Summary
קעקוע עור הוא דרך חזקה ובטוחה לאספקת חיסון DNA intradermally. כאן, EGFP קידוד DNA פלסמיד מועבר בקעקוע על העור של עכבר מעבדה, והביטוי של EGFP בתאי העור ואז ייבדק על ידי מיקרוסקופיה confocal.
Abstract
חיסון מבוסס חומצת גרעין הוא נושא להתעניינות הולכת וגובר, במיוחד DNA פלסמיד (pDNA) קידוד אנטיגנים immunologically חשובים. לאחר pDNA המהונדס ניתן לחיסונים, הוא עבד ותרגם לחלבוני immunogen שיכול לעורר תגובות מהמערכת החיסונית. דרכים רבות של אספקת חיסוני DNA נחקרו, אך כל מסלול יש יתרונות ומשלוח חסרונות משלה. קעקוע עור הוא טכניקה חדשנית שהיא בטוח, יעיל וחסכוני, ונוח. בנוסף, נקבים שנגרמו על ידי המחט יכולים גם לשמש כאדג'ובנט חזק. כאן, אנו) להפגין משלוח intradermal של קידוד ה-DNA פלסמיד משופר ירוק זרחני חלבון (PCX-EGFP) במודל של עכברים באמצעות מכשיר קעקוע וב) לאשר את הביטוי האפקטיבי של EGFP בתאי העור באמצעות מיקרוסקופיה confocal.
Protocol
1. טיהור DNA פלסמיד
- להפוך האיקריוטים פלסמיד דנ"א קידוד EGFP (PCX-EGFP) לתוך תאים מוסמכים DH5α E.coli. וקטור PCX הריק עשוי לשמש גם כשלט שלילי.
- תרבות וקציר תאי DH5α E.coli ולטהר pDNA פי מדריך טיהור פלסמיד Qiagen EndoFree.
- פתרון סינון pDNA דרך 0.22 מיקרומטר PVDF סטרילי מסנן, ולאחסן אותו ב -20 ° C עד לשימוש.
2. הכנת מערכת קעקוע
- חבר את יחידת כף היד ודוושת שליטה ליחידת אספקת החשמל להוראות היצרן.
- הגדר את תדר תנודת המחט לכ 100 הרץ. למכשיר הקעקוע שבחרנו (מערכת התגנבות קעקוע רוטרי), מחוג באספקת החשמל צריכה להיות מוגדרת 4 וולט. עיין במדריכים למשתמש או תמיכה טכנית למערכות קעקוע אחרות.
- לעקר את מחט arקרן לפני השימוש. אנו ממליצים להשתמש במערך מחט אחת לכל חיים. המחטים ניתן לעשות שימוש חוזרות לאחר שניקה עם מים וסבון וautoclaved.
- התקן את מערך המחט לתוך יחידת כף היד ורפיון לצרף אחיזה מהפלסטיק.
- לכוונן את עומק המחט להגדרה מתאימה באמצעות ההעברה למעלה או למטה אחיזה מהפלסטיק. אנחנו השתמשנו בעומק של כ מחט 0.5 מ"מ לצורך ניסוי העכבר שלנו.
- להדק את אחיזת הפלסטיק כאשר עומק המחט מוגדר כראוי, ומערכת הקעקוע היא מוכנה לשימוש.
3. גילוח בעלי חיים
- בחר את האתר לטיפול בקעקוע. האתר צריך להיות אזור יחסית חזק, שטוח, ובשרני של העור, למשל, את הצד של hindleg של בעל החיים.
- הרדם עכבר BALB / ג בתערובת של קטמין (90 מ"ג / ק"ג) וxylazine (5 מ"ג / ק"ג) בהתאם למשקל גופו של בעל החיים. לבעלי חיים אחרים, עיין בהנחיות ההרדמה של המוסד שלך.
- בדקורפלקסים של בעלי החיים על ידי צובט את הרגל כדי לאשר את החיה מורדם כראוי.
- השתמש גוזם החשמלי כדי לקצץ את השיער ברגלי האחורית של בעלי החיים לאט ובזהירות. להסיר את השיער מאתר הקעקוע המתוכנן וסביבתו.
- הסרת שיער הקצר יותר שיירים עם גילוח חד הפעמי. היזהר שלא לחתוך את עורו של בעל החיים. שימו לב שקרם הסרת שיער יכול לשמש כחלופה לשיטת הסרת שיער, אך אנו מעדיפים גילוח על קרם הסרת שיער.
- הסרת שערות תועות מלחתוך את העור עם אוויר דחוס במידת צורך.
4. משלוח של ה-DNA פלסמיד ידי קעקוע
- אם פרוטוקול חיסונים כבר נקבע בעבר, המינון והנפח של פתרון ה-DNA כדי להיות מיושם צריכים להיות מחושבים בהתאם. אנו ממליצים להשתמש כקטן נפח מעשי כדי להפוך את תהליך הקעקוע יותר לניהול. בהפגנת EGFP זה, השתמש 7.5 μl של פתרון ה-DNA בקוןcentration של 0.25 מ"ג / מ"ל, שהוחל על אזור קעקוע של כ 1 סנטימטר 2. על ניסויים של חיסון, ריכוזי pDNA גבוהים יותר עלולים להידרש כדי לגרום 1,2 תגובות חיסוניים חזק.
- להחיל את פתרון ה-DNA על ידי pipetting ישירות על גבי אתר קעקוע. לחלופין, טען את פתרון ה-DNA לתוך אחיזת הפלסטיק על ידי pipetting, כך שהנוזלים תלויים בין המחט וקצה אחיזה מפלסטיק. עיין בווידאו להפגנה. יש לנו לא הבחנתי בשום הבדל בולט בין שתי שיטות. עם זאת, טעינת הפתרון לאחיזת הפלסטיק עשויה להיות יתרון על משטחים אנכיים עור, למשל.
- התחל תנודת המחט ולמקם את מערך המחט עם לחץ קל על עורו של בעל החיים באתר הקעקוע. ואז להזיז את מחט נדנוד עדינות ובאיטיות באופן ליניארי לספק DNA פלסמיד מעל האזור כולו הקעקוע. שמור על זווית של 90 מעלות בין המחט והעור, כדי למנועחתכים על העור.
- שים לב לעור. שחיקה ודלקת הם נורמלים. אם דימום קורה, לעצור את תהליך הקעקוע ולהקטין את עומק המחט.
- המשך בתנועת המחט כ 1 דקות, ולאחר מכן לעצור את תהליך הקעקוע.
- השתמש במטלית כותנה נקיה כדי למרוח שכבה דקה של משככי כאבים מקומיים באתר הקעקוע. משככי כאבים מקומיים כגון קרם סילבר Sulfadiazine (קרם SSD) או משחת כוהל יכולים לעזור להקל על כאב או המצוקה של בעלי החיים, ולכן מומלץ ליישם אותם לפני ההרדמה פגה. הקפד על החיות למחרת לסימנים של כאב או מצוקה (שינוי בהליכה, חוסר פעילות). מרח את קרם שמנת משכך כאבים אם הסימנים נמשכים.
5. אישור על ביטוי Antigen
- 48 שעות לאחר טיפול הקעקוע (שים לב שמבני pDNA שונים עשויים לדרוש פעמי ביטוי שונות), העכבר מורדם ב -2 הרדמת CO. לאחרחיות, לעיין בהנחיות מתות החסד של המוסד שלך.
- מנתח את העור באזור הקעקוע, ולתקן רקמות בparaformaldehyde 4% ב 4 ° C למשך הלילה.
- שטוף את הרקמה עם אתנול 70%, ולהעביר אותו ל1X PBS להדמיה.
- לבחון את כל הרקמות באמצעות confocal מיקרוסקופ כדי לבדוק אם אותות EGFP. לחלופין, רקמת העור יכולה להיות מוטבעת בשעוות פרפין ובדקה בסעיפים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הביטוי של EGFP עם שיא עירור ב488 ננומטר ושיא פליטה ב 509 ננומטר ניתן להבחין בתאי עור של עכבר. ממינון 1.875 מיקרוגרם של ה-DNA, המכיל כ 3 × 10 17 עותקים של פלסמיד, אנחנו בדרך כלל 10-20 נצפינו אותות EGFP ב1 הסנטימטר 2 מקועקעים אזור. מספר זה נמוך יחסית של תאי transfected עולה בקנה אחד עם התוצאות של 3 מחקר קודמים. ביטוי EGFP (איור 1) מספק ראיות לכך שEGFP פלסמיד נמסר לתאי העור של בעלי החיים באמצעות טכניקת ה-DNA קעקוע.
איור 1. ביטוי EGFP בתאי העור 48 שעות לאחר הטיפול בקעקוע hindleg של עכבר BALB / ג צופה עם confocal מיקרוסקופ. א) השלכה של אותות EGFP ממטוסי מוקדים מרובים. B) ביטוי EGFP בשרתא le.
פתרון בעיות
1. אין ביטוי אנטיגן מזוהה (למשל, אין שליטת אותות חיוביים EGFP).
- להגדיל את הריכוז של פתרון ה-DNA פלסמיד ב 2 - ל5-קיפול. אנו ממליצים להתחיל ריכוז של 0.2 מ"ג / מ"ל. ריכוזים גבוהים כמו 5 מ"ג / מ"ל דווחו לדנ"א קעקוע ניסויים 3.
- הימנע מניזק חמור לעור, כמו עור של עכבר באתר הקעקוע הוא לחתוך בקלות על ידי סכיני הגילוח והמחטים.
- ודא מבנה ה-DNA מתאים לניסוי.
- בצע אלקטרופורזה ג'ל כדי לוודא רוב ה-DNA פלסמיד הוא בצורה מעגלית supercoiled או סגורה.
2. דימום או ניזק לעור חמור מתרחש באתר הקעקוע.
- להקטין את עומק המחט.
- שמור על זווית של 90 מעלות בין מערך המחט והעור.
- להקטין את הכח המופעל במהלךקעקוע טיפול.
- להקטין את המהירות של תנועת הקעקוע.
3. אות הרקע היא כאשר ההדמיה EGFP גבוהה מדי.
- השתמש גילוח חד פעמי חדש לגמרי כדי להסיר אותה כמות שיער שאפשר לפני הקעקוע. לפעמים יש צורך לגלח שוב לפני הנתיחה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
חיסון DNA נחשב בטוח יותר מאשר אסטרטגיות חיסון מסורתיות כפי שהוא אינו דורש מניפולציה שלו, או חושף את החיסונים לפתוגנים, חיים או מוחלשים 4. עם זאת, התוצאה של חיסון DNA תלויה בכבדות על מסלול המשלוח. עור הוא בשפע בתאי מציגי אנטיגן-, כגון תאים לנגרהנס ותאים דנדריטיים 1, ולכן אתר אידיאלי לחיסון במונחים של תגובה חיסונית ולהקל על גישת 5,6. כתוצאה מכך, אסטרטגית החיסון intradermal היא האחת האפשרויות הפופולריות ביותר לחיסוני DNA. כפי שניתן לראות בסרטון הזה, DNA קעקוע הוא דרך פשוטה אך מבטיח לנהל חיסון DNA intradermally. מעניין, את התגובות הדלקתיות הנגרמות על ידי תהליך הקעקוע יכולות גם לשמש כ1,2 משלים טבעי וחזק. זה כבר דווח כי קעקוע DNA יכול לעורר עד עלייה של פי 100 בתגובות תא T בקופים, בהשוואה לתגובות תא T בחי IMMunized דרך המסלול תוך שרירית 7,8. בהשוואה לשיטות אחרות עור משלוח, כגון אקדח הגנטי, ה-DNA קעקוע מחזיק במספר יתרונות. ראשית, קעקוע דנ"א אינו דורש ציוד יקר וספקים, כלומר חלקיקי זהב. זה יהיה יתרון עצום במונחים של הפצת חיסון, במיוחד למדינות מתפתחות. שנית, ידוע שלחץ אוויר גבוה יכול לגרום לניזק בשל כוח גזירת pDNA, אשר יכול להקטין את רמת ביטוי אנטיגן. מחקר הראה כי ניזקי קעקוע DNA פחות מ 3% מ9 pDNA המוחלט. לבסוף, קעקוע DNA יכול לכסות שטח גדול של עור, אשר עלול לעורר תגובה חיסונית חזקה יותר. מכשירי קיעקוע יכולים גם לשמש כדי לספק פפטיד / חלבון חיסונים, והוכחו לעורר תגובות חיסוניות הן לחויות בתיווך תא 10. כעת אנו משתמשים באופן שגרתי בעור קעקוע הניסויים בבעלי החיים שלנו בדנ"א דחיפת חיסון פרוטוקול (שלושה מספרים ראשוניים DNA פריים חלבון אחריעל ידי שני חלבונים מגביר על פני תקופה של 16 שבועות), ויש לנו בהצלחה בעכברים גרמו לתגובה חיסונית חזקה נגד HIV-1 gp120.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
Acknowledgments
ברצוננו להודות לכל החברים של קונג מעבדת ד"ר יאן דנג בליבה מיקרוסקופית, משרד המדע שיתופי, NYUMC על הסיוע והתמיכה טכנית. עבודה זו נתמכה על ידי מענק טייס מניו יורק מרכז האוניברסיטאי לחקר מחלת איידס (CFAR, מענק NIH AI027742).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pCX-EGFP plasmid DNA | Clontech | ||
| STEALTH Rotary Tattoo System | Worldwide Tattoo Supply | STEALTH-L | |
| Tattoo needles | Worldwide Tattoo Supply | 1207RSB | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
| 0.22 μm PVDF sterile filter | Millipore | SLGV013SL | |
| electrical hair trimmer | Commercially available | ||
| disposable safety razors | Commercially available | ||
| Silver Sulfadiazine Cream | Watson | NDC 0591-0810-55 | |
| Ketamine HCL | NDC 0856-2012-01 | ||
| Zylazine Sterile Solution | NADA 139-236 |
References
- Bins, A. D. A rapid and potent DNA vaccination strategy defined by in vivo monitoring of antigen expression. Nat Med. 11, 899-904 (2005).
- Pokorna, D., Rubio, I., Muller, M. DNA-vaccination via tattooing induces stronger humoral and cellular immune responses than intramuscular delivery supported by molecular adjuvants. Genet. Vaccines Ther. 6, 4 (2008).
- van den Berg, J. H. Optimization of intradermal vaccination by DNA tattooing in human skin. Hum. Gene Ther. 20, 181-189 (2009).
- Liu, M. A.
- Koide, Y., Nagata, T., Yoshida, A., Uchijima, M.
- Peachman, K. K., Rao, M., Alving, C. R. Immunization with DNA through the skin. Methods. 31, 232-242 (2003).
- Verstrepen, B. E. Improved HIV-1 specific T-cell responses by short-interval DNA tattooing as compared to intramuscular immunization in non-human primates. Vaccine. 26, 3346-3351 (2008).
- Potthoff, A. Immunogenicity and efficacy of intradermal tattoo immunization with adenoviral vector vaccines. Vaccine. 27, 2768-2774 (2009).
- Quaak, S. G. DNA tattoo vaccination: effect on plasmid purity and transfection efficiency of different topoisoforms. J. Control Release. 139, 153-159 (2009).
- Pokorna, D. Vaccination with human papillomavirus type 16-derived peptides using a tattoo device. Vaccine. 27, 3519-3529 (2009).
