Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Tüm Dağı RNA Floresan Published: January 30, 2013 doi: 10.3791/50057
Automatic Translation
*1,2, *1, 1, 1, 1,2, 1,2, 1, 1, 1,2
1Institut de Recherches Cliniques de Montréal (IRCM), 2Department of Biochemistry, Université de Montréal
* These authors contributed equally

Summary

Burada bir bütün montaj floresan tarif

Abstract

Bir gen, hem de kendi RNA transkripsiyonu hücre içi lokalizasyonu özellikleri, salgılama modelini değerlendirilmesi gelişme sırasında biyolojik işlevlerini anlamada için önemli özellikleri vardır. In situ hibridizasyon RNA (RNA-ISH) RNA dağılımı özelliklerine görselleştirmek için kullanılan güçlü bir yöntemdir, organizmalar, hücresel ya da hücre içi düzeylerinin 1 olması. RNA-ISH bir mRNA veya ilgi içinde bir 2 kodlayıcı olmayan RNA hedef sekansına tamamlayıcı bir etiketli nükleik asit sondası (örneğin, antisens RNA, oligonükleotidler) ve hibridizasyon dayanmaktadır. Işlem dizi spesifik prob oluşturmak için tek başına birincil sıralama bilgisinin gerektirdiği gibi, evrensel organizmalar ve doku örnekler, 3, geniş bir alanda uygulanabilir. Gerçekten de, büyük ölçekli ISH çalışmalar bir dizi gen ekspresyon belgelemek ve çeşitli model organizmaların yerelleştirme dinamikleri RNA uygulanan edilmiştir hangi yol açtıönemli topluluk kaynaklarını 4-11 kurulması. Prob etiketleme ve algılama çeşitli stratejiler yılda geliştirilmiş olmasına rağmen, floresan-etiketli algılama reaktifler ve enzimatik sinyal amplifikasyon adımlar kombine kullanımı prosedürü 12 hassasiyet ve çözünürlük önemli iyileştirmeler sunuyor. Burada sahnelenen Drosophila embriyolar RNA ekspresyonu ve lokalizasyonu dinamikleri görselleştirmek için tyramide sinyal amplifikasyon (TSA) kullanılarak in situ hibridizasyon metodu (FISH), optimize edilmiş floresan tarif. Işlem çok sayıda numune eş zamanlı olarak işlem kolaylaştırır 96-kuyulu plaka PCR formatında gerçekleştirilir.

Protocol

1. RNA Prob Hazırlanması

Genel Bakış: Aşağıdaki bölümde FISH için uygundur digoxigenin (Dig) etiketli RNA problar yapmak için gereken adımları açıklar. İlk adım, bir klonlama ya da dizi spesifik prob oluşturmak için kullanılacak bir ilgi geninin transkripsiyonu bölgeye karşılık gelen bir dizi yükselterek PCR ile yapılır. Bu, çoklu klonlama sitesi sonra oluşturulmuş arttırıcı dizileri dahil komşu primerler kullanılarak PCR için bir şablon olarak hizmet edebilir bakteriyofaj promotör elemanları (T7, T3 ya da SP6) ile takviye edildiği bir plazmid içine ilk klonlama gen segmenti ile elde edilebilir böylece her bir uç (Şekil 1A) farklı promotor sekansları olan bir doğrusal PCR ürünü üreten. : Alternatif olarak, klonlama aşaması önlemek için, bir de genomik DNA ya da cDNA, T3, T7, ya da 5 'uçlarında SP6 dizileri (örneğin, T7 içeren oligonükleotidler kullanılarak PCR amplifikasyon gerçekleştirebilir5'-TAATACGACTCACTATAGGGAGA-3 '; T3: 5'-AATTAACCCTCACTAAAGGGAGA-3'; SP6: 5'-ATTTAGGTGACACTATAGAAGAG-3 '). Doğrusal PCR ürünleri daha sonra çalıştırmak mahsus uygun polimerazı (Şekil 1B) ile in vitro olarak transkripsiyonu ile DIG-labeled duyu veya antisense RNA probları sağlamak için şablon olarak kullanılır. Belirli genler için problar yaparken, biz FISH sinyal spesifitesi (yani faiz gen antisens yönde transkripsiyonu sürece değerlendirmek için yararlı olacak farklı polimerazlar kullanılarak duygusu ve antisens RNA problar hem hazırlanması tavsiye, sense RNA probu ortaya çıkaracaktır arka sinyal seviyesi). Aşağıdaki adımların tümünü, bir (örneğin su, ilk% 70 etanol veya ticari RNAse dekontaminasyon çözümleri ile tüm tezgah alanları ve ekipmanın temizlik ve RNAse-ücretsiz kaynakları kullanarak kirletici ribonükleazlar (RNaz) tarafından potansiyel düşüşü önlemek için büyük özen ipuçları, mikrosantrifüj tüpleri).

Anneterials

  • 1.5 ml mikrosantrifüj tüpleri, (Abgene, Rochester, NY, ABD Cat. No 0900)
  • Jel-ekstraksiyon kitleri (QIAGEN, Mississauga, ON, Kanada;. Cat No 28706).
  • RNAse ücretsiz su (Wisent, Inc Kat. No 809-115-CL)
  • RNA polimeraz (T3, T7, ya da SP6). (20 U / ul, Fermentas Biosciences. Cat. No EP0101, EP0111, EP0131).
  • RNAse-OUT Ribonükleaz inhibitörü (40 U / ml '), (Invitrogen, Burlington. Canada.Cat. No 10777-019 ON).
  • Digoxigenin (DIG) nükleotid karışımları (DIG-11-UTP, Roche Uygulamalı Biosciences, Laval, QC, Kanada. Cat. No.11209256910).

Ekipman

  • Masa üstü mikro-santrifüj
  • Jel elektroforez cihazları
  1. PCR genomik DNA, cDNA, veya bakteriyofaj T7 ve T3 ya da SP6 promoter dizileri ile çevrili bir doğrusal PCR ürünü üretmek için plazmid DNA ile gen spesifik sekans yükseltmek. PCR koşulları için üretici tavsiyelerine uyun.
  2. Kalite ve si doğrulamaagaroz jel elektroforezi ile PCR ürünü ze. Tavsiyeler üretir ve 50 ul tampon içinde ürün elüt edilmesi için uygun bir standart Jel çıkarma kiti kullanılarak Tüketim ve temizleyen bir PCR ürünü.
  3. 3M sodyum asetat (pH 5.2) ve buz gibi soğuk% 100 etanol 150 ul 5 ul ilave edilerek PCR ürünü çökeltmek ve -70 ° C'da gece boyunca tüpleri. 4 ° C 'de 10 dakika boyunca 13.000 x g'de santrifüje tüpler ve% 70 etanol ile pelet yıkayın. Yeniden Spin, etanol ve hava pelet kuru tüm izlerini kaldırmak. RNAse-serbest su 25-50 ul süspanse edin.
  4. 10X T7 transkripsiyon tamponu 2 ul (Invitrogen), RNAse inhibitörü, 2 ul Dig-NTP karışımı 1 ul (20 U / ml ') aşağıdaki gibi bir 20 mikrolitre reaksiyon içinde 200-500 ng saflaştırılmış PCR ürünü kullanılarak DIG-etiketli prob uyarlamak ve 2 ul T7 RNA polimeraz (20 U / ml 'den). RNAse-serbest su ile 20 ul son hacim getirin. 3-4 saat boyunca 37 ° C 'de transkripsiyon reaksiyon inkübe edin.
  5. Transc ayarlayınRNAse-serbest su ile 50 ul ription karışımı ve benzeri gibi Aşama 4'te tarif DIG-labeled RNA probu hızlandırabilir. RNAse-serbest su ve 100 ul içinde yıkanmış RNA pelet yeniden süspanse edin. -70 ° C'de saklayın numuneleri yeniden süspanse
  6. Bir Nanodrop spektrofotometre kullanılarak prob sayısal. Prob kalitesini doğrulamak için, etidyum bromür ile% 1-2 agaroz jel lekeli bir 1-2 ul örnek çalıştırın.

2. Drosophila embriyolar toplanması ve Fiksasyon

Genel Bakış: Bu bölümde sahnelenen Drosophila embriyo toplama ve işleme için gereken adımları açıklar. Ihtiyaç duyulan embriyo sayısına bağlı olarak, farklı büyüklükte sinekler nüfus kafesler içinde muhafaza edilebilir. Koleksiyonları 100mm elma suyu toplama plakaları kullanılarak 900 cm 3 silindirik kafesler kullanılarak yapılır için aşağıdaki adımlar vardır. Uygun fiksasyon embriyo çevreleyen iki koruyucu katmanlarının çıkarılması gerekir: Dış koryon ve iç Vitelline zar 13. Bir kez hasat edilir, embriyolar birinci koryon çıkarmak için% 50 ağartıcı çözelti ile yıkanmış, daha sonra da heptan (vitellin zar permeabilizes) ve PBS% 3.7 formaldehit ihtiva eden ihtiva eden bir iki fazlı çözelti içinde karıştırılır. Vitellin zar sonra kırık ve heptan ile metanol ve bifazik bir karışım içine embriyo transfer ile ortadan kaldırılmaktadır. Uygun embriyo fiksasyon ve vitellin membran çıkarılması mansap FISH prosedürünün başarısı için kritik öneme sahiptir.

Malzemeler

  • Apple suyu on sent büyüklüğünde maya hamurlu agar plaklarına (% 40 elma suyu,% 4 sakkaroz,% 3.5 agar,% 0.3 metil paraben) (ekmek mayası tereyağı tutarlılık su ile karıştırılarak)
  • Toz paraformaldehid (Elektron Mikroskobu Bilimler, Hatfield, PA, USA;. Cat No 19208)
  • Heptan
  • Metanol
  • 3% Bleach çözümü
  • 20 ml cam sintilasyon şişeleri (Kanada, Thermo Fisher Scientific, Ottawa;. Cat No 03-337-15).

Ekipman

  • Nüfus kafesleri
  • Toplama sepetler (Nitex bir ağ ve bir delik kapak olarak kesilmiş olan bir kesik 50 ml polipropilen tüpün üst kısmını kullanarak yapılır).
  • Küçük boya fırçası
  • Masa üstü vorteks
  1. 25 1 saat için taze elma suyu / maya plaka ile Pre-net, iyi beslenen nüfusun kafesleri ° C.
  2. Erken evre embriyo hasat kafese yeni bir elma suyu / maya plaka ekleyin. 25 4 saat boyunca kafes inkübe ° C (toplama saatleri istenen aşamaları bağlı olarak ayarlanabilir unutmayın).
  3. 3.7 g paraformaldehid tozu, 2N KOH 70 ul ve kimyasal başlık altında bir bardak sintilasyon flakon milliQ su 7.3 ml birleştirerek yeni bir% 37 formaldehit solüsyonu hazırlayın. Paraformaldehid tozu tamamen eriyene kadar yeni sintilasyon şişenin içine oda sıcaklığında ve filtre sonra serin, kaynatıp.
  4. Bir bifazik fiksasyon çözeltisi hazırlayındaha sonra 7.5 ml heptan ekleyerek, bir sintilasyon şişesi içinde% 37 formaldehit 250 ml ile 1X PBS içinde 2.25 ml birleştirerek.
  5. Kafesinden elma suyu plaka Harvest ve oda sıcaklığındaki musluk suyu biraz ekleyerek ve ince fırça ile plaka embriyolar fırçalayarak embriyolar toplamak. Bir sepet içine yeniden süspanse embriyo transferi ve ılık musluk suyu ile durulayın.
  6. Çamaşır suyu çözeltisi içinde toplama sepetleri banyo tarafından 90 sn Dechorionate embriyolar, daha sonra ılık musluk suyu (çamaşır suyu kokusu gidene kadar) ile iyice yıkayınız.
  7. Toplama sepeti sökün, hafifçe bir fırça kullanılarak embriyolar toplamak ve bifazik tesbit çözeltisi içine aktarabilirsiniz. Embriyolar PBS ve heptan katmanları arasındaki arayüzü de birikir.
  8. Mühür sintilasyon şişeleri ve bir vorteks mikser sabitleyin. Düşük ayarda 20 dakika boyunca çalkalanır.
  9. Çıkarın ve Pasteur pipeti kullanarak alt PBS ve üst heptan aşamalarının çoğu atın. Soluklupipet içine geri kalan PBS / heptan / embriyolar karışımı. Damla damla moda, embriyolar ortadan kaldırmak için özen, pipetle alt PBS faz atın. Bir 500 ul heptan iki fazlı çözelti (üst faz) ve 500 ul metanol (alt faz) ihtiva eden 1.5 ml bir tüp içine embriyolar yatır.
  10. Vitellin membranlar çatlamak 30-45 sn için elle kuvvetlice tüpler sallayın. Bir kere kırık, embriyoların metanol içine batar.
  11. Heptan / metanol ara yüzeyinde üst faz heptan ve çatlamamış embriyolar Sil ve metanol 500 ul ilave edin. 5 saniye sallayın.
  12. Metanol ile 3 kere yıkayın ve -20 ° C (bu noktada embriyolar hafta / ay süreyle saklanabilir) de embriyolar saklayın.

3. Post-fiksasyon İşleme, Hibritleşme ve Post-hibridizasyon Yıkama

Genel Bakış: BALIK Bu bölüm detayları embriyo permeabilization için işlem adımları önceden, öncesi melezleme,RNA problar ve post-hibridizasyon yıkar ile hibridizasyon. İlk permeabilization adımlar için embriyolar tek bir tüp (aşağıdaki adımları 1-9, yerleşmiş embriyo / numune 10-15 ul amaçlayan) bir havuz olarak işlenir, ancak bir 96-PCR plate bireysel kuyulara aliquoted edilir Ön hibridizasyon adım (Adım 10) ile devam etmeden önce. Bu deney ilk aşamalarında bile her embriyo tedavi edilmesine yardım eder. Bir BALIK deney kurarken, bireysel deneylerde arka sinyal seviyesini belirlemek için negatif kontroller dahil etmek önemlidir. Bunun için bölüm 1, tipik bir 'no-prob' koşulu ile karşılaştırılabilir bir sinyal verecektir 'anlamda' RNA probu ile melez bir örnek belirtildiği gibi, 'no-prob' numune dahil tavsiye ve.

Malzemeler:

  • Metanol
  • Fosfat% 0.1 Tween-20 (PBT) ile tamponlu salin
  • Proteinaz-K, 1 mg / ml stok çözeltisi (Sigma Aldrich, Oakville, ON, Kanada. Katalog No P2308)
  • Glisin (20 mg / ml stok çözeltisi)
  • Hibritleşme çözeltisi:% 50 formamid, 5X SSC,% 0.1 Tween-20, yamultulmuş somon sperm DNA, 100 g / ml, 100 ug / ml heparin.
  • 0.2 ml 96-PCR plakaları, Abgene, Rochester, NY, ABD halfskirted Cat. 0900 yok)

Ekipman

  • 56 ile ayarlanabilir Hibridizasyon fırını, dijital ısıtma bloğu ya da su banyosu ° C, 80 ° C veya 100 ° C ya da bir PCR makinesi.
  • Çok kanallı pipet (yıkama adımları basitleştirmek için önerilir)
  • Karıştırıcı sallanan yanda
  1. PBT iki kez daha sonra PBT, ve: metanol 1:1 lik bir karışım, daha sonra metanol içinde embriyolar durulayın.
  2. PBT bir nutator sürekli sallama ile% 3.7 formalin (adım 11 'de tarif edildiği gibi, taze hazırlanmış) ihtiva eden 1 ml içinde 20 dakika için embriyolar düzeltildi.
  3. PBT 2 dakika sallanan ise 3 kez embriyo yıkayın.
  4. 3 mg / PBT seyreltilir proteinaz K (PK) ml bir çözelti hazırlayın ve eklemekÖrnekler çözüm 500 ul. Sallayarak olmadan oda sıcaklığında 10 dakika için numune inkübe edin. Bir pipet ile jeti veya yavaşça tersine tüpler tarafından embriyoların her 2 dk karıştırın.
  5. 1 saat boyunca buz üzerinde embriyo örnekleri aktarın.
  6. Oda sıcaklığına örnekleri Taşı ve PK çözüm çıkarın. PBT + 2 mg / ml glisin 1 ml ile 2 dakika süreyle 2 kez yıkayın.
  7. Sallanan ile PBT +% 3,7 formaldehit 1 ml numune 20 dk Fix. Embriyolar PBT 5 kez durulayın.
  8. PBT ve Krm çözeltisi bir 1:1 karışımı 1 ml embriyolar durulayın. 100% Krm solüsyonu (bu aşamada embriyo -20 ° C'de birkaç gün / hafta saklanabilir) ve 0.5-1 ml ile değiştirin.
  9. 96-plaka (/ iyi, embriyoların zarar görmesini önlemek için geniş diyafram ipuçlarını kullanmaya özen yerleşen embriyoların ~ 10-15 ul için amaç) bireysel kuyulara tablet embriyolar.
  10. 5 dakika buz üzerinde serin sonra 5 dakika için ve Krm çözelti 100 ul / numune kaynatılır. Bu çözelti (Ön Krm) örnek ön melezleme için kullanılmıştır.
  11. Ön-Krm çözelti 100 ul / numune ilave edin ve 56 en az 2 saat süreyle inkübe ° C
  12. Her numune için, Krm çözeltisinden 100 ul prob ~ 100 ng sulandırmak. 80 Isı 5 dakika (birkaç saat ısıtılmış problar için buz üzerinde muhafaza edilebilir) boyunca buz üzerinde daha sonra serin 3 dk için ° C.
  13. Embriyolardan Öncesi Krm çözüm çıkarın ve RNA probu çözümü ile değiştirin.
  14. 12-16 saat süre ile 56 ° C 'de melezleşir.
  15. 56 de ön ısıtma aşağıdaki yıkama çözümler ° C: (A) 200 Krm çözeltisi ul / numune, (B) ve Krm 3:1 karışımından 100 ul / numune: PBT, bir (C) 100 ul / numune Krm 1:1 karışımı: PBT, (D) Krm 1:3 oranındaki karışımı 100 ul / numune: PBT, (E) PBT yaklaşık 400 ul / numune.
  16. Yıkama solüsyonu A 100 ul örnekleri durulayın, daha sonra 15 dakika her biri için 56 de çözümler MS 100 ul / numune ile yıkama adımı ° C gerçekleştirin. Daha sonra, 56 ° C'de E çözeltisi 100 ul / numune ile 5 dakika için numune 4 kez yıkayın
  17. Oda sıcaklığında Cool örnekleri.

Genel Bakış: Bu bölümde RNA prob sinyali aşağıdaki hibridizasyon dağılımını tespit etmek ve görselleştirmek için kullanılan antikorlar ve algılama reaktifler açıklar. Bu adımlar, Şekil 2, şematik olarak açıklanmaktadır. İşte biz güçlü sinyal amplifikasyon için kullandığınız standart saptama reaktifleri yalnızca mevcut, ancak protein-RNA çift için aynı anda farklı RNA'lar co-algılamak için çift BALIK deneyler özellikle çeşitli alternatifler olarak kullanılabilirler ticari reaktifler, orada var boyama. Bu protokol ile elde edilen sonuçlar örnekleri Şekil 3 mRNA / lokalizasyon desen mozaik görüntülenir.

Malzemeler

  • HRP-konjüge fare monoklonal anti-DIG (Jackson Immunoresearch Laboratories Inc Cat. No 200-032-156)
  • Biotin-konjüge fare monoklonal anti-DIG (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc Kedi. No 200-062-156)
  • Streptavidin-HRP konjugat (Molecular Probes, Eugene OR, ABD, Kedi. No.S991)
  • Cy3-tyramide konjugatları (Perkin Elmer Life Sciences, Boston, MA, USA, Cat. No SAT704A)
  • DABCO çözüm montaj: bir 50 ml tüp içinde, DABCO 1.25 gram seyreltik (1,4-diazabisiklo [2.2.2] oktan; Sigma D-2522) tam olarak kadar 1X PBS içinde 15 ml, sonra 35 ml gliserol ve karıştırılır homojen. PBS ile önceden karıştırmadan olarak, DABCO toz çok hızlı bir şekilde çözülür. -20 ° C'de saklayın montaj çözümü
  • Cam slayt, lamelleri

Ekipman

  • Karıştırıcı sallanan yanda
  • Kanallı pipet
  • Flüoresans mikroskobu
  1. PBT PBTB ihtiva eden çözelti, +% 1 yağsız kuru süt (genellikle 50-100 ml tüm tespit reaktif inkübasyon ve yıkama adımları için yeterli olan) hazırlayın.
  2. Nutator sallanan ise PBTB 100 ul / numune içinde oda sıcaklığında 10 dakika için örnekler engelleme.
    3. <li> sallanan ile 100 ul / numune monoklonal biyotin anti-DIG antikor çözüm (PBTB içine stoktan 1/400 seyreltilmiş) ile oda sıcaklığında 1.5-2 saat boyunca embriyo ve inkübe örnekleri engelleme çözüm çıkarın.
  3. Her sallanan ile 100 ul PBTB / numune ile 5 dakika boyunca numuneler 6 kez yıkayın.
  4. Sallanan ile streptavidin-HRP çözeltisi (PBTB, 10 ug / ml nihai konsantrasyonda stok ile 1/100 sulandırılmış) 75 ml / numune ile, oda sıcaklığında 1.5 saat inkübe edin.
  5. Örnekleri yıkayın 5 dakika boyunca 6 kere her sallanan (DNA counterstaining için, PBTB içinde 1X çalışma konsantrasyonu DAPI sulandırmak ve ilk yıkama adımda bu çözümü kullanabilirsiniz) ile 100 ul PBTB / örnek.
  6. PBT embriyolar durulayın, daha sonra PBS ile 5 dakika boyunca 2 kez yıkayın.
  7. Cy3-tyramide çözeltisi (Tyramide amplifikasyon tampon içinde 1/50 seyreltilmiş), 50 ul / numune ile nutator oda sıcaklığında 2 saat için örnekler inkübe edin. Bu adımı itibaren, hafif korumalı priz örnekleri tutmak için emin olun. </ Li>
  8. 5 dk Her nutator 100 ul PBS / numune ile numuneler 6 kez yıkayın.
  9. PBS çıkarın ve% 70 gliserol ve% 2.5 (DABCO) içeren montaj çözümü 100-125 ul / örnek ekleyin. Mağaza numuneler 4 ° C'de Bu örnekler, birkaç yıl boyunca saklanabilir.
  10. Geniş çaplı ucu ile hafifçe örnekleri pipetleme embriyoların tekrar süspansiyon ve bir cam slayt üzerine embriyoların 25 ul aktarın, sonra tırnak cilası ile slayt üzerine embriyolar ve mühür üzerine lamel yerleştirin.
  11. Bir floresan mikroskop kullanılarak embriyo örnekleri analiz edin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Başarıyla yapıldığında, bu işlem erken Drosophila embriyogenez sırasında gen ekspresyonu ve mRNA lokalizasyonu dinamiklerinin uzay-zamansal analiz içerisinde detaylı bir çarpıcı gelişmiş seviyede sunuyor. Klasik çift-kural gen bücür (run) için Şekil 3A'da gösterildiği gibi, aslında tek çekirdekler ifade gruplarında henüz olgunlaşmamış transkript odaklarının tespiti yoluyla gen ekspresyonu olayları gözlemlemek için bu protokolü kullanabilirsiniz. Buna ek olarak, Şekil 3B'de embriyo mozaik içinde gösterildiği üzere, yöntem, yüksek çözünürlüklü mRNA yerelleştirme özellikleri görüntüleri sağlar.

Şekil 1
Şekil 1. RNA probu hazırlığı prosedürü Anahat. Vitro transkripsiyon istimal bölgesindeki tarafından Dig-etiketli RNA problar sentezleme için strateji (A) şematik gösterimiga lineer DNA şablonu bakteriyofaj RNA polimeraz promotörü elemanları ile çevrili. (B) Standart% 1 agaroz jel histon H2A, çalıştırma ve doc transpozon RNA'lar için in vitro transkripsiyonu RNA probları örnekler gösteren resmi. Genellikle PCR şablonu ve hem de RNA probu ve bir yan-yana elektroforez gerçekleştirir. RNA genelde şablonuna göre daha yüksek mobilite ile yoğun bir ayrık bant olarak görünür

Şekil 2,
Şekil 2. FISH yönteminde prob algılama adımlarının şematik gösterimi. Işlenmiş embriyolar prob hibridizasyon takiben, Dig-işaretli problar sonra HRP-konjuge streptavidin ile kompleks bir biotinlenmiş α-Dig antikoru kullanılarak kaydedilir. Tyramide sinyal amplifikasyon (TSA) daha sonra serbest radikal formu t içine tyramide reaktif dönüşümü sonucunda gerçekleştirilirhrough HRP aktivitesi. Geçici reaktif tyramide serbest radikallerin kovalent prob konumundan kendi difüzyon uzaklıkta engelleyerek, yakındaki proteinlerin aromatik artıkları bağlamak. Tyramide alt tabaka floresan mikroskobu ile tespit edilebilir floresan boyalar ile kompleks oluşturur.

Şekil 3
Şekil 3,. Drosophila embriyolar mRNA ekspresyonu ve hücre içi lokalizasyonu desen çeşitliliği vurgulayarak bu FISH prosedürü kullanılarak elde edilen sonuçlar örnekleri. (A) embriyo farklı aşamalarında çalışan çifti-kural geni FISH analizi orta kısmı nasıl ilk geniş ifadesi ortaya koymaktadır embriyonik aşamada embriyo 4 ileri evrelerinde bölümlenmiş şerit deseni haline rafine edilir. (B) FISH sonuçları Mozaik tasviri mRNA localizatio çeşitleri gösterenevre 4-7 embriyolar n desenleri. BALIK biyotinile anti-Dig antikoru, streptavidin-HRP, ve Cy3 tyramide ile ardışık inkubasyon ile melezleştirilebilir ve tespit edildi DIG-labeled anti-duyum problar kullanılarak gerçekleştirildi. RNA = mavi, DNA = kırmızı. Ölçek çubuk (A) = 25 uM, bu süre içinde (B) = 50 uM.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Prob sentez adımlar için, biz genellikle Drosophila Gen Koleksiyonu (DGC), aşağıdaki web sitesinden ayrıntılı bir kaynak bulunan plazmidler amplifiye tam uzunlukta Drosophila DNA'larının in vitro transkripsiyon tarafından işletilen-off antisens RNA problar oluşturmak: http://www .fruitfly.org / DGC / index.html 14,15. Bu yaklaşım sinek embriyolar 9,16 haritalama gen ekspresyonu ve mRNA yerelleştirme desenler amaçlayan büyük ölçekli ISH çalışmalarda yaygın olarak kullanılmaktadır. DGC plazmidler Drosophila Genom Kaynak Merkezi (sipariş edilebilir https://dgrc.cgb.indiana.edu/vectors/ ). Başlangıç ​​maddeleri ve T7, SP6 veya T3 çıkıntılar özel primerler tasarımında esneklik spesifik mRNA izoformlarının (örn. alternatif olarak spliced ​​varyant) o algılamak için bir kolaylıkla probları oluşturmasına olanak sağlarr kodlamayan standart cDNA koleksiyonlarında temsil edilmemektedir RNA'lar. Tasarımı izoform-spesifik problar göz önüne alındığında, biz 250-1,000 üsleri arasında değişen şablonların mükemmel BALIK sonuçlar bulduk.

Sinek embriyolarda FISH için, karbonat tedavi fragmanı bizim probları değil; yerine biz 500-5,000 üsleri arasındaki boyutu değişebilir tam boy run-off transkript, kullanın. Büyük problar daha az geçirgen diğer dokularda BALIK gerçekleştirirken, parçalanma aslında prob penetrasyon iyilik olabilir. Ancak, biz küçük PCR-amplifiye DNA şablonları kullanarak probları hazırlarken veya birlikte birden fazla ayrı ayrı sentezlenen küçük problar havuzu yerine, değişken sonuçlar verir ve genel prob kalitesini düşürebilir büyük prob kimyasal parçalanma gerçekleştirme seçeneği tercih.

Embriyo toplama adımlarda açıklandığı gibi, biz genellikle embriyo toplama plakaları maya ezmesi ekleyin. Maya ezmesi büyük olacakYumurta üretimi beslenme ortamının 17 bağlıdır gibi, sinekler tarafından atılmıştır yumurta sayısını artırmak. Ayrıca, Drosophila sinekleri sık doğrudan maya hamur içine kendi yumurtalarını olacaktır. Bu embriyolar kolayca küçük bir boya fırçası kullanarak su yapıştırın maya çözen ve bir koleksiyon sepet üzerinden karışımı geçerek toplanabilir. Dechorionation adımda, su ile ticari çamaşır suyu (tipik olarak% 6 konsantrasyon) 1:1 seyreltilmesi ile hazırlanır% 3'lük bir çamaşır suyu solüsyonu için en çok kullanılan protokol 13,18,19 kullanılır. Bizim deneyim, biz 90 sn için% 3 çamaşır suyu çözeltisi ile embriyolar inkübe verimli dechorionation sunduğu bulduk. Bu parametreler mevcuttur ticari çamaşır suyu çözeltisi bağlı olarak ayarlanması gerekebilir, ancak bu örnekler zarar verebilir bu yana bir ağartıcı embriyolar pozlama için değil dikkat etmelisiniz. Daha yakından dechorionation prosedürü izlemek için, bir mikroskop t altında embriyolar bakmak mümkündüro dechorionation reaksiyonun tam olduğundan emin olun, onlar dechorionated zaman embriyolar dorsal uzantıları kaybeder yani. Eski çözümlerin çökelti eğilimi Son olarak, uygun embriyo fiksasyon sağlamak için, biz, taze hazırlanmış formaldehit çözümleri kullanın. Detaylı bilgi için bu işlem daha önceki yöntemler yazılar 13,18,19 de tarif edilmiştir.

Proteinaz K, ya da antikorlar ve bu protokolü açıklanan dilüsyonları kullanılarak Cy3-Tyramide, biz bulduk optimum sonuçlar olarak algılama reaktifleri ile embriyonik dokuların permeabilization ilişkin adımlar için. Ancak, laboratuvar ortamlarında ve reaktif stokları farklılıklar nedeniyle, her bir laboratuar ampirik kendi özel ihtiyaçları için en iyi çalışma konsantrasyonlarını belirlemek için kendi reaktiflerin test etmenizi öneririz. Buna ek olarak, en uygun reaktif konsantrasyonları analiz dokularda bağlı olarak değişebilir bulduk.

O FISH prosedürü sağlamak is sürekli tekrarlanabilir sonuçlar veren, biz her zaman iyi tanımlanmış ifade / lokalizasyon desenleri (örneğin çalışma) ile transkript için problar içerebilir, hangi testi için birkaç pozitif kontroller eklemenizi öneririz. Erken Drosophila embriyogenez sırasında çarpıcı mRNA lokalizasyonu desenleri ile Transkript Fly-FISH web sitesinde (bulunabilir http://fly-fish.ccbr.utoronto.ca/ ). Aksine, yukarıda da belirtildiği gibi arka sinyal algılama, kontrol etmek için, bir de 'no-prob' ve / veya sense RNA probu örnekleri içermelidir.

Bu protokolde tarif tyramide Cy3 eşleniği ilave olarak, çok renkli görüntü deneyler için ek bir esneklik sağlamak için Perkin Elmer Life Sciences veya Molecular Probes (Invitrogen, Canada, Inc), diğer ticari olarak temin florokrom-konjuge tyramide reaktifler, çeşitli var . Bu yöntem temel proced tasvir ederkentek RNA FISH, bu yöntemin varyasyonları için ure gibi çift RNA FISH veya RNA-protein ko-algılama gibi daha karmaşık denemeler için uygulanabilir. Bu işlemlere ilişkin ayrıntılar için, biz mevcut FISH yöntemleri kağıtları 18-20 açıklanan prosedürleri takip öneririz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Çıkar çatışması ilan etti.

Acknowledgments

Lecuyer laboratuarda yürütülen çalışmalar Ulusal Bilimler ve Kanada'nın Mühendislik Konseyi (NSERC), Sağlık Araştırması (CIHR) ve Fonds de Recherche en Santé du Québec (FRSQ) ve Kanada Enstitüsü fon tarafından desteklenmektedir. Carole Iampietro Angelo PIZZAGALLI doktora sonrası dostluk tarafından destekleniyor ise Fabio Alexis Lefebvre ve Gaël Moquin-Beaudry'den, NSERC lisans araştırma studentships tarafından desteklenmektedir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
T7, T3 or SP6 RNA Polymerase Fermentas Life Sciences EP0101,EP0111,EP0131 Kits contain reaction buffer.
DIG RNA Labeling Mix Roche Applied Science 11 277 073 910
RNAguard Amersham Biosciences 27-0816-01
3M sodium acetate
Cold 100% ethanol.
Cold 70% ethanol.
Chlorine bleach solution diluted 1:1 with water.
Heptane
Methanol
proteinase K Sigma Aldrich Oakville, ON, Canada Catalog No. P2308
40% formaldehyde solution, freshly prepared
PBS-Tween solution (PBT) 1xPBS, 0.1% Tween-20
Glycine solution 2 mg/ ml glycine in PBT
HRP-conjugated mouse monoclonal anti-DIG Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc 200-032- 156 (1/400 dilution of a 1 mg/ml stock solution in PBTB
HRP-conjugated sheep monoclonal anti-DIG Roche Applied Science, Laval, QC 1 207 733 1/500 dilution of stock solution in PBTB
Biotin-conjugated mouse monoclonal anti-DIG Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA, USA 200-062-156 (1/400 dilution of a 1 mg/ml stock solution in PBTB
Streptavidin-HRP conjugate Molecular Probes, Eugene OR, USA S991 (1/100 dilution of a 1 μg/ml stock

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wilcox, J. N. Fundamental principles of in situ hybridization. J. Histochem. Cytochem. 41, 1725-1733 (1993).
  2. Tautz, D., Pfeifle, C. A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback. Chromosoma. 98, 81-85 (1989).
  3. Lecuyer, E., Tomancak, P. Mapping the gene expression universe. Curr Opin Genet Dev. 18, 506-512 (2008).
  4. Tomancak, P., et al. Global analysis of patterns of gene expression during Drosophila embryogenesis. Genome Biol. 8, 2007-208 (2007).
  5. Thisse, B., et al. Spatial and temporal expression of the zebrafish genome by large-scale in situ hybridization screening. Methods Cell Biol. 77, 505-519 (2004).
  6. Quiring, R., et al. Large-scale expression screening by automated whole-mount in situ hybridization. Mech. Dev. 121, 971-976 (2004).
  7. Pollet, N., et al. An atlas of differential gene expression during early Xenopus embryogenesis. Mech. Dev. 122, 365-439 (2005).
  8. Lein, E. S., et al. Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain. Nature. 445, 168-176 (2007).
  9. Lecuyer, E., et al. Global analysis of mRNA localization reveals a prominent role in organizing cellular architecture and function. Cell. 131, 174-187 (2007).
  10. Imai, K. S., Levine, M., Satoh, N., Satou, Y. Regulatory blueprint for a chordate embryo. Science. 312, 1183-1187 (2006).
  11. Bell, G. W., Yatskievych, T. A., Antin, P. B. GEISHA, a whole-mount in situ hybridization gene expression screen in chicken embryos. Dev. Dyn. 229, 677-687 (2004).
  12. Wilkie, G. S., Shermoen, A. W., O'Farrell, P. H., Davis, I. Transcribed genes are localized according to chromosomal position within polarized Drosophila embryonic nuclei. Curr. Biol. 9, 1263-1266 (1999).
  13. Rothwell, W. F., Sullivan, W. Drosophila embryo dechorionation. CSH Protoc. , (2007).
  14. Stapleton, M., et al. The Drosophila gene collection: identification of putative full-length cDNAs for 70% of D. melanogaster genes. Genome Res. 12, 1294-1300 (2002).
  15. Rubin, G. M., et al. A Drosophila complementary DNA resource. Science. 287, 2222-2224 (2000).
  16. Tomancak, P., et al. Systematic determination of patterns of gene expression during Drosophila embryogenesis. Genome Biol. 3, (2002).
  17. Terashima, J., Bownes, M. Translating available food into the number of eggs laid by Drosophila melanogaster. Genetics. 167, 1711-1719 (2004).
  18. Lecuyer, E., Parthasarathy, N., Krause, H. M. Fluorescent in situ hybridization protocols in Drosophila embryos and tissues. Methods Mol. Biol. 420, 289-302 (2008).
  19. Lecuyer, E. High resolution fluorescent in situ hybridization in Drosophila. Methods Mol. Biol. 714, 31-47 (2011).
  20. Kosman, D., et al. Multiplex detection of RNA expression in Drosophila embryos. Science. 305, 846 (2004).

Tags

Gelişimsel Biyoloji Sayı 71 Hücresel Biyoloji Moleküler Biyoloji Genetik Genomik, Embriyo Floresan BALIK Gen Ekspresyonu Desen RNA Yerelleştirme RNA Tyramide Sinyal Amplifikasyon TSA nakavt meyve sineği tüm montaj embriyogenez hayvan modeli
Tüm Dağı RNA Floresan<em&gt; In situ</emVe&gt; Hibridizasyon<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriyolar
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Legendre, F., Cody, N., Iampietro,… More

Legendre, F., Cody, N., Iampietro, C., Bergalet, J., Lefebvre, F. A., Moquin-Beaudry, G., Zhang, O., Wang, X., Lécuyer, E. Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos. J. Vis. Exp. (71), e50057, doi:10.3791/50057 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter