עור קעקוע כגישה חדשה לאספקת חיסון ה-DNA

סיכום

קעקוע עור הוא דרך חזקה ובטוחה לאספקת חיסון DNA intradermally. כאן, EGFP קידוד DNA פלסמיד מועבר בקעקוע על העור של עכבר מעבדה, והביטוי של EGFP בתאי העור ואז ייבדק על ידי מיקרוסקופיה confocal.

תקציר

חיסון מבוסס חומצת גרעין הוא נושא להתעניינות הולכת וגובר, במיוחד DNA פלסמיד (pDNA) קידוד אנטיגנים immunologically חשובים. לאחר pDNA המהונדס ניתן לחיסונים, הוא עבד ותרגם לחלבוני immunogen שיכול לעורר תגובות מהמערכת החיסונית. דרכים רבות של אספקת חיסוני DNA נחקרו, אך כל מסלול יש יתרונות ומשלוח חסרונות משלה. קעקוע עור הוא טכניקה חדשנית שהיא בטוח, יעיל וחסכוני, ונוח. בנוסף, נקבים שנגרמו על ידי המחט יכולים גם לשמש כאדג'ובנט חזק. כאן, אנו) להפגין משלוח intradermal של קידוד ה-DNA פלסמיד משופר ירוק זרחני חלבון (PCX-EGFP) במודל של עכברים באמצעות מכשיר קעקוע וב) לאשר את הביטוי האפקטיבי של EGFP בתאי העור באמצעות מיקרוסקופיה confocal.

פרוטוקול

1. טיהור DNA פלסמיד

1. להפוך האיקריוטים פלסמיד דנ"א קידוד EGFP (PCX-EGFP) לתוך תאים מוסמכים DH5α E.coli. וקטור PCX הריק עשוי לשמש גם כשלט שלילי.
2. תרבות וקציר תאי DH5α E.coli ולטהר pDNA פי מדריך טיהור פלסמיד Qiagen EndoFree.
3. פתרון סינון pDNA דרך 0.22 מיקרומטר PVDF סטרילי מסנן, ולאחסן אותו ב -20 ° C עד לשימוש.

2. הכנת מערכת קעקוע

1. חבר את יחידת כף היד ודוושת שליטה ליחידת אספקת החשמל להוראות היצרן.
2. הגדר את תדר תנודת המחט לכ 100 הרץ. למכשיר הקעקוע שבחרנו (מערכת התגנבות קעקוע רוטרי), מחוג באספקת החשמל צריכה להיות מוגדרת 4 וולט. עיין במדריכים למשתמש או תמיכה טכנית למערכות קעקוע אחרות.
3. לעקר את מחט arקרן לפני השימוש. אנו ממליצים להשתמש במערך מחט אחת לכל חיים. המחטים ניתן לעשות שימוש חוזרות לאחר שניקה עם מים וסבון וautoclaved.
4. התקן את מערך המחט לתוך יחידת כף היד ורפיון לצרף אחיזה מהפלסטיק.
5. לכוונן את עומק המחט להגדרה מתאימה באמצעות ההעברה למעלה או למטה אחיזה מהפלסטיק. אנחנו השתמשנו בעומק של כ מחט 0.5 מ"מ לצורך ניסוי העכבר שלנו.
6. להדק את אחיזת הפלסטיק כאשר עומק המחט מוגדר כראוי, ומערכת הקעקוע היא מוכנה לשימוש.

3. גילוח בעלי חיים

1. בחר את האתר לטיפול בקעקוע. האתר צריך להיות אזור יחסית חזק, שטוח, ובשרני של העור, למשל, את הצד של hindleg של בעל החיים.
2. הרדם עכבר BALB / ג בתערובת של קטמין (90 מ"ג / ק"ג) וxylazine (5 מ"ג / ק"ג) בהתאם למשקל גופו של בעל החיים. לבעלי חיים אחרים, עיין בהנחיות ההרדמה של המוסד שלך.
3. בדקורפלקסים של בעלי החיים על ידי צובט את הרגל כדי לאשר את החיה מורדם כראוי.
4. השתמש גוזם החשמלי כדי לקצץ את השיער ברגלי האחורית של בעלי החיים לאט ובזהירות. להסיר את השיער מאתר הקעקוע המתוכנן וסביבתו.
5. הסרת שיער הקצר יותר שיירים עם גילוח חד הפעמי. היזהר שלא לחתוך את עורו של בעל החיים. שימו לב שקרם הסרת שיער יכול לשמש כחלופה לשיטת הסרת שיער, אך אנו מעדיפים גילוח על קרם הסרת שיער.
6. הסרת שערות תועות מלחתוך את העור עם אוויר דחוס במידת צורך.

4. משלוח של ה-DNA פלסמיד ידי קעקוע

1. אם פרוטוקול חיסונים כבר נקבע בעבר, המינון והנפח של פתרון ה-DNA כדי להיות מיושם צריכים להיות מחושבים בהתאם. אנו ממליצים להשתמש כקטן נפח מעשי כדי להפוך את תהליך הקעקוע יותר לניהול. בהפגנת EGFP זה, השתמש 7.5 μl של פתרון ה-DNA בקוןcentration של 0.25 מ"ג / מ"ל, שהוחל על אזור קעקוע של כ 1 סנטימטר ^2. על ניסויים של חיסון, ריכוזי pDNA גבוהים יותר עלולים להידרש כדי לגרום ^1,2 תגובות חיסוניים חזק.
2. להחיל את פתרון ה-DNA על ידי pipetting ישירות על גבי אתר קעקוע. לחלופין, טען את פתרון ה-DNA לתוך אחיזת הפלסטיק על ידי pipetting, כך שהנוזלים תלויים בין המחט וקצה אחיזה מפלסטיק. עיין בווידאו להפגנה. יש לנו לא הבחנתי בשום הבדל בולט בין שתי שיטות. עם זאת, טעינת הפתרון לאחיזת הפלסטיק עשויה להיות יתרון על משטחים אנכיים עור, למשל.
3. התחל תנודת המחט ולמקם את מערך המחט עם לחץ קל על עורו של בעל החיים באתר הקעקוע. ואז להזיז את מחט נדנוד עדינות ובאיטיות באופן ליניארי לספק DNA פלסמיד מעל האזור כולו הקעקוע. שמור על זווית של 90 מעלות בין המחט והעור, כדי למנועחתכים על העור.
4. שים לב לעור. שחיקה ודלקת הם נורמלים. אם דימום קורה, לעצור את תהליך הקעקוע ולהקטין את עומק המחט.
5. המשך בתנועת המחט כ 1 דקות, ולאחר מכן לעצור את תהליך הקעקוע.
6. השתמש במטלית כותנה נקיה כדי למרוח שכבה דקה של משככי כאבים מקומיים באתר הקעקוע. משככי כאבים מקומיים כגון קרם סילבר Sulfadiazine (קרם SSD) או משחת כוהל יכולים לעזור להקל על כאב או המצוקה של בעלי החיים, ולכן מומלץ ליישם אותם לפני ההרדמה פגה. הקפד על החיות למחרת לסימנים של כאב או מצוקה (שינוי בהליכה, חוסר פעילות). מרח את קרם שמנת משכך כאבים אם הסימנים נמשכים.

5. אישור על ביטוי Antigen

1. 48 שעות לאחר טיפול הקעקוע (שים לב שמבני pDNA שונים עשויים לדרוש פעמי ביטוי שונות), העכבר מורדם ב _-2 הרדמת CO. לאחרחיות, לעיין בהנחיות מתות החסד של המוסד שלך.
2. מנתח את העור באזור הקעקוע, ולתקן רקמות בparaformaldehyde 4% ב 4 ° C למשך הלילה.
3. שטוף את הרקמה עם אתנול 70%, ולהעביר אותו ל1X PBS להדמיה.
4. לבחון את כל הרקמות באמצעות confocal מיקרוסקופ כדי לבדוק אם אותות EGFP. לחלופין, רקמת העור יכולה להיות מוטבעת בשעוות פרפין ובדקה בסעיפים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

תוצאות

הביטוי של EGFP עם שיא עירור ב488 ננומטר ושיא פליטה ב 509 ננומטר ניתן להבחין בתאי עור של עכבר. ממינון 1.875 מיקרוגרם של ה-DNA, המכיל כ 3 × 10 ¹⁷ עותקים של פלסמיד, אנחנו בדרך כלל 10-20 נצפינו אותות EGFP ב1 הסנטימטר ² מקועקעים אזור. מספר זה נמוך יחסית של תאי transfected עולה בקנה אחד עם התוצאות של ³ מחקר קודמים. ביטוי EGFP (איור 1) מספק ראיות לכך שEGFP פלסמיד נמסר לתאי העור של בעלי החיים באמצעות טכניקת ה-DNA קעקוע.

דיון

חיסון DNA נחשב בטוח יותר מאשר אסטרטגיות חיסון מסורתיות כפי שהוא אינו דורש מניפולציה שלו, או חושף את החיסונים לפתוגנים, חיים או מוחלשים ^4. עם זאת, התוצאה של חיסון DNA תלויה בכבדות על מסלול המשלוח. עור הוא בשפע בתאי מציגי אנטיגן-, כגון תאים לנגרהנס ותאים דנדריטיים ^1, ולכן אתר אידיאלי לחיסון במונחים של תגובה חיסונית ולהקל על גישת ^5,6. כתוצאה מכך, אסטרטגית החיסון intradermal היא האחת האפשרויות הפופולריות ביותר לחיסוני DNA. כפי שניתן לראות בסרטון הזה, D...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
שם מגיב / חומרים	חברה	מספר קטלוגים	תגובות
PCX-EGFP DNA פלסמיד	Clontech
מערכת התגנבות קעקוע רוטרי	אספקת קעקוע ברחבי עולם	התגנבות-L
מחטי קעקוע	אספקת קעקוע ברחבי עולם	1207RSB
קיט מקסי פלסמיד EndoFree	Qiagen	12362
0.22 מיקרומטר PVDF סטרילי מסנן	Millipore	SLGV013SL
גוזם שיער חשמלי	זמין מסחרי
סכיני גילוח חד פעמיים	זמין מסחרי
כסףקרם Sulfadiazine	ווטסון	NDC 0591-0810-55
קטמין HCL		NDC 0856-2012-01
תמיסה סטרילית Zylazine		נדא 139-236