Экспериментальные конструкции предлагаемого здесь сосредоточиться на изучении последствий воздействия алкоголя в апоптоз и применение нейротрофических пептида во время беременности в мозгу плода. Подробное описание из разведения в коллекцию плода мозг описывается. Методы определения апоптоза, также описаны в деталях.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Экспериментальные методы изучения влияния Нейротрофических пептида ADNF-9, против пьянства-индуцированного апоптоза в период беременности у мышей C57BL / 6
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Эксперимента для изучения влияния пренатального воздействия алкоголя на ранних эмбриональных стадиях развития плода в мозге являются сложными. В основном это связано с трудностью микродиссекции мозг плода и их срезов для определения апоптоза клеток вызвано пренатального воздействия алкоголя. Эксперименты, описанные здесь методы обеспечивают визуализированных от мышей селекции для идентификации гибель клеток в эмбриональной ткани мозга. В настоящем исследовании использованы C57BL / 6 мышей, как животная модель для изучения воздействия на плод алкоголя и роль трофических пептида против алкоголь-индуцированного апоптоза. Разведения состоит из 2-часового окна маты для определения точной стадии эмбрионального возраста. Модель создана плода воздействия алкоголя была использована в данном исследовании для определения влияния пренатального воздействия алкоголя в мозге плода. Это предполагает свободный доступ к алкоголю или пару кормили жидкой диеты в качестве единственного источника питательных веществ для беременных мышей.
Для исследования апоптоза, фетальный мозг первая встроенная в желатиновых использованием кожуры от формы, чтобы облегчить их секционирования с Vibratome аппарата. Плод мозг вставлена и зафиксирована в параформальдегид легко срезы и свободно плавающим секции могут быть установлены в SuperFrost слайдов, а также для определения апоптоза или гибель клеток.
TUNEL (TdT-опосредованного дУТФ Ник конец маркировки; TdT: терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы) анализ используют для определения гибели клеток или апоптоза клеток. Стоит отметить, что APoptosis и клеточно-опосредованной цитотоксичности характеризуются фрагментации ДНК. Таким образом, визуализированных TUNEL-положительных клеток свидетельствует о гибели клеток или апоптоза клеток.
Экспериментальный дизайн здесь предоставляют информацию об использовании установленной жидкую диету для изучения влияния алкоголя и роль нейротрофических пептидов во время беременности в фетальных мозгов. Это включает в выращивании и откорме беременных мышей, microdissecting плода мозг и определения апоптоза. Вместе, эти визуальные и текстовые методы могут быть источником для исследования пренатального воздействия вредных веществ в мозге плода.
Введение
Целью экспериментальных методов, описанных здесь является оценка нейропротекторное действие пептидов в трофических плода модель воздействия алкоголя с помощью нескольких методов с участием разведение, кормление, microdissecting и обнаружения гибели клеток. Работа из нашей лаборатории участвуют жидкую диету в сочетании с алкоголем в качестве модели умеренного употребления алкоголя, который может быть похож на человека в парадигме питьевой срока количество выпитого 1-5. Мы и другие определены три пептидные производные, которые являются нейропротекторное против вредных эффектов внутриутробного развития плода алкоголя. Исследования, изучающие воздействие алког....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Племенных животных и лечение трофических Пептид
- Порода C57BL/mice путем размещения самок мышей (~ в возрасте 6 недель, средний вес 20 г) в мужской клетке дома в течение 2 часов.
- Проверьте разъем спермы и / или вагинального мазка сразу после этого.
- Если положительно, назначить этот момент времени, как эмбриональный день 0 (E0).
- На E7, вес соответствии беременных самок контроля и лечения группы (3 группы) назначаются как описано недавно 4: 1) спирт (этанол) жидкость группа диета (ALC), 2) пара кормили контрольной группе (PF), 3) пептидной группы лечения, которое должно получают внутрибрюшинно (IP) инъекции ADNF-9 п....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Экспериментальные методы, описанные здесь, показывают, что 2-час разведение окна необходимо оценить точный гестационный стадии. Мы продемонстрировали рассечение эмбриона в возрасте E13. Мы также продемонстрировали микродиссекции плода мозги E13. Процедура включает несколько стадий (переменного тока), как описано на фигуре 1. Плод мозг расчлененный от основания зачатка обонятельной луковицы к основанию задний мозг (рис. 1). Плод мозг затем фиксировали в 4% параформальдег.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Методологии и технологии, представленные в этом исследовании продемонстрировать влияния пренатального воздействия алкоголя в мозге плода и роль трофических пептидов в предотвращение этих последствий. Они могут предоставить информацию о том, как изучать другие наркотики или других токсичных химических веществ в мозге плода на разных стадиях беременности.
Что касается разведения парадигмы, в некоторых случаях обнаружения спермы вилка не могут быть наблюдаемыми. В этот момент, важно, чтобы пров.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Нет раскрытия информации не должны быть сделаны.
Благодарности
Этот исследовательский проект был поддержан премию Число R21AA017735 (YS) из Национального института по злоупотреблению алкоголем и алкоголизму. Материал предназначен исключительно ответственности автора и не обязательно отражают официальную точку зрения Национального института по злоупотреблению алкоголем и алкоголизму или Национального института здоровья. Автор также хотел бы поблагодарить Charisse Монтгомери за редактирование этой рукописи.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Горки Superfrost Plus | VWR | 48311-703 | |
| PAP PEN | Research Products Int. Corp. | ||
| 5-Plend Open Mailer | Heathrow Scientific, LLC | HS 15983G | |
| Отклеивание встраиваемых форм | Электронная микроскопия Sciences | 70182 | |
| Набор для обнаружения гибели клеток in situ, POD | Roche Diagnostics, Inc | 11684817910 | |
| Сбалансированный солевой раствор Хэнкса | Invitrogen | 14170-120 | |
| Желатин типа А | FisherScientific | G8-500 | |
| Стереомикроскоп | W. NUHSBAUM, Inc | Leica M60, KL 200 LED | |
| Micro-Vibratome | Leica, Inc | Leica VT 1000S | |
| Moria Ультратонкие щипцы | Fine Science Tools | 11370-40 | 2 пары |
| Graduate 30 мл питательные трубки | Dyets, Inc | 900012 | |
| Vitamin Mix | Bio-Serv. Inc. | F8031 | |
| Минеральная смесь | Био-Серв. | F8598 | |
| Мальтоза Декстрин | Био-Серв. | 3650 | |
| Этиловый спирт 190 Proof, 5 галлонов | 111000190-SS05 | Pharmco-AAPER | |
| Вертикальный микроскоп | W. NUHSBAUM, Inc | LEICA DM 4000 |
Ссылки
- Sari, Y. Activity-dependent neuroprotective protein-derived peptide, NAP, preventing alcohol-induced apoptosis in fetal brain of C57BL/6 mouse. Neuroscience. 158 (4), 1426-1435 (2009).
- Sari, Y., Chiba, T., Yamada, M., Rebec, G. V., Aiso, S.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
