Summary
Skin tatoeage is een krachtige en veilige manier om de levering DNA-vaccin intradermaal. Hier wordt een DNA plasmide coderend EGFP geleverd door tatoeage op de huid van een laboratorium muis, en de expressie van EGFP in de huidcellen wordt vervolgens gecontroleerd door confocale microscopie.
Abstract
Nucleïnezuur gebaseerde vaccinatie is een onderwerp van groeiende belangstelling, vooral plasmide DNA (pDNA) die coderen voor immunologisch belangrijke antigenen. Na de kunstmatige pDNA wordt toegediend aan de vaccins wordt getranscribeerd en vertaald in eiwitten die immunogeen reacties kunnen opwekken van het immuunsysteem. Veel manieren om DNA-vaccins zijn onderzocht, maar elke levering route heeft zijn eigen voordelen en valkuilen. Skin tatoeëren is een nieuwe techniek die veilig, rendabel en handig. Bovendien kan de gaatjes veroorzaakt door de naald ook als een krachtige adjuvans. Hier we a) tonen de intradermale toediening van nucleïnezuren coderend versterkt groen fluorescent eiwit (PCX-EGFP) in een muizenmodel met een tatoeage apparaat en b) bevestigen de effectieve expressie van EGFP in de huidcellen behulp van confocale microscopie.
Protocol
1. Plasmide DNA Purification
- Transformeren eukaryotische plasmide DNA dat codeert voor EGFP (PCX-EGFP) in E.coli DH5a competente cellen. De lege vector PCX kan ook worden gebruikt als negatieve controle.
- Cultuur en oogst de E.coli DH5a cellen en zuiver het pDNA volgens de Qiagen Plasmid Purification Handbook EndoFree.
- Filter pDNA oplossing door een 0,22 urn steriel filter PVDF en bewaard bij -20 ° C tot gebruik.
2. Tattoo systeemvoorbereiding
- Sluit de rekenmachine eenheid en de controle pedaal om de voeding volgens de instructies van de fabrikant.
- Stel de naald oscillatiefrequentie tot ongeveer 100 Hz. Voor de tatoeage-apparaat hebben we gekozen (Stealth Rotary Tattoo System), moet de knop op de voeding worden ingesteld op 4 volt. Raadpleeg de gebruikershandleidingen of technische ondersteuning voor andere tatoeage systemen.
- Steriliseer de naald array voor gebruik. Wij raden u aan een naald reeks per dier. De naalden kunnen worden hergebruikt na het schoonmaken met een sopje en geautoclaveerd.
- Installeer de naald array naar de handheld apparaat en losjes bevestig de kunststof handgreep.
- Stel de naald diepte op de gewenste instelling door het bewegen van het plastic handvat omhoog of omlaag. We gebruikten een naald diepte van ongeveer 0,5 mm voor onze muis experiment.
- Draai de plastic handvat wanneer de naald diepte goed is ingesteld, en de tatoeage systeem is klaar voor gebruik.
3. Animal Scheren
- Kies de site voor de tatoeage behandeling. De site een relatief vlakke, stevige en vlezige deel van de huid, bijvoorbeeld de zijde van het achterbeen dier.
- Verdoven een Balb / c muis met een mengsel van ketamine (90 mg / kg) en xylazine (5 mg / kg) volgens het dier lichaamsgewicht. Voor andere dieren, hebben betrekking op de anesthesie richtlijnen van uw instelling.
- Controleer dedier reflexen door te knijpen de voet om het dier te bevestigen is goed verdoofd.
- Gebruik de elektrische trimmer om trim van het haar bij achterbenen van het dier langzaam en voorzichtig. Verwijder het haar van de geplande tatoeage site en het omliggende gebied.
- Verwijder de resterende korter haar met de wegwerp scheermes. Zorg ervoor dat u het dier de huid snijden. Merk op dat ontharingscrème kan worden gebruikt als alternatief ontharingsmiddelen methode, maar we liever scheren over ontharingscrème.
- Verwijder verdwaalde geknipte haren van de huid met perslucht indien nodig.
4. Levering van plasmide DNA door tatoeëren
- Als een immunisatieprotocol is eerder, de dosis en hoeveelheid DNA oplossing toe te passen dienovereenkomstig worden berekend. Wij raden u aan een zo klein volume als praktisch om het tatoeëren proces beter beheersbaar. In dit EGFP demonstratie we 7,5 ul DNA oplossing met een concentratie van 0,25 mg / ml, die werd aangebracht op een tatoeage oppervlakte van ongeveer 1 cm 2. Voor immunisatie experimenten, kunnen hogere concentraties pDNA moeten sterke immuunrespons 1,2 induceren.
- Breng de oplossing door pipetteren DNA direct op de tatoeage site. Als alternatief, laadt u de DNA-oplossing in de kunststof handgreep door pipetteren, zodat de vloeistof wordt opgehangen tussen de naald en de tip van kunststof greep. Zie de video voor een demonstratie. We hebben gezien geen merkbaar verschil tussen de twee methoden. Echter kan het laden van de oplossing in de plastic grip voordelig zijn op verticale huidoppervlakken, bijvoorbeeld.
- Start de naald oscillatie en plaats de naald array met lichte druk op de huid van het dier op de tatoeage site. Verplaats vervolgens de oscillerende naald voorzichtig en langzaam op een lineaire manier om plasmide DNA te leveren over de gehele tatoeage gebied. Zorg voor een hoek van 90 graden tussen de naald en de huid te vermijdenwonden op de huid.
- Let op de huid. Slijt-en ontstekingen zijn normaal. Als de bloeding geval is, stopt het tatoeëren proces en verminderen de naald diepte.
- Ga door met de naald beweging voor ongeveer 1 minuut, en dan stoppen het tatoeëren proces.
- Gebruik een schoon wattenstaafje om een dunne laag van actuele pijnstillende toe te passen op de tatoeage site. Topische analgetica zoals zilversulfadiazine crème (SSD Cream) of Neosporin zalf kan helpen verlichten van de pijn of angst van de dieren, en daarom wordt geadviseerd om ze toe te passen voordat de verdoving is uitgewerkt. Observeer de dieren de volgende dag op tekenen van pijn of ongemak (verandering van de gang, inactiviteit). Opnieuw aanbrengen pijnstillende crème als de symptomen aanhouden.
5. Bevestiging van antigeenexpressie
- 48 uur na het tatoeëren behandeling (er rekening mee dat verschillende pDNA constructen kunnen andere uitdrukking tijden vereisen), wordt de muis gedood door CO 2 narcose. Voor anderedieren, verwijzen naar de euthanasie richtlijnen van uw instelling.
- Ontleden de huid op de tatoeage site, en zet het weefsel in 4% paraformaldehyde bij 4 ° C overnacht.
- Spoel het weefsel met 70% ethanol en breng deze in 1X PBS voor beeldvorming.
- Onderzoek de hele weefsel met behulp van een confocale microscoop om te controleren op EGFP signalen. Alternatief kan het huidweefsel worden ingebed in paraffine en onderzocht in compartimenten onder een fluorescentiemicroscoop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De expressie van EGFP met een excitatie piek bij 488 nm en emissie piek bij 509 nm kan worden waargenomen in muizen huidcellen. Van een 1,875 ug dosis DNA die ongeveer 3 x 10 17 kopieën van het plasmide, we meestal 10-20 EGFP signalen waargenomen in de 1 cm2 getatoeëerde gebied. Deze relatief lage aantal getransfecteerde cellen komt overeen met de resultaten van een eerdere studie 3. De EGFP expressie (figuur 1) levert het bewijs dat EGFP plasmide werd geleverd in de huid van het dier cellen met de DNA tatoeage techniek.
Figuur 1. EGFP expressie in de huid cellen 48 uur na de behandeling op de tatoeage achterbeen van balb / c muis bekeken met een confocale microscoop. A) Een projectie van EGFP signalen van meerdere focale vliegtuigen. B) EGFP expressie in een zingenle cel.
Problemen oplossen
1. Geen antigeen expressie wordt gedetecteerd (bijv. geen EGFP positieve controle signalen).
- De concentratie van plasmide-DNA-oplossing van 2 - tot 5-voudige. We raden een beginconcentratie van 0,2 mg / ml. Concentraties zo hoog als 5 mg / ml zijn gemeld voor DNA tatoeëren experimenten 3.
- Voorkom ernstige schade aan de huid, zoals muis huid op de tatoeage site is gemakkelijk te snijden door de scheermessen en naalden.
- Zorg ervoor dat de DNA-construct geschikt is voor uw experiment.
- Voer gelelektroforese te zorgen dat de meerderheid van plasmide-DNA supercoiled is of gesloten circulaire vorm.
2. Ernstige bloedingen of schade aan de huid optreedt bij het tatoeëren site.
- Verlaag de naald diepte.
- Zorg voor een hoek van 90 graden tussen de naald array en de huid.
- Verlaag de kracht die wordt uitgeoefend tijdens detatoeëren behandeling.
- Verlaag de snelheid van de tatoeage beweging.
3. De achtergrond signaal is te hoog wanneer imaging EGFP.
- Gebruik een gloednieuwe wegwerp scheermes om zo veel haar te verwijderen mogelijk voor tatoeëren. Soms is het nodig te scheren voor de dissectie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
DNA-vaccinatie wordt beschouwd als veiliger dan de traditionele vaccinatie strategieën als het niet nodig gebruik van, of het blootstellen van de voorgestelde vaccins, levende of verzwakte pathogenen 4. Echter, het resultaat van DNA-vaccinatie is sterk afhankelijk van de levering route. Huid overvloedig in antigen-presenterende cellen, zoals Langerhans cellen en dendritische cellen 1 en dus een ideale plaats voor immunisatie in termen van immunogeniciteit en gemakkelijke toegang 5,6. Dientengevolge intradermale vaccinatiestrategie is een van de meest populaire keuzes voor DNA-vaccins. Zoals blijkt uit deze video, DNA tatoeëren is een eenvoudige maar veelbelovende manier om een DNA-vaccin intradermaal toedienen. Interessant kan de ontstekingsreacties veroorzaakt door het tatoeëren proces ook als een natuurlijke en krachtige adjuvans 1,2. Het is gerapporteerd dat het DNA tatoeage kan opwekken om een 100-voudige toename in T-cel responsen in apen ten opzichte van T-cel responsen bij dieren immunized via de intramusculaire weg 7,8. Vergeleken met andere dermale levering methoden, zoals het gen gun, DNA tatoeage heeft verschillende voordelen. Ten eerste, DNA-tatoeage geen dure apparatuur en dragers, dat wil zeggen gouddeeltjes. Dit zou een enorm voordeel in termen van distributie van het vaccin, vooral voor ontwikkelingslanden. Ten tweede is bekend dat hoge luchtdruk pDNA schade door afschuifkrachten, die het antigeen expressie kan verminderen veroorzaken. Een studie heeft aangetoond dat DNA schade tatoeage minder dan 3% van de totale pDNA 9. Ten slotte kan DNA tatoeëren bestrijken een groot deel van de huid, die mogelijk wekken een sterkere immuunrespons. Tatoeëren apparaten kunnen ook gebruikt worden om peptide / proteïne vaccins leveren en zijn bewezen induceren zowel humorale en celgemedieerde immuunresponsen 10. We gebruiken nu de huid tatoeëren routinematig in onze dierproeven in een DNA-prime-eiwit boost protocol (vaccinatie drie DNA-priemgetallen gevolgddoor twee eiwit verhoogt gedurende 16 weken) en hebben we met succes geïnduceerd in muizen sterke immuunrespons tegen HIV-1 gp120.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
We willen graag alle leden van de Kong Lab en Dr Yan Deng bedanken Microscopy Core, Office of Collaborative Wetenschap, NYUMC voor hun hulp en technische ondersteuning. Dit werk werd ondersteund door een pilot subsidie van de New York University Center for AIDS Research (CFAR, NIH subsidie AI027742).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pCX-EGFP plasmid DNA | Clontech | ||
| STEALTH Rotary Tattoo System | Worldwide Tattoo Supply | STEALTH-L | |
| Tattoo needles | Worldwide Tattoo Supply | 1207RSB | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
| 0.22 μm PVDF sterile filter | Millipore | SLGV013SL | |
| electrical hair trimmer | Commercially available | ||
| disposable safety razors | Commercially available | ||
| Silver Sulfadiazine Cream | Watson | NDC 0591-0810-55 | |
| Ketamine HCL | NDC 0856-2012-01 | ||
| Zylazine Sterile Solution | NADA 139-236 |
References
- Bins, A. D. A rapid and potent DNA vaccination strategy defined by in vivo monitoring of antigen expression. Nat Med. 11, 899-904 (2005).
- Pokorna, D., Rubio, I., Muller, M. DNA-vaccination via tattooing induces stronger humoral and cellular immune responses than intramuscular delivery supported by molecular adjuvants. Genet. Vaccines Ther. 6, 4 (2008).
- van den Berg, J. H. Optimization of intradermal vaccination by DNA tattooing in human skin. Hum. Gene Ther. 20, 181-189 (2009).
- Liu, M. A.
- Koide, Y., Nagata, T., Yoshida, A., Uchijima, M.
- Peachman, K. K., Rao, M., Alving, C. R. Immunization with DNA through the skin. Methods. 31, 232-242 (2003).
- Verstrepen, B. E. Improved HIV-1 specific T-cell responses by short-interval DNA tattooing as compared to intramuscular immunization in non-human primates. Vaccine. 26, 3346-3351 (2008).
- Potthoff, A. Immunogenicity and efficacy of intradermal tattoo immunization with adenoviral vector vaccines. Vaccine. 27, 2768-2774 (2009).
- Quaak, S. G. DNA tattoo vaccination: effect on plasmid purity and transfection efficiency of different topoisoforms. J. Control Release. 139, 153-159 (2009).
- Pokorna, D. Vaccination with human papillomavirus type 16-derived peptides using a tattoo device. Vaccine. 27, 3519-3529 (2009).
