Summary
intranasally 뇌를 타겟팅의 목적을 위해 깨어 마우스로 약물을 투여하는 방법이 설명되어 있습니다. 이 방법은 긴 마취없이 약물의 비강 관리를 사용하는 기간, 그리고 최소한의 전신 노출과 코 - 투 - 뇌 전달을 통해 주입 반복 할 수 있습니다.
Abstract
비강 관리는 중추 신경계 (CNS)에 치료 에이전트를 전달하는 방법입니다. 이 비 침습적이며, CNS에 혈액 - 뇌 장벽 접속을 통과하지 않는 큰 분자를 할 수 있습니다. 약물 직접 전신 노출되므로 원치 않는 조직 부작용 1 감소, 비강 배달 CNS를 타겟으로하고 있습니다. 코에서 CNS에 배달 세포 경로를 통해 후각과 삼차 신경 경로 모두 함께 분 이내에 발생하고 수용체 또는 axonal 교통이에 바인딩하는 약물을 필요로하지 않습니다. 비강 배달 널리 알려진 방법입니다 현재 인간의 임상 실험 3에서 사용하고 있습니다.
동물 모델에서 약물 비강 배달 pharmacokinetic 유통 및 효능 초기 평가 할 수 있습니다. 마우스로는 specia를 사용하여 정기적으로 깨어 (비 anesthetized) 동물 의약품을 관리 할 수 있습니다비강 손잡이를 lized. 는 마취없이 장기 만성 주입이 가능하기 때문에 깨어 배달이 유용합니다, 그 마취와보다 시간이 적게 소요되며, 많은 사람들이 배우고 수행 할 수 있도록 짧은 기간의 생쥐의 기술자의 팀이 할 수있는 복용량 많은 수의. 마우스에이 방식으로 intranasally 관리 치료학의 효능이 당뇨 마우스 모델 알츠하이머의 마우스 모델에서 4-6와 deferoxamine의 인슐린 등의 연구 번호를 입증되었습니다. 7,8
마우스의 비강 그립이 알게하지만, 쉽지 않다 연습, 기술, 그리고 효율적으로 뇌에 약물을 전달하고 폐와 위장 배수를 방지 할 수있는 정확한 그립을 필요로 할 수 있습니다. 마우스는 약물이 지배적 인 손을 사용하여 pipettor와 함께 제공되는 동안, 바닥에 평행 개최 된 목 비 지배적 인 손에 수정 안녕하세요,를 사용하여 손으로 막았 있습니다. 그것은 일반적으로 마우스 전에 처리에 acclimating 3-4 주 정도 소요스트레스 반응없이이 그립 개최 할 수 있습니다. 이 비강 전달 기술에 더 쉽게 액세스 할이 목성 동영상을 준비했습니다.
Protocol
1. 깨어 마우스로 비강 투여에 대한 처리에 Acclimation
소개
마우스는 비강 주입의 발병하기 전에 2-4주 기간 동안 처리에 적응해야합니다. 그 깨어 비강 약물 전달의 최대 효율성에 대한 올바른 자세를 보장하는 데 도움이 같은 취급을 Acclimation이 중요합니다. 또한, 제대로이 과정에 익숙해되지 않은 마우스는 주입 후 심한 불안 반응을 할 수 있습니다. 마우스는 취급에 동물의 편안함에 따라 다음 단계로 진행하기 전에 9 단계의 각각에 2~3일에 대해 지출해야합니다. 마우스의 스트레스 수준은 진행의 척도로 활용해야합니다. 이, 배뇨, 깨끗하게 함의 양 / 빈도를 마우스의 움직임을 모니터링 떨면서하고, 물고 의미합니다. 마우스가 스트레스 반응이있는 경우 응답이 감소 될 때까지 다음으로 진행하기 전에 해당 단계에있어. 샘플 acclimation SCHedule는 표 1에서 볼 수 있습니다. 마우스 Acclimation는 다음 번 하루 단계를 진행해야합니다. , acclimation을 촉진 할 목적으로, 하루에 한 번 이상 다음 단계를 수행하는 것은 권장하지 않습니다.
- 동물이 자주이 입문 단계에서 점프로, 더 이상보다 발 케이지 맨 위하려면 둘이 3 분 동안 손바닥에 마우스를 놓습니다. 마우스는 손에서 크롤링하여 사람의 팔을 위로, 단순히 꼬리의 기지에 의해 마우스를 들고 사람의 손에 다시 배치하려고합니다.
- 3 분 손바닥에 마우스를 놓고 부드럽게 동물을 애완 동물. 동물이 자유롭게 대한 이동할 수 동안 꼬리에 머리에서 directionally 마우스를 애완 동물.
- 귀 (가볍게 엄지와 포인터 손가락을 사용하여 목 뒷면의 피부를 함께 곤란) 뒤에 마사지하면서 3 분 손바닥에서 마우스를 놓습니다.
- 리 / 기다려다시 보류를 반복하기 전에 30 초 동안 케이지 상단에 마우스 나머지 주셔서, 30 초에 목이 안녕하세요, 마우스를 피트
- 2 절에서 설명되어있는 비강 그립을 사용하여 마우스를 잡고 있지만, (2.4 단계까지 완료) 동물을 반전하지 않습니다. 30 초 동안이 같은 동물을 잡고 케이지 상단에 다시 놓습니다. 1 분 휴식 기간 이후 두 번째를 반복합니다.
- 그 복부 쪽이 천정쪽으로 향한 될 수 있도록 버팅 동물을 포함하여 2 절에서 설명 된대로 비강 그립으로 마우스를 잡아. 동물의 목은 바닥에 평행해야합니다. 30 초이 위치를 잡아. 이에게 1 분 휴식 기간 이후 두 번째를 반복합니다. 일부 마우스는 acclimation이 단계에서 반전과 함께 처음 사용 특히 더 다른 사람보다 비강 그립을 거부합니다. 마우스가 그립에서 자신을 해방 경우, 케이지 상단과 다시 그립에 다시 마우스를 넣어. 필요한 경우 다시 그립을 반복하지만, 마우스의 스트레스 수준을 모니터링하고 우리를 필요한 경우에 반환합니다. acclimation 과정에서이 시점에서 그립을 잃는 역할을 재생할 수 있습니다 또 다른 요인은 비강 전달 기술로 동물 핸들러의 무경험입니다.
- 비강 그립으로 마우스를 잡고, 반전, 간단히 각 콧 구멍 저기 빈 팁과 pipettor을 배치하고, 30 초 동안 동물 위치를 고수하라. 1 분 휴식 기간 동안이 과정을 반복합니다.
- 비강 그립으로 마우스를 잡고, 그것을 반전하고, 제 3 항 (단계 3.7 일)에 설명 된대로 intranasally 왼쪽과 오른쪽 n 계속에 생리 6 μl를 관리 할 수 있습니다.
- 그 반대로, 비강 그립으로 마우스를 잡고 있으며, intranasally 제 3 절에 설명 된대로 왼쪽과 오른쪽 n 보정을 두 번 사이에 케이지 상단에 다시 동물을 배치에 생리 6 μl를 관리 할 수 있습니다.
2. 깨어 마우스를 고정 할 수있는 비강 그립
- 마우스 O를 배치N 케이지가 최고 다.
- 당신의 지배적 인 손 엄지와 검지 손가락으로 꼬리에 마우스를 누르고 있습니다. 가운데, 링, 그리고 새끼 손가락을 사용하여 가볍게 케이지 상단 (그림 1A)에 몸의 낮은 부분을 핀. 당신은 가볍게 마우스를 확장하고 더 나은 안녕하세요,을 움켜로 마우스가 바로 잡아 보자.
- 비 지배적 인 손에 엄지와 가운데 손가락을 사용하여 목과 어깨 뒤의 비듬 (초과 피부)에 단단히 마우스를 꼬집어. 어깨 블레이드 (그림 1B)에서 피부의 텐트를 만들기 위해 느슨한 피부에 올려. 가능한 한 많은 피부로 가져가하지만,이 마우스에 불편 함을 야기하므로 근육을 당겨하지 않도록주의하십시오. 주의, 너무 동물의 흉곽 또는 척추에 너무 많은 압력을 적용 할 수 없습니다. 피부의 과도한 압력이나 당기는 경우에 따라 호흡의 억제로 이어질 수 있습니다.
- 빨리 마우스의 머리에 비 지배적 인 손의 검지 손가락을 배치가능한 코에 닫고 피부 (그림 1C, 1D)에 다시 당긴다. 동시에, 최적의 위치에 대한 머리쪽으로 엄지와 가운데 손가락을 밀어 넣습니다. 이상적으로, 마우스는 수직 또는 수평으로 머리를 이동 할 수 없습니다.
- 안녕하세요,에 그립을 유지하면서, 그의 뒤를에 마우스를 켜십시오. 마우스의 뒷면은 손바닥에 있어야합니다. 단단히 마우스를 안정화하기 위해 마지막 두 손가락 (링과 분홍색)을 손바닥에 대해 마우스의 꼬리 (베이스 근처) 개최하거나 하체 (그림 1E, 1F)에서 손가락을 래핑 할 수 있습니다.
- 이 시점에서 마우스의 목 및 턱은 평평하고 바닥에 평행 있는지 확인하십시오. 턱은 목을 최대한 비강 전달을 지원하기 위해와 180도 각도에 인접해야합니다. 각도에 약간의 변화가 잘못된 사이트에서 종료 약물을 일으킬 수 있습니다. 마우스가 복부를 보며하여 호흡 할 수 있는지 확인하십시오. 마우스 우uld 이동 할 수 있지만 고통을 편안하고 안해야 없습니다. 당신이 "V"를 만드는 마우스의 목 및 턱을 볼 경우, 당신은 다시 그립해야 할 것입니다.
3. 깨어 마우스로 약물의 비강 배달
소개
비강 그립을 사용하여, 각 마우스 두 번 막았와 액체의 20-30 μl의 볼륨을 관리하는 동안 바닥에 평행 자신의 목 개최됩니다. 이 볼륨은 안전하고 작은 대형 마우스의 효과이며 우리는 일반적으로 24 μl를 사용하며,이 프로토콜에 설명되어 그. 깨어있는 비강 방법은 발달 신경 과학 연구를위한 신생아 쥐 예를 들어, 어떤 나이의 마우스에서 사용할 수 있습니다. 신생아 쥐에서 작은 총 볼륨 (8 μl)와 액적 크기 (1 μl)은 비강의 작은 볼륨을 수용하는 데 사용되어야합니다. 약물은 일반적으로 시간을 최대한 효율적으로 사용하고 O를 유지 휴식 기간을 번갈아 가며 한 번에 두 마우스로 배달됩니다N 일정. 설정은 그룹 자리 잡고 마우스 또는 개별적으로 자리 쥐를 주입하는 경우에 따라 약간 다를 수 있습니다. 개별적으로 자리 쥐와 함께, 그것은 다른 케이지 상단으로 교차에서 쥐를 방지하기 위해 케이지 사이에 자료를 모두 배치 할 도움이 될 것입니다. 만 해당 케이지에서 그룹 자리 잡고 마우스, 복용. 이 그룹 자리 잡고 케이지에서 각 마우스 같은 비강 치료를받는 두 가지 트리트먼트 교차 오염 가능성으로 공중으로 또는 피부 접촉 약물 추방으로 인해 존재하는 것이 중요합니다. 그것은 높은 각 동물의 일반적인 건강 등을 참고하기 위해 놓친 물방울의 정보를 기록, 치료 과제의 기술을 생각 나게하는 주입 시트가 사전에 인쇄 할 것을 권장합니다
단계
- 그들은 주입하실 수 있으며, 주입 역 (그림 2)을 설정해야합니다 새장을 설정합니다.
- 케이지에서 마우스를 제거하고 주입하는 동안 케이지 상단에 유지.
- 2 절에서 설명 된 비강 그립을 사용하여 마우스를 선택합니다.
- 당신의 지배적 인 손 사용, 약물 또는 차량 6 μl로 pipettor를로드합니다. 보통 45도 각도 (그림 1G, 1H)에서 마우스의 왼쪽 콧 구멍 근처에 가득 pipettor의 끝을 놓으십시오. 당신은 점성 해결책을 가지고있는 경우 약물 대신 드롭을 만드는 피펫 팁의 측면을 실행할 수 있기 때문에 당신이 90도에 각도를 증가해야 할 수 있습니다. 매우 점성 경우, 액체를 추방하기 전에 조직과 피펫 팁을 닦는 것이 도움이 될 수 있습니다. 천천히 볼륨의 약 절반 (3 μl)와 작은 물방울을 형성 할 수있는 약물을 꺼냅니다.
- 마우스가 비말을 흡입 할 수 있도록 비말은 충분히 마우스의 콧 구멍에 배치해야합니다. 마우스가이 작은 드롭 이거 봐 후 즉시 나중에 2-3 초에 대해 동일한 콧 구멍을 통해 흡입하는 마우스의 또 다른 작은 물방울을 형성하기 위해 피펫 팁에 약물의 나머지를 꺼냅니다. 입 조심을해야합니다. 만약이 전S 입에 액체가 드롭 코에 완전히하지 않은이는 주목해야한다.
- 15 초이 위치에 마우스를 잡아. 그것은 매우 타이머이 15 초 보류를 표준화하는 데 사용하는 것이 좋습니다.
- 3.6 오른쪽 콧 구멍에 - 단계 3.3를 반복합니다. 어떤 물방울이 아웃 코로하는 경우 해당 드롭 교체하고 주목해야한다.
- 2 분 동안 자신의 새장의 상단에 다시 마우스를 놓습니다. 2 분을 시작 전체 과정을 반복합니다. 첫 번째 드롭 배달 후. 이 마우스에게 6 μl 솔루션을 24 μl에 달하는 각 네 개의 방울을 제공합니다. 한 번에 하나 또는 두 개의 마우스를 주입하기위한 샘플 일정은 표 2에 볼 수 있습니다.
- 마우스가 모든 방울을받은 후에는 새장에 마우스를 반환합니다.
4. 깨어 마우스로 Acclimation 의약품의 비강 배달 일반 동물 처리 기술
각 acclimation 또는 비강 주입 세션 후, 마우스주고해야NA는 긍정적 인 강화와 같은 거라거나 껍질을 벗겨 해바라기 씨 등 취급. 간식은 보상 잠재적으로 자신에게 부상의 원인이 자신의 코를 긁적에서 그들을 방해하는으로 부여됩니다. 그룹 자리 잡고 마우스로 작업 할 때, 충분한 간식은 각 마우스에 떨어진해야합니다. 자신의 새장에 동물을 반환하기 전에 스트레스를 줄이기 위해 원래 상태로 둥지를 복원해야합니다. 그룹 자리 잡은 동물을 주입하면, 장갑들은 서로를 향해 적극적으로하게 될 것 케이지의 주입하면 수 있도록, 케이지 식민지에서 케이지 식민지에 향기를 전송하지 사이에 변경해야합니다.
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Representative Results
약물 전달의 효능을 결정하는 방법에는 여러 가지가 있습니다. 첫 번째는 intranasally 인도 잉크 또는 메틸렌 블루 등의 염료를 관리하고 후각 상피 내에있는 동물의 안락사 후에 후 뇌 소공 질의 판을 통해 CNS를 입력 제거 염료를 시각화하는 것입니다. 두 번째는 라디오 라벨 태그를 사용하거나 라벨이없는 분자의 엘리사 감지를 사용하여 하나 전달 약물을 측정하는 것입니다. 깨어있는 마우스에 투여 한 후 CNS의 마약 유통의 좋은 예는 핸슨 외에서 찾을 수 있습니다. 2,012 7. 우리는 후각 망울과 삼차 신경이 전달 약물의 높은 농도를 포함 할 예정입니다. 3.65 μmol의 deferoxamine의 비강 투여 후 30 분에서, 삼차 신경과 후각 신경의 농도는 각각 29 μM과 13 μM이었다. 약물 농도 (이 예에서이 울렸다 뇌의 모든 영역에 걸쳐 분명합니다4.1 μM로 0.6 μm의 전자는 후각과 삼차 신경의 입력을받는 영역에서 높은 농도로) 측정되었다. 예를 들어, 피질의 뱃 부리 장식이있는 지역 midbrain 또는 골수보다 높은 농도를 포함 꼬리 피질과 폰스보다 높은 농도를 포함합니다. 척추 요추 척추 자궁 경부에서 내림차순 농도 기울기는 일반적으로 (이 예에서 2.0 μM 1.5 μm의 기울기) 관찰된다. 비강 관리 또한 meninges 및 경부 림프절에 도달 약물의 높은 농도에 결과를 표시합니다. 배달의 효능을 설명하는 세 번째 방법은 관리 약물에 대한 행동 또는 생화학 반응을 측정하는 것입니다. 예를 들어, 유전자 변형 알츠하이머 생쥐의 비강 deferoxamine의 치료 공간 메모리 작업 7 글리코겐의 synthase의 키나제 3 베타 9의 인산화에 향상된 성능하게되었습니다.
| 일 | 행동 | |
| 1 | 엠 | ~ 2-3 분 동안 기다려 |
| 이 | 투 | ~ 2-3 분 동안 기다려 |
| 3 | W | 상태 애완 동물 ~ 2-3 분 |
| 4 | 일 | 상태 애완 동물 ~ 2-3 분 |
| 5 | 에프 | 살짝 비틀거나 불결하고 단 정치 못한 |
| 6 | 엠 | 살짝 비틀거나 불결하고 단 정치 못한 |
| 7 | 투 | 안녕하세요, 및 리프트 |
| 8 | W | 안녕하세요, 및 리프트 |
| 9 | 일 | 비강 그립 |
| 10 | 에프 | 비강 그립 |
| 11 | M </ TD> | 비강 (IN) 그립과 반전 |
| 12 | 투 | 비강 (IN) 그립과 반전 |
| 13 | W | 그립 IN, 코 근처에 피펫 팁을 배치, 반전 |
| 14 | 일 | 그립 IN, 코 근처에 피펫 팁을 배치, 반전 |
| 15 | 에프 | 그립 IN, 반전, 각 n 계속으로 생리 한 원형을 제공합니다 |
| 16 | 엠 | 그립 IN, 반전, 각 n 계속으로 생리 한 원형을 제공합니다 |
| 17 | 투 | 그립 IN, 반전, 각 n 계속에 염분이 순찰을 제공 |
| 18 | W | 그립 IN, 반전, 각 n 계속에 염분이 순찰을 제공 |
표 1. 깨어 마우스로 비강 투여에 대한 처리에 Acclimation에 대한 샘플 일정.
* pipettor은 6 μl를 한 번에로드하지만, 2 × 3 μl 물방울로 마우스에 투여합니다.
표 2. 하나 또는 두 개의 마우스를 주입 용 샘플 타임 라인.
1 그림. 다른 단계 및 약물의 깨어있는 비강 배달 마우스를 개최 각도의 사진. 1A)이 피부를 놓치 노출 어깨를 떠나는 지배적 인 손으로 케이지 상단에 단단히 아래로 마우스를 잡아. 1B)은 엄지와 가운데 손가락을 사용하여비 지배적 인 손을 막 어깨 블레이드 뒤에 피부를 꽉 끌어 수 있습니다. 1C)은 엄지와 가운데 손가락 (정면)을 향해 눈 사이에서 다시 피부를 끌어 검지 손가락을 사용합니다. 1D) 1C (면과 동일 보기). 1E)는 손바닥에 꼬리 기반을 확보하기 위해 손가락 및 / 또는 분홍색을 사용하여 거꾸로 마우스를 잡아. 마우스의 목은 수평이어야합니다. 1 층) E과 동일, 다른 곳에서. 1G)은 1G, 근접 전망과 동일 20 μl pipettor 및 젤 로딩 피펫 팁. 상반기)에 약물을 관리 할 수 있습니다.
그림 2. 이 개별적으로 자리 쥐위한 완벽한 주입 스테이션의 사진입니다. 포함은 쥐가 별도의 유지하는 사이에 충분한 거리가있는 두 개의 마우스 케이지, pipet 아르팁, 사용 방법에 대한 용기, 타이머, 주입 시트, 후 주입의 대우 (해바라기 씨 나 Cheerios 만 등), 위생 잎사귀, P20 (또는 P10) pipettor, 그리고 전달 될 수있는 약물로 토르.
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Discussion
이 방법은 마우스가 마취를 사용하지 않고 뇌를 타겟팅하는 비강 약물 정기적으로 복용을 부여 할 수있는 방법을 보여줍니다. 비강 약물은 최소의 노력으로 오랜 시간 동안 마우스의 큰 그룹에게 제공 할 수 있습니다. 20 쥐 최대의 단일 그룹은 intranasally 미만 시간 한 사람에 의해 처리 될 수 있습니다. 작은 철 chelators에서 중간 엽 줄기 세포에 대한 성장 요인에 이르기까지 분자의 광대 한 배열은, 빠르게 CNS를 타겟으로 입증 된 및 설치류 모델에서 효능을 보여 주었다. 코에서 뇌에 직접 전달 제안 된 메커니즘은 perivascular 공간 1,10 내 후각과 삼차 신경 및 벌크 흐름을 따라 세포 수송이 포함되어 있습니다. 가 빠른 속도는 단지 때문에 CNS에 비강 게재가 특히 유용 기법이지만, 전신 노출을 감소 CNS를 타겟팅합니다. 예를 들어, 쥐에 deferoxamine의 비강 관리는 3-19 배의 상위 conce을 발생혈액 11 28 배 낮은 농도로 뇌 지역 ntrations. 또 다른 예에서, intranasally 관리 인슐린은 인슐린 또는 포도당 (12)의 플라즈마 수준을 변경하지 않고 15 분 이내에 알츠하이머 환자의 메모리를 향상시킵니다. 추가 이점은 비강 전달 기술의 비 invasiveness입니다.
이 방법에 대한 몇 가지 제한이 있습니다. 첫째, 약물 전달은 단일 행정 20-30에 대한 μl로 제한되어 있으므로 치료의 용해도는 선량 한도를 결정하는 역할을 담당 할 것입니다. 또한, 약물 제제는 산도와 같은 요인으로 중요하며 염분이 전달에 영향을 미칠 수 있습니다. 이러한 극단적 인 산도와 염분 등의 자연 조건에서 큰 편차는 13,14은 또한, unanesthetized 마우스의 비강 주입은 마스터하기 어려울 수 있습니다. 마우스의 호흡과 후각 상피 조직을 손상시킬 수 있으며, 비강 "dosers에 대한 훈련의 몇 주가 걸릴 수 있습니다 "미소 할 수있을"머리 흔드는 룸을 '이지는 및 약물의 최적 비강 주입을 얻을 수 있습니다. 잘못된 주입 기술을 통해 약물은 폐 또는 뇌에 도달 약물에 변화를 소개 할 수있는 위,로 배수 할 수 있습니다. 이 발생했다는 징후가 관리 후 입에 어려움이나 액체의 시각화를 숨 쉬고 있습니다. 가능하면, 그것은 그들이 전문 트레이너에 의해 투여 약물로 승인되기 전에 몇 주 또는 몇 달 동안 그룹을 제어 할 수 생리 / 차량을 제공의 새로운 비강 "dosers"를 제한하는 것이 좋습니다. 마지막으로,이 깨어 비강 방법은 깨어있는 쥐와 큰 동물이 쉽게 사로 잡혔다, 그리고 지나치게 거꾸로 개최 때 강조 할 수 없기 때문에, 마우스로 제한됩니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
Acknowledgments
저자는 HealthPartners 기관 동물 케어에 감사하고 지역 병원에서위원회를 사용하고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| P20 pipettor set at 6 μl | |||
| Gel loading pipette tips | |||
| Timer | |||
| Waste receptacle for tips | |||
| Dosing sheet for notes | |||
| Pen | |||
| Drug and vehicle | |||
| Container to hold drug vials | |||
| Animals to be dosed | |||
| Spare gloves | |||
| Paper towels to wipe urine | |||
| Table 3. Materials Needed | |||
References
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