Summary
Метод управления препаратов интраназально пробудить мышей с целью ориентации мозга описаны. Этот метод позволяет для повторного дозирования в течение длительного периода использования интраназального введения препарата без анестезии, и нос к мозгу доставки с минимальными системными экспозиции.
Abstract
Интраназальная администрация способ доставки терапевтических агентов в центральной нервной системе (ЦНС). Это является неинвазивным и позволяет большие молекулы, которые не пересекают гематоэнцефалический барьер доступа к ЦНС. Наркотики, непосредственно ориентированных на ЦНС с интраназальной доставки, снижение системного воздействия и, следовательно, нежелательные системные побочные эффекты 1. Доставка от носа к центральной нервной системе происходит в течение нескольких минут по обеим обонятельного и тройничного нервных путей с помощью внеклеточных маршрут и не требует наркотиков привязать к любому рецептору или аксонального транспорта 2. Интраназальной доставки широкое распространение метод и в настоящее время используется в клинические испытания на человеке 3.
Интраназальной доставки лекарств на животных моделях, позволяет первоначальной оценки фармакокинетических распределения и эффективности. С мышами, можно вводить препараты для бодрствования (без наркоза) животных на регулярной основе, используя специальказывают интраназальной захватом. Awake доставки выгодна, поскольку она позволяет долгосрочных хронических дозирования без анестезии, это занимает меньше времени, чем при анестезии, и может быть изучено и сделано много людей, так что команды техников могут доза большого количества мышей в короткие сроки. Эффективность терапии вводят интраназально таким образом, чтобы мышах было показано в ряде исследований, в том числе инсулина у больных сахарным диабетом моделей мышей 4-6 и дефероксамин в моделях болезни Альцгеймера мыши. 7,8
Интраназального ручка для мышей можно научиться, но это не легко и требует практики, мастерство и точный захват для эффективного предоставления наркотиков на мозг и избежать дренаж в легких и желудка. Мыши сдерживается вручную с помощью модифицированного шкирку в не доминантной рукой с шеи проведена параллельно полу, а наркотики поставляются с использованием пипетки доминирующей рукой. Обычно это занимает 3-4 недели акклиматизации к обработке до мышеймогут быть проведены с этой рукояткой без стресса. Мы подготовили эту Юпитера видео, чтобы сделать эту технику интраназального доставки более доступными.
Protocol
1. Акклиматизация к обработке для интраназального дозирования Awake Мыши
Введение
Мышь должна приспособиться к обработке в течение двух-четырех недель до наступления интраназального введения. Акклиматизация к обработке важна, так как она помогает обеспечить правильное положение тела для максимальной эффективности проснулся интраназальной доставки лекарственных средств. Кроме того, мыши, которые не были должным образом привыкли к этому процессу может иметь тяжелые реакции тревоги после приема препарата. Мышь должна потратить около 2-3 дней по каждому из девяти шагов перед переходом к следующему шагу, в зависимости от комфорта животных к обработке. Уровень стресса мышь должна быть использована в качестве меры прогресса. Это означает, контроля за движением мыши, количество / частота мочеиспускания, дефекации, дрожа, и кусать. Если мышь имеет высокую реакцию на стресс, пребывание на этот шаг, прежде чем переходить к следующему, пока ответа снижается. Образец акклиматизации SCHedule можно увидеть в таблице 1. Акклиматизация мышей должна развиваться на основе следующих один раз в день шаги. Выполнение этих шагов более чем один раз в день, в попытке ускорить акклиматизацию, не рекомендуется.
- Поместите мышь в ладони в течение двух-трех минут, не более одной ногой над клетку сверху, как животные часто прыгают во время этой вступительной шаг. Если мышь пытается выбраться из руки и до своей рукой, просто поднять мышь основания хвоста и поместить его обратно в руке.
- Поместите мышь в ладони в течение трех минут и погладить животное мягко. Животные мыши направленно от головы до хвоста, позволяя животному свободно передвигаться.
- Поместите мышь в ладони в течение трех минут, а массаж за ушами (слегка зажимая вместе кожу на шее, используя большой палец и указательный палец).
- Удерживайте / LiFT мышью за шкирку его шею на 30 сек, позволяя остальным мыши на клетке верхней течение 30 секунд, прежде чем повторять трюме снова.
- Наведите использованием интраназального власть, которая описана в разделе 2, но не инвертировать животных (полный шаги до 2,4). Держите животное, как это в течение 30 секунд и отпустить обратно в клетку сверху. Повторить второй раз после одной минуты отдыха.
- Держите мышь с интраназального сцепления, как описано в разделе 2, в том числе обращения животное так его вентральной стороной вверх к потолку. Убедитесь, что шея животного параллельно полу. Задержитесь в этом положении на 30 секунд. Повторите это второй раз после одной минуты отдыха. Некоторые мыши будет сопротивляться интраназального сцепление больше, чем другие, особенно при использовании в первый раз с инверсией на этот шаг в акклиматизации. Если мышь освобождает себя от власти, положить мышь обратно на верхнюю клетку и повторного захвата. Повторите повторного захвата, если это необходимо, Но контролировать уровень стресса мыши и вернуть его в клетку, если это необходимо. Другой фактор, который может сыграть свою роль в потере сцепления на данный момент в процессе акклиматизации неопытность животных обработчики с интраназального технику доставки.
- Держите мышь с интраназального сцепление, инвертирование, кратко разместить пипетки с пустой опрокинуться каждую ноздрю, и удерживать животных положении в течение 30 сек. Повторите это после одной минуты отдыха.
- Держите мышь с интраназального сцепление, перевернуть его, и интраназально управлять 6 мкл физиологического раствора в левой и правой наре, как описано в разделе 3 (через шаг 3,7).
- Держите мышь с интраназального сцепление, инвертировать его, и интраназально управлять 6 мкл физиологического раствора в левой и правой наре в два раза размещения животное обратно на клетку верхнего между ними, как описано в разделе 3.
2. Интраназальная ручка для иммобилизации Awake Мыши
- Наведите оп клетку сверху.
- С большим и указательным пальцами вашей доминирующей рукой, держа мышь за хвост. Использование среднего, кольца, пальцы и мизинец, слегка прикрепить нижнюю часть тела к верхней клетки (рис. 1А). Пусть мышь хвататься за решеткой, как вы слегка растянуть мышью, и лучше захватить за шкирку.
- С помощью большого и среднего пальцев на не доминантной рукой, зажать мышь твердо на загривок (избыток кожи) за шею и плечи. Потяните вверх на дряблую кожу, чтобы сделать палатку кожи на лопатках (рис. 1б). Принять, как много кожи насколько возможно, но будьте осторожны, чтобы не потянуть мышцы так как это вызовет неудобства для мыши. Соблюдайте осторожность, чтобы не применять слишком большое давление на грудную клетку животного или позвоночника. Избыточное давление или натяжение кожи может привести к угнетению дыхания в некоторых случаях.
- Быстро поместите указательный палец не доминантной рукой на голову мыши, какблизко к носу, как можно и отступить на кожу (рис. 1C, 1D). В то же время, сдвиньте большой и средний пальцы к голове для оптимального положения. В идеале, мышь не должна быть в состоянии двигать головой вертикально или горизонтально.
- Сохраняя контроль над шкирку, включите мышь на спину. Вернуться мышь должна быть в ладони вашей руки. Крепко держите хвост мыши (у основания) против вашей ладони с вашего последнего двумя пальцами (кольца и мизинец), чтобы стабилизировать мыши, или вы можете обернуть пальцы по нижней части тела (рис. 1E, 1F).
- На данный момент убедиться, что шея мыши и подбородок являются плоскими и параллельными полу. Подбородок должен быть близок к 180 градусов, угол с шеей как можно больше, чтобы помочь с интраназальной доставки. Небольшие изменения угла может вызвать препарат в конечном итоге не в том месте. Убедитесь, что мышь способна дышать, наблюдая за живот. Шо мышиULD не сможет двигаться, но должна быть удобной и не в любую боль. Если вы видите шее мыши и подбородок делает "V", то вам необходимо повторно сцепление.
3. Интраназальной доставки наркотиков в Awake Мыши
Введение
Использование интраназального сцепление, каждая мышь сдерживается в два раза и провел с их шеи параллельно полу, в то время как объем 20-30 мкл жидкости вводят. Этот объем является безопасным и эффективным для малого и большого мышей, мы обычно используют 24 мкл, и что описано в этом протоколе. Проснулся интраназального метод может быть использован в мыши в любом возрасте, например, у новорожденных мышей для исследований развития нейронауки. У новорожденных мышей, меньше общего объема (8 мкл) и размер капель (1 мкл) должны быть использованы для размещения меньшего объема полости носа. Наркотиков, как правило, поставляются с двумя мышами в то время, чередуя периоды отдыха, чтобы максимально эффективно использовать время и сохранить оп графику. Настройка будет немного отличаться в зависимости от того, если вы дозирования группы расположены мышами или индивидуально размещены мышей. С индивидуально размещены мышах, было бы полезно разместить все ваши материалы в между клетками, чтобы предотвратить мышей от перехода на другую верхнюю клетку. С группой размещены мышей, дозы, что только клетки. Важно, что каждая мышь в группу размещены клетки получают одинаковые интраназального лечения, так как потенциал для перекрестного загрязнения из двух различных методов лечения существует из-за наркотиков изгнания в воздух или контакт с кожей. Настоятельно рекомендуется дозирование листа печатаются заранее, чтобы напомнить техниками лечения задания, чтобы записать любые заметки о пропущенных капли, отметить общее состояние здоровья каждого животного, и т.д.
Шаги
- Установить клетках, где они должны быть для дозирования, а также создать станция дозирования (рис. 2).
- Удалить мыши из клетки и держать на верхней клетке во время дозирования.
- Возьмите мыши с помощью интраназального сцепление описано в разделе 2.
- Использование доминирующей рукой, загрузить пипетка с 6 мкл наркотиков или автомобилей. Поместите кончик пипетки заполнены около левой ноздри мыши, как правило, под углом 45 градусов (рис. 1G, 1H). Если у вас есть вязкий раствор вам может понадобиться увеличить угол до 90 градусов, потому что препарат может достигать стороны пипетки вместо того, чтобы капли. Если очень вязкой, вытирая пипетки с тканью до изгнания жидкости может помочь. Медленно извлечь наркотики, чтобы сформировать небольшую каплю около половины объема (3 мкл).
- Капли должны быть размещены достаточно близко к ноздре мыши так, что мышь может вдохнуть капли. Сразу же после мышью вдыхает эту маленькую каплю, извлеките остальные лекарства в пипетку, чтобы сформировать еще один небольшой каплей для мыши вдохнуть через ту же ноздрю 2-3 секунд позже. Будьте уверены, чтобы смотреть в рот. Если яс любой жидкостью в полости рта, падение не сделать его полностью в нос, и это должно быть отмечено.
- Держите мышь в этом положении на 15 секунд. Настоятельно рекомендуется использовать таймер, чтобы стандартизировать эти 15 секунд удержания.
- Повторите шаги 3,3 - 3,6 для правой ноздре. Если капли из фыркнул, что падение должно быть заменено и отметил.
- Наведите снова на вершине своей клетке в течение 2 мин. Повторите весь процесс, начиная 2 мин. После поставки первой капли. Это дает мышью четыре капли 6 мкл каждая на общую сумму 24 мкл раствора. Пример графика для дозирования одного или двух мышей сразу можно увидеть в таблице 2.
- После того, как мышь получила все капли, вернуть мышь в клетку.
4. Генеральный животных Обработка методы для акклиматизации и интраназальной доставки наркотиков в Awake Мыши
После каждого акклиматизации или интраназального сессии дозирования, мыши должны быть датьН.А. лечения, такие как Cheerio или очищенных семян подсолнечника в качестве положительного подкрепления. Лечит даются как награда и отвлечь их от царапин носы, возможно причинение вреда самим себе. При работе с группой размещены мышей, достаточно удовольствия должны быть исключены для каждой мыши. Перед возвращением животных в их клетки убедитесь, что восстановление гнезд к их первоначальному состоянию, чтобы уменьшить стресс. При дозировании группы размещаются животные, перчатки должны быть изменены между дозирующим клеток так, чтобы не переносить запах от клетки к клетке колонии колонии, так как они становятся агрессивными по отношению друг к другу.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Есть несколько способов, чтобы определить эффективность доставки лекарства. Во-первых, интраназально управления красителей, таких как тушь или метиленовым синим и визуализировать красителя после эвтаназии животных в пределах обонятельного эпителия и после мозга удаляется, входя в ЦНС через пластинку решетчатой. Вторая заключается в измерении наркотиков поставляется либо с помощью радио-меченых теги или с помощью ИФА обнаружения немеченых молекул. Хорошим примером распространения наркотиков в ЦНС после введения мышам спать можно найти в Hanson и др.. 2012 7. Мы ожидаем, что обонятельная луковица и тройничного нерва содержат высокие концентрации препарата доставлены. На 30 мин после интраназального введения 3,65 мкмоль дефероксамин, концентрации в тройничного нерва и обонятельных нервов было 29 мкм и 13 мкм соответственно. Концентрации препарата будет видно во всех областях мозга (в данном примере зазвониле 0,6 мкм до 4,1 мкм был измерен) с более высокой концентрацией в тех областях, получая входные данные от обонятельного и тройничного нервов. Например, ростральной областей коры головного мозга будет содержать более высокие концентрации, чем хвостовой мозга и моста будет содержать более высокие концентрации, чем в среднем мозге и мозге. В спинном мозге нисходящего градиента концентрации от рака шейки в поясничном отделе позвоночника наблюдается, как правило (в данном примере градиент от 1,5 мкм до 2,0 мкм). Интраназальное введение также приводит к высокой концентрации препарата достижении мозговых оболочек и лимфатических узлов шеи. Третий способ продемонстрировать эффективность доставки для измерения поведенческих или биохимической реакции на препарат назначают. Например, интраназального лечения дефероксамин из трансгенных мышей Альцгеймера привели к повышению производительности в пространственной задаче памяти 7 и фосфорилирования гликогена киназа 3 Beta 9.
| День | Действие | |
| 1 | M | Задержитесь на ~ 2-3 мин |
| 2 | Ту | Задержитесь на ~ 2-3 мин |
| 3 | W | Удержание и домашним животным ~ 2-3 мин |
| 4 | Th | Удержание и домашним животным ~ 2-3 мин |
| 5 | Фа | Слегка щепотку или загривок |
| 6 | M | Слегка щепотку или загривок |
| 7 | Ту | Шкирку и лифт |
| 8 | W | Шкирку и лифт |
| 9 | Th | Интраназальная ручка |
| 10 | Фа | Интраназальная ручка |
| 11 | M </ TD> | Интраназально (IN) ручка и Invert |
| 12 | Ту | Интраназально (IN) ручка и Invert |
| 13 | W | В Grip, Invert, поместить пипетки около носа |
| 14 | Th | В Grip, Invert, поместить пипетки около носа |
| 15 | Фа | В Grip, Invert, доставить 1 раунд физиологическим раствором для каждой наре |
| 16 | M | В Grip, Invert, доставить 1 раунд физиологическим раствором для каждой наре |
| 17 | Ту | В Grip, Invert, поставить 2 раунда физиологическим раствором для каждой наре |
| 18 | W | В Grip, Invert, поставить 2 раунда физиологическим раствором для каждой наре |
Таблица 1. Пример расписания для акклиматизации к обработке для интраназального дозирования Awake мышей.
* Дозатора загружается один раз с 6 мкл, но вводили мыши, как 2 х 3 мкл капли.
Таблица 2. Пример Срок дозирования одного или двух мышей.
Рисунок 1. Фотографии различных этапах и углов проведения мышь для интраназального проснулся поставки наркотиков. 1А) Держите мышь вниз твердо на клетку сверху с доминирующей рукой оставляя плечи подвергаются захватить кожу. 1B) используется большим и средним пальцемиз не доминантной рукой схватить и подтянуть кожу сразу за лопатками. 1С) используйте указательный палец, чтобы вытащить обратно из кожи между глазами к большим и средним пальцем (вид спереди). 1D) То же, что 1С (со стороны зрения). 1E) Держите мышь вверх тормашками помощью пальца кольцо и / или мизинец, чтобы обеспечить основание хвоста к ладони. Шее мышь должна быть горизонтальной. 1F) То же, E, с другой стороны. 1G) Администрирование препарат с 20 мкл пипетки и гель загрузкой пипетки. 1H) То же, 1G, крупным планом.
Рисунок 2. Фото полного станции дозирования для 2 индивидуально размещены мышей. Включены две мыши клетки с достаточным расстоянием между ними, чтобы держать мышей отдельно, пипеткиTor с советами, контейнер для использован советы, таймер, дозирование лист, после введения дозы лечения (например, семена подсолнечника или овсяные хлопья), гигиенические салфетки, P20 (или P10) пипетки, и препарат должен быть доставлен.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот метод показывает, как мышь может быть дан очередной дозы препарата интраназально целевой мозга без использования анестезии. Интраназально препарат может быть доставлен в больших группах мышей в течение длительных периодов времени с минимальными усилиями. Одной группе до 20 мышей можно интраназально лечить одного человека менее чем за один час. Огромный массив молекул, начиная от небольших энтеросорбенты железа факторов роста в мезенхимальные стволовые клетки, были продемонстрированы быстро нацелены на ЦНС и показали эффективность в моделях грызунов. Предлагаемый механизм прямых поставок от носа до мозга включают внеклеточный перевозок по обонятельным и тройничного нервов и объемного потока в периваскулярных пространствах 1,10. Интраназальной доставки на ЦНС является особенно полезной техникой, потому что она не только быстрым, но он нацелен на ЦНС снижения системного воздействия. Например, интраназального введения дефероксамин крысам привело к 3-19 раз выше, Concentrations в областях мозга, с 28 раз ниже концентрации в крови 11. В другом примере, интраназально вводят инсулин улучшает память у пациентов с болезнью Альцгеймера в течение 15 минут без изменения плазменных уровней инсулина или глюкозы 12. Дополнительным преимуществом является неинвазивность из интраназального технику доставки.
Есть несколько ограничений для этого метода. Во-первых, доставки лекарств ограничен примерно 20-30 мкл в одной администрации, так растворимость терапевтического будет играть роль в определении пределов дозы. Кроме того, лекарственный препарат важно, так как такие факторы, как рН и соленость может влиять на доставку. Большие отклонения от природных условий, таких как экстремальные рН и соленость, может привести к повреждению дыхательной и обонятельной эпителия мышей. 13,14 Кроме того, интраназального дозирования анестезированных мышей может быть трудным в освоении, и может занять несколько недель тренировок для интраназального «дозаторы "чтобы быть в состоянии MiniMИзе "голова-пространство для маневра" и достижения оптимального интраназального дозирования препарата. При неправильной технике дозирования, препарат может стекать в легких или желудка, которое можно ввести изменчивость препарата в мозг. Признаки того, что это произошло которые затруднение дыхания или визуализации жидкость во рту после приема. Если это возможно, целесообразно ограничить новой интраназальной "Дозаторы" для доставки соленые / транспортного средства для управления группами в течение нескольких недель или месяцев, прежде чем они будут утверждены на дозу наркотиков эксперт тренеров. Наконец, это проснулись интраназального метода ограничена мышей, крыс, как проснулся и более крупные животные не так легко схватил и может быть чрезмерно подчеркивал, когда они проводятся с ног на голову.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить HealthPartners Институциональные уходу и использованию животных комитета в больнице регионов.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| P20 pipettor set at 6 μl | |||
| Gel loading pipette tips | |||
| Timer | |||
| Waste receptacle for tips | |||
| Dosing sheet for notes | |||
| Pen | |||
| Drug and vehicle | |||
| Container to hold drug vials | |||
| Animals to be dosed | |||
| Spare gloves | |||
| Paper towels to wipe urine | |||
| Table 3. Materials Needed | |||
References
- Dhuria, S. V., Hanson, L. R., Frey, W. H. 2nd Intranasal delivery to the central nervous system: mechanisms and experimental considerations. J. Pharm Sci. 99, 1654-1673 (2010).
- Thorne, R. G., Pronk, G. J., Padmanabhan, V., Frey, W. H. 2nd Delivery of insulin-like growth factor-I to the rat brain and spinal cord along olfactory and trigeminal pathways following intranasal administration. Neuroscience. , 127-481 (2004).
- Benedict, C., et al. Intranasal insulin as a therapeutic option in the treatment of cognitive impairments. Exp. Gerontol. 46, 112-115 (2011).
- Francis, G. J., et al. Intranasal insulin prevents cognitive decline, cerebral atrophy and white matter changes in murine type I diabetic encephalopathy. Brain. 131, 3311-3334 (2008).
- Francis, G., et al. Intranasal insulin ameliorates experimental diabetic neuropathy. Diabetes. 58, 934-945 (2009).
- Marks, D. R., Tucker, K., Cavallin, M. A., Mast, T. G., Fadool, D. A. Awake intranasal insulin delivery modifies protein complexes and alters memory, anxiety, and olfactory behaviors. J. Neurosci. 29, 6734-6751 (2009).
- Hanson, L., et al. Intranasal delivery of deferoxamine reduces spatial memory loss in APP/PS1 mice. Drug Delivery and Translational Research. 2, 160-168 (2012).
- Danielyan, L., et al. Protective effects of intranasal losartan in the APP/PS1 transgenic mouse model of Alzheimer disease. Rejuvenation Research. 13, 195-201 (2010).
- Fine, J. M., et al. Intranasal deferoxamine improves performance in radial arm water maze, stabilizes HIF-1alpha, and phosphorylates GSK3beta in P301L tau transgenic mice. Exp. Brain Res. 219, 381-390 (2012).
- Lochhead, J. J., Thorne, R. G. Intranasal delivery of biologics to the central nervous system. Adv. Drug Deliv. Rev. 64 (11), 614-628 (2012).
- Hanson, L. R., et al. Intranasal deferoxamine provides increased brain exposure and significant protection in rat ischemic stroke. J. Pharmacol. Exp Ther. 330, 679-686 (2009).
- Reger, M. A., et al. Effects of intranasal insulin on cognition in memory-impaired older adults: modulation by APOE genotype. Neurobiol. Aging. 27, 451-458 (2006).
- Kim, C. H., Song, H. yun, M, E. unA. hn, Lee, Y., G, J., Yoon, J. H. Effect of hypo-, iso- and hypertonic saline irrigation on secretory mucins and morphology of cultured human nasal epithelial cells. Acta Otolaryngol. 125, 1296-1300 (2005).
- Greiff, L., Andersson, M., Wollmer, P., Persson, C. G. Hypertonic saline increases secretory and exudative responsiveness of human nasal airway in vivo. Eur. Respir. J. 21, 308-312 (2003).
