002).
- Suen, A. Y., Baldwin, T. A. Proapoptotic protein Bim is differentially required during thymic clonal deletion to ubiquitous versus tissue-restricted antigens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2012).
- Calnan, B. J., Szychowski, S., Chan, F. K., Cado, D., Winoto, A. A role for the orphan steroid receptor Nur77 in apoptosis accompanying antigen-induced negative selection. Immunity. 3, 273-282 (1995).
- Zhou, T. Inhibition of Nur77/Nurr1 leads to inefficient clonal deletion of self-reactive T cells. J. Exp. Med. 183, 1879-1892 (1996).
- Baldwin, T. A., Hogquist, K. A. Transcriptional analysis of clonal deletion in vivo. J. Immunol. 179, 837-844 (2007).
