Summary
Protein komplekser katalysere viktige cellulære funksjoner. Detaljert funksjonell og strukturell karakterisering av mange essensielle komplekser krever rekombinant produksjon. MultiBac er en Baculovirus / insekt celle system spesielt skreddersydd for å uttrykke eukaryote proteiner og deres komplekser. MultiBac ble gjennomført som en åpen tilgang plattform, og standard operasjonsprosedyrer utviklet for å maksimere sin nytte.
Abstract
Proteomikk forskning avdekket den imponerende kompleksitet av eukaryote proteom i enestående detalj. Det er nå en vanlig akseptert oppfatning at proteiner i cellene for det meste ikke eksistere som isolerte enheter, men utøver sin biologiske aktivitet i forbindelse med mange andre proteiner, i mennesker ti eller mer, danner samlebånd i cellen for de fleste om ikke alle vitale funksjoner. Ett , 2 Kjennskap til funksjon og arkitektur av disse multiprotein forsamlinger krever sin bestemmelse i overlegen kvalitet og tilstrekkelig mengde for detaljert analyse. Den sparsommelige mange protein komplekser i cellene, spesielt i eukaryoter, forbyr deres utvinning fra innfødte kilder, og nødvendiggjør rekombinant produksjon. Baculovirus-ekspresjonsvektor-system (bevs) har vist seg å være spesielt nyttig for å produsere eukaryote proteiner, er avhengig av aktiviteten av dem ofte på post-translasjonell prosessering som andre vanlig brukte ekspresjonssystemer kan derimot ofteikke støtte. tre bevs bruke en rekombinant baculovirus i hvilke genet av interesse ble innsatt for å infisere insekt cellekulturer som i sin tur produserer proteinet av valget. MultiBac er en bevs som har blitt spesielt tilpasset for fremstilling av eukaryote protein komplekser som inneholder mange subenheter. 4. En viktig forutsetning for effektiv produksjon av proteiner og deres komplekser er robuste protokoller for alle trinn involvert i et uttrykk eksperiment som ideelt kan implementeres som standard operasjonsprosedyrer (SOP) og fulgt også av ikke-spesialiserte brukere med komparative letthet. Den MultiBac plattformen ved European Molecular Biology Laboratory (EMBL) bruker SOP for alle trinnene involvert i en multiprotein komplekst uttrykk eksperiment, fra innsetting av genene til en konstruert baculoviral genom optimalisert for heterologe protein produksjonsegenskaper til små-skala analyse av protein eksemplarer produsert. 5-8 The plattformer installert i et open-access-modus ved EMBL Grenoble og har støttet mange forskere fra akademia og industrien til å akselerere protein komplekse forskningsprosjekter.
Introduction
Biologisk aktivitet kontrolleres av sammenstillinger av proteiner og andre biomolekyler som virker sammen for å katalysere cellulære funksjoner. Kjente eksempler er maskiner som transcribes den arvelige informasjonen i DNA til messenger RNA. Hos mennesker, mer enn 100 proteinene kommer sammen i et definert og regulert prosess for å transkribere gener, utvikler store multiprotein komplekser med 10 og flere subenheter inkludert RNA-polymerase II og de generelle transkripsjonsfaktorer slik som TFIID, TFIIH og andre. 9. Andre eksempler er ribosomet, som består av mange proteiner og RNA-molekyler, som katalyserer proteinsyntese, eller det nukleære pore komplekset som er ansvarlig for skytteltrafikk biomolekyler gjennom den kjernefysiske konvolutt i eukaryoter. En detaljert arkitektonisk og biokjemiske disseksjon hos omtrent alle multikomponente maskiner i cellen er viktig å forstå deres funksjon. Strukturen klarlegging av prokaryote og eukaryotic ribosomer, for eksempel, utgjorde kjennetegn hendelser ettergivende enestående innblikk i hvordan disse makromolekylære maskiner utføre sine utpekte funksjoner i cellen. 10,11
Ribosomer kan oppnås i tilstrekkelig kvalitet og kvantitet for detaljert studium ved rensing av det endogene materiale fra dyrkede celler, på grunn av det faktum at opptil 30% av den cellulære masse består av ribosomene. RNA polymerase II er allerede mindre rikelig ved størrelsesordener, og mange tusen liter av gjærkultur måtte bli behandlet for å oppnå et detaljert atom lys av dette vesentlig komplekset sentralt for transkripsjon. 12. Det overveldende flertall av de andre essensielle komplekser er imidlertid til stede i mye lavere beløp i innfødte celler, og dermed kan ikke bli renset tilstrekkelig fra innfødte kildematerialet. Å gjengi slike komplekser tilgjengelig for detaljert strukturell og funksjonell analyse krever heterologe produksjon ved hjelp av rekombinant techniques.
Rekombinant protein produksjonen hadde en stor innvirkning på livet forskning. Mange proteiner ble produsert rekombinant, og deres struktur og funksjon dissekert ved høy oppløsning. Strukturelle genomikk programmene har tatt nytte av klarlegging av genomet hos mange organismer for å løse genproduktet repertoar av hele organismer i high-throughput (HT)-modus. Tusenvis av protein strukturer har dermed fastslått. Til dags dato har det mest frodig brukte system for rekombinant protein produksjonen vært E. coli, og mange uttrykk systemer har blitt utviklet og forfinet gjennom årene for heterolog produksjon i denne verten. De plasmider skjuler en mengde funksjoner for å muliggjøre protein produksjon i E. coli fylle hele kataloger av kommersielle leverandører.
Men E. coli har visse begrensninger som gjør den uegnet til å produsere mange eukaryotiske proteiner og i partikulære protein komplekser med mange subenheter. Derfor har protein produksjon i eukaryote verter blitt stadig metoden for valg de siste årene. En spesielt godt egnet system for å produsere eukaryote proteiner er baculovirus-ekspresjonsvektor-system (bevs) som er avhengig av et rekombinant baculovirus som bærer heterologe gener for å infisere insekt cellekulturer dyrket i laboratoriet. Den MultiBac systemet er en mer nylig utviklede bevs som er spesielt tilpasset for fremstilling av eukaryote protein-komplekser med mange subenheter (fig. 1). MultiBac ble først innført i 2004. 13. Siden lanseringen har MultiBac er stadig blitt videreutviklet og stream-lined å forenkle håndteringen, forbedre målprotein kvalitet og generelt gjøre systemet tilgjengelig for ikke-spesialiserte brukere ved å utforme effektive standard operasjonsprosedyrer (SOP). 4 MultiBac har vært gjennomført i mange laboratorier over hele verden, i academia og industri. På EMBL i Grenoble, ble transnasjonale tilgang til programmer satt på plass av EU-kommisjonen for å gi ekspert opplæring på MultiBac plattform for forskere som ønsket å bruke denne produksjonen system for å fremme sin forskning. Struktur og funksjon av mange protein komplekser som hittil har vært ikke tilgjengelig ble belyst ved hjelp av prøver produsert med MultiBac. 4. I det følgende omtales de viktigste trinnene i MultiBac produksjon oppsummert i protokoller som de er i drift på MultiBac anlegget på EMBL Grenoble.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Tandem Recombineering (TR) for å lage multigene Expression konstruerer
- Planlegging av co-uttrykk strategi. Design tilnærming for å sette inn dine gener av interesse i Givere og acceptors. Potensielle fysiologiske submoduler av komplekse din bør grupperes sammen på bestemte acceptors og givere. Bruk Multiplikasjon modul består av Homing endonuclease (HE) - BstXI parene å kombinere ekspresjonskassetter på individuell Donor og akseptant plasmider 7,8 Opprette alle relevante konstruksjoner i silikon og validere strategi grundig før du går videre til eksperimentelt arbeid.. For eksempel bør gener av interesse bli kontrollert for å ikke inneholde HE eller andre restriksjonsseter og tilstedeværelsen av korrekte åpne leserammer (ORF'er) skal valideres. Vurdere å bestille syntetiske gener optimalisert for insekt celle kodon bruk og mRNA sekundær struktur for å forbedre protein produksjonen samt fjerning av exisvi HE nettsteder fra gener av interesse. Vurdere å plassere rensing tags basert på data fra litteraturen om fleksibel eller utsatt N-eller C-termini av dine proteiner av valget. Vurdere å søke polyprotein strategier som tar sikte på å produsere flere protein subenheter i komplekset hvis de relative mengdene av de enkelte proteiner trenger å bli kontrollert på grunn av støkiometri spørsmål i komplekset. Fire utarbeide detaljerte "How-To" dokument (elektronisk lab Boken anbefales) som inneholder alle prosjekterte eksperimentelle trinn av prosjektet til hele multigene konstruere (s). Lage elektroniske filer av Cre-LoxP smeltet plasmider for eksempel ved hjelp av Cre-ACEMBLER programvare som kan lastes ned fra Berger gruppens hjemmeside ( www.embl.fr/multibac/ multiexpression_technologies / ska-acembler ).
- Sett dine gener av interesse i utvalgte givere ogAcceptors ved hjelp av restriksjonsenzymer og ligase, eller, alternativt, ved å bruke ligation uavhengige metoder etter publiserte protokoller. 5,6,14 Hvis du har tilgang til en flytende håndtering work-stasjon og hvis du planlegger et stort antall konstruksjoner som skal genereres ( for eksempel for kombinatoriske tilnærmingsmåter) vurdere å bruke robotikk skript utviklet og implementert av Berger-gruppen (Figur 2). 14,15 Hvis en væske håndtering work-stasjon ikke er tilgjengelig, kan manuell betjening og bruk mikrotiterplater genet innsetting i en HT som mote.
- Rammen av behovet for å kontrollere støkiometrien av uttrykte subunits kan materialisere seg. I tilfelle av støkiometrisk ubalanserte ekspresjonsnivåene av individuelle subenheter av et proteinkompleks, vurdere å søke polyprotein strategier for å conjoin flere subenheter av komplekse din og en spesifikk protease (for eksempel tobakk etse virus nia protease) i enkelte stor ORF'er innbyrdes avstand av specific proteolytiske nettsteder. 4,8 Tenk co-uttrykke en eller flere polyproteiner med enkle ekspresjonskassetter hvis du har et veldig stort kompleks med mange subenheter og vidt strekker molekylvekt på enkelte subenheter. Tenk co-uttrykke flere gener som koder for samme protein i en polyprotein, eller flere identiske ekspresjonskassetter om at protein er preget av lav produksjon yield. 4,13
- Validere alle Donor og akseptant konstruerer klonet ved restriksjonskartlegging (valgfritt i high-throughput) og sekvensering. Fortsett å fusjonere Donor-akseptant kombinasjoner av Cre-LoxP rekombinasjon å generere multigene ekspresjonskonstruksjoner av valget. Validere renset akseptant-Donor fusjonsplasmider ved begrensning kartlegging, bruk elektroniske sekvenser skapt av Cre-ACEMBLER eller lignende programmer som referanse.
- Lagre renset og validert Givere, acceptors og Donor-akseptant fusjoner ved -20 ° C eller -80 ° C. Arkiv plasmids og deres sekvenser (Microsoft Excel, Filemaker, andre) nøye for senere bruk.
2. Composite multigene Baculovirus Generation, Amplification og lagring
- Integrer multigene overføre vektorer den MultiBac baculoviral genomet ved å omforme inn DH10 celler som viral genomet og funksjonaliteten som kreves for TN7 innarbeiding. Merk at Multibac baculoviral genomet kan forhåndslastet med bestemte gener av interesse (YFP markør, anstand, etc.) i sin egen LoxP nettstedet (konstruert i genomet distalt for TN7 vedlegg stedet) ved en in vivo Cre reaksjon forut TN7 integrering. 13 Etter TN7 transposisjon blir celler med sammensatte baculovirus inneholdende genene av interesse velges ved blå / hvit screening (vellykkede TN7 transponering resulterer i tap av α-komplementering av β-galaktosidase, og derfor kolonier med riktig TN7 transponering forbli hvit på en selektivgar plater som inneholder X-gal) og genom er utarbeidet av alkaliske lyse og etanol / isopropanol nedbør. 5,6
- Transfeksjon og innledende virus produksjon. Place 6-brønnen vevkulturplate inn sterile hette. Fra log-fase Sf21 insekt cellekultur, frø ut porsjoner av celler, i brønnene og transfektere ved å legge den rensede baculoviral genomet og en transfeksjon reagens blandes i kultur media som beskrevet. 6 Harvests første viruset etter 48-60 timer ved å fjerne media ( høy kvalitet, lav titer virus 0 V, typisk 3 ml per brønn). Supplere ferske media, og test for protein produksjon (og, hvis en YFP markør er til stede, for fluorescens) etter ytterligere 2-3 dager. 6,7
- Forsterkning av virus, lav MOI regime. Bruk V 0 virus å infisere 25-50 ml av celler i log fase (celle tetthet <1x10 6 celler per ml) i små (100-250 ml) Erlenmeyer shaker kolber opphissetpå orbital plattformen shakers (figur 3). Telle celler og dele hver 24. time inntil cellene slutter dobling (spredning arrest). Følge en lav MOI (mangfold av infeksjon dvs. antall viruspartikler per celle) diett: Celler må doble (minst) en gang (MOI <1), ellers gjenta eksperimentet med et mindre volum av V 0 til. Normalt blir 3 ml av V 0 brukt for å infisere 25 ml Sf21 insektceller ved ved en densitet på 0.5x10 6 celler / ml. Dette er avgjørende for å hindre skadelig over-forsterkning og auto-sletting av virus som kan føre til tap av heterologe gener av interesse. Innhøsting V 1 virus (25-50 ml) etter 48-60 hr ved pelletering celler og fjerne medier som inneholder viruset. Supplere med nye medier og test for YFP og protein produksjonen ved å fjerne 1x10 6 celler hver 12 eller 24 timer, pelletering og validere protein produksjon og markør protein (YFP) signal. 6, forsterke virus (tilV 2) videre hvis større uttrykk volumer er rettet mot ved å infisere opptil 400 ml celler i to L shaker flasker med V 1 virus respekt ovenfor lav MOI regime (celler må doble minst en gang etter infeksjon med V 1). Stringently teste protein produksjon og markør protein signal under forsterkning for å unngå opphopning av defekte virus ikke lenger inneholder gener av interesse. 5-7 Bruk celle pellets samler på hver presiseringer steg allerede for å etablere rensing protokoller for den uttrykte protein kompleks av interesse.
- BIIC lagring av produksjon virus. Vi anbefaler sterkt til å lagre V 2 virus som produksjonen viruset ved hjelp av BIIC (B aculovirus-i nfected jeg nsect c ells)-metoden, for å forhindre modifikasjoner (f.eks tap av genet av interesse) av det rekombinante virus og for å bevare høy ekspresjon nivås 16 Pellet infiserte celler 24 timer etter spredning arrest er observert -. på dette stadiet celler inneholder komplette viruspartikler like før de ville bli løslatt (av spirende) inn i media. Fjern medium og fryse alikvoter av cellepelleten i flytende nitrogen og lagres på ubestemt tid. 7,16
3. Protein Produksjon og nedstrøms behandling
- Infisere store (r) kulturer og overvåking YFP. Bruk en V, V 2 eller frosne BIIC alikvotene å infisere større cellekulturer for produksjonsserier (vanligvis 400 ml i 2 L flasker). Holder seg til lav MOI regime (justere virusvolum brukes for infeksjon slik at infiserte kultur dobler minst én gang). Større infiserte kultur volumer om nødvendig ved å multiplisere antall flasker. Hvis YFP markør protein er til stede, trekke seg på definerte intervaller 1x10 6 celler, pellet og lyse celler og overvåke utviklingen av YFP signal til et platå er nådd indicating maksimal rekombinant protein produksjon. YFP nivåene kan bli målt i en standard 96-brønners plateleser stand til å registrere fluorescens-signaler (f.eks Tecan SPECTRAFluor). Høste celler på dette stadiet. Oppbevar cellen pellets ved -20 ° C (i kort tid) eller -80 ° C (lang sikt).
- Cellelyse og fraksjonering. Lyse celler ved din favoritt metoden for valg, skreddersydd til kravene i protein (fryse-tine, lydbehandling, fransk presse, andre). 5-7 fraksjonerer cytosol og kjerner og test for tilstedeværelsen av proteiner av interesse. Utvikle rensing protokoller basert på resultatene for å forenkle protein rensing. Vurdere å søke soaking prosedyrer for å hente ut din protein fra kjernefysiske brøkdel under høye KCl forhold hvis proteiner bor i kjernen. 7,18
- Proteinrensing (mikro-skala, stor skala). Legg merke til at ofte små volumer (10 eller 25 ml) av cellekultur er sufficient for oppnåelse av cellen pellets for rensing av vesentlige mengder av de proteiner av interesse på grunn av de typisk høye eller meget høye produksjonsnivå av heterologe proteiner i baculovirus / insekt-cellesystem (ofte 10-100 mg protein per L kultur og mer). I forbindelse med mikro-rensing (multibrønnplater plater, mikrotip metoder, GE Healthcare ÄKTAmicro system, andre) er det mulig å få biokjemiske og aktivitet data og ofte også tilstrekkelig mengde av de ønskede proteiner og komplekser for nanoliter-skala high-throughput krystallisering (HTX ). Vurder å bruke metall affinitetsrensing (Clonetech Takara Talon, Qiagen NiNTA metall chelatdannende harpiks) og en oligo-histidin (6-10 rester) tag på utsatte subenheter av protein komplekse å lette rensing, i forbindelse med ionebytting og størrelse utelukkelse kromatografi i liten volumer for eksempel ved hjelp av ÄKTAmicro eller et lignende lite volum rensing maskinen (figur 4
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sterk ko-ekspresjon av heterologe proteiner som oppnås for det MultiBac systemet er vist i figur 1D (prober tatt 48 timer etter infiserer en suspensjon cellekultur). De overexpressed protein band er tydelig i hele cellen ekstrakt (SNP) og ryddet lysatet (SN). Kvaliteten og mengden av protein-materiale som produseres er ofte tilstrekkelig til at strukturen bestemmelse av protein-komplekser, slik som den mitotiske sjekkpunkt kompleks MCC vist i figur 1e. 17.
Figur 2 viser work-flow av et gen forsamling eksperimentere med robot-assistert tandem recombineering (TR). Robuste DNA montering protokoller var manus til robotikk rutiner for parallelliserte montering av multigene ekspresjonskonstruksjoner. Individuelle robot Fremgangsmåten vises på snap-shots (figur 2c, I - IV). Det DNA-komponenter som skal monteres er generert ved PCR og kvalitetssikret ave-geler (figur 2d, venstre), den sammensatte multigene konstruerer er likeledes validert ved PCR med spesielt utformet sett av primere (figur 2d, høyre) 14,15.
Rekombinant baculovirus generasjon og forsterkning følger standard operasjonsprosedyrer (skjematisk vist i figur 3a). Øyeblikksbilder av celler dyrket i et monolag er vist (figur 3B, I. og II.) Etter infeksjon med et virus MultiBac.
Nedstrøms behandling av de rekombinante protein komplekser kan lages små, ved hjelp av multi-brønn-plate eller mikrotip-baserte kromatografi for affinitetsrensing etterfulgt av størrelse utelukkelse kromatografi (SEC) av kompleksene ved å integrere inn i arbeid-flow småskala systemer som ÄKTAmicro (figur 4a). En representant SEC profilen til en ~ 700 kDa menneskelige transkripsjonsfaktor kompleks vises. Sample renset ved hjelpden ÄKTAmicro i liten skala er vanligvis tilstrekkelig for karakterisering av biokjemiske og biofysiske virkemidler, inkludert elektronmikroskopi (figur 4b).
Figur 1. MultiBac plattform-teknologi for multiprotein kompleks produksjon. (A) gener av interesse er integrert i Multibac baculoviral genomet ved hjelp TN7 innarbeiding i forbindelse med blå / hvit screening. En LoxP område på virus ryggraden tillater tilsetning av ytterligere funksjoner som for eksempel et fluoriserende markørprotein for å overvåke ytelsen virus og heterologt protein produksjon. (B) baculovirus-fatter en langstrakt pinne form og er karakterisert ved en fleksibel konvolutt som kan forsterke å imøtekomme store (> 130 kb) sirkulært dobbelttrådet DNA genomet. Store heterologe gen innsettinger i genomet tolereres by elongating konvolutten. (c) Standard Erlenmeyer-kolber på orbital shaker-plattformer kan benyttes for dyrking i stor skala insekt cellekulturer for heterologues proteinproduksjon. (d) MultiBac system effektivt produserer rekombinante proteiner som ofte er klart synlig allerede i den hel- celle ekstrakt (SNP). (e) Strukturen i mitotisk sjekkpunkt komplekset ble belyst ved røntgendiffraksjon fra krystaller vokst fra prøven produsert med MultiBac system. 17. Klikk her for å se større figur .
Figur 2. (Automated) Tandem Recombineering (TR). (A) Tandem recombineering benytter små matriser av syntetiske plasmid DNA-molekyler kalt Givere og acceptors for montering multigene ekspresjonskonstruksjoner, eventuelt i robot-assistert modus ved hjelp av en flytende håndtering work-stasjon (høyre). (b) TR arbeidsflyten vises. SKIVE står for sekvens og ligation uavhengig kloning, står Cre for Cre-LoxP fusjon concatenating Givere og acceptors i hvilke gener av interesse har blitt satt inn av SLIC. Multigene uttrykk konstruerer generert av denne recombineering prosedyren ved hjelp SLIC og Cre i tandem er så integrert i den MultiBac Baculovirus genomet og brukes for liten og stor skala uttrykk i insekt cellekulturer smittet av rekombinant virus. (C) Snapshots av roboten-assistert TR Prosessen er vist blant annet bestemmelse av templat-DNA og primerne (I), fremstillingen av PCR-reaksjoner i multiwell plater (II), PCR amplifikasjon av DNA-molekyler (III), og fremstillingen av multigene konstrukter som ble dyrket i bakteriekultur ved alkalisk lysis i multi-brønn plater ( IV). (d) PCR-produkter som brukes for TR er visualisert ved ossing på e-gel system (til venstre). Fullførte multigene konstruerer er validert av analytiske PCR reaksjoner lastet på en e-gel (høyre). Klikk her for å se større figur .
Figur 3. MultiBac virus generasjon, forsterkning, lagring. (A) Standard Operating Procedure (SOP) av MultiBac plattformen ved EMBL Grenoble er vist i en skjematisk visning. Rekombinant MultiBac virus er identifisert av blå-hvit screening og forberedt fra bakteriekulturer. Initial transfeksjon foregår på 6-brønn plater seeded med monolayers av insekt celler (Sf21, Sf9, Hi5, andre). Virus forsterkes og målet protein som produseres i Erlenmeyer shakers. Virus er lagret ved frysing porsjoner av infiserte insekt celler (BIIC). Florescence er registrert som et analytisk verktøy dersomYFP (eller en annen fluorescerende protein) har blitt integrert som en markør protein for eksempel i loxP nettstedet stede på MultiBac baculoviral genom. (B) Snapshots av insekt celler infisert med MultiBac Baculovirus vises. Cellene stoppe voksende, øke i størrelse (I.). Cell fusjoner er observert (II). Virus budded av de infiserte cellene i mediene blir samlet inn og brukt til å infisere større cellekulturer for protein kompleks produksjon (III, IV). Klikk her for å se større figur .
Figur 4. Proteinkompleks produksjon og nedstrøms prosessering. Proteinkompleks prøven kan allerede praktisk renset fra små innledende cellekulturer ved å benytte miniatyrisert rensemetoder slik som multiwall eller mikrotip-baserte rensing, eventuelt i kombinasjon med små volumer kromatografi systemer (til venstre). Ofte utbyttet av allerede disse "analytiske" rensing runs (midten) er tilstrekkelig for å analysere strukturen og funksjonen av renset kompleks av en rekke måter, blant elektronmikroskopi (til høyre). Klikk her for å se større figur .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Video-snap-skudd i Figurene 2 og 3 illustrerer hele prosessen fra robot-assistert generasjon fra cDNA av multigene ekspresjonskonstruksjoner hele veien til infeksjon av insekt-cellekulturer for protein produksjon. Nye reagenser (plasmider og virus) og robuste protokoller er utviklet for å muliggjøre en rørledning avhengig av SOP. Hele rørledningen har blitt implementert som en plattform teknologi ved EMBL i Grenoble. Den MultiBac plattformen er vist av mange forskere fra akademia og industri som er engasjert i multiprotein forskning. Treningen tilgang er støttet av dedikert tilgang til programmer finansiert av EU-kommisjonen (P-CUBE, BioSTRUCT-X).
Tilgjengeligheten av SOP å gjennomføre protein komplekse uttrykk ved hjelp av MultiBac systemet har gjort denne teknologien lett mottakelig også til ikke-spesialiserte brukere. Robot-assistert drift akselererer multiprotein kompleks produksjon i spemeringen når et tilstrekkelig stort antall av komplekser, for eksempel varianter og mutanter av en prøve av interesse, må genereres i parallell. Men, manuell drift ved lave til medium gjennomstrømming også stor nytte av tilgjengeligheten av SOP. I vår erfaring, trengte prosesser som kan være vellykket manus til robotikk rutiner for å være raffinert først med betydelig innsats inntil tilstrekkelig robuste protokollene ble innhentet som er kompatible med hjelp av en robot. Slike protokoller danner grunnlaget for våre SOP. 5,6,14,15 faktisk gjennomføring av disse robuste protokoller for roboten føre til en svært betydelig effektiviseringsgevinst også av manuelle operasjoner i vårt laboratorium.
Mange proteiner og protein komplekser har blitt og blir produsert ved hjelp av MultiBac system som vi utviklet, og nærmere 500 laboratorier verden over har fått reagenser. MultiBac har katalysert forskning ikke bare i strukturell biologi, men også i mange otheh områder av biovitenskap som undersøker eller utnytte samspillet mellom proteiner i store forsamlinger. MultiBac har også blitt brukt for å produsere protein mål av betydelig farmakologisk interesse, inkludert virus-lignende partikler, som kan komme til nytte vaksinekandidater. 4. Mer nylig har MultiBac også blitt brukt til å levere gener i pattedyrceller og cellekulturer, eller til og med hele organismer av genterapi. 4 Vi forventer at tilnærminger som de illustrert i dette bidraget vil vise seg å være nyttig for mange områder av forskning som involverer multiprotein forsamlinger og komplekst samspill av biologiske makromolekyler som danner grunnlaget for cellulære prosesser i helse og sykdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
IB er oppfinner på patenter og patentsøknader detaljering deler av teknologien her beskrevet.
Acknowledgments
Vi takker Christoph Bieniossek, Simon Trowitzsch, Daniel Fitzgerald, Yuichiro Takagi, Christiane Schaffitzel, Yvonne Hunziker, Timothy Richmond og alle tidligere og nåværende medlemmer av Berger laboratorium for hjelp og råd. Den MultiBac plattformen og dens utvikling har vært og er sjenerøst støttet av virkemiddelapparatet inkludert den sveitsiske National Science Foundation (SNSF), den Agence National de Recherche (ANR) og Centre National de Recherche Scientifique (CNRS) og EU-kommisjonen (EC) i rammeprogrammene (FP) 6 og 7. Støtte for transnasjonal tilgang er gitt av EF FP7 prosjekter P-Cube ( www.p-cube.eu ) og BioStruct-X ( www.biostruct-x.eu ). Den franske departementet for vitenskap er spesielt anerkjent for å støtte MultiBac plattformen ved EMBL gjennom Investissement d'Avenir prosjektet FRISBI.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bluo-Gal | Invitrogen | 15519-028 (1 g) | |
| Tetracycline | Euromedex | UT2965-B (25 g) | 1,000X at 10 mg/ml |
| Kanamycine | Euromedex | EU0420 (25 g) | 1,000X at 50 mg/ml |
| Gentamycine | SIGMA | G3632 (5 g) | 1,000X at 10 mg/ml |
| IPTG | Euromedex | EU0008-B (5 g) | 1,000X at 1M |
| Cre-recombinase | New England BioLabs | M0298 | |
| X-Treme GENE HP transfection reagent | Roche | 06 366 236 001 | |
| Hyclone SFM4 Insect | Thermo Scientific | SH 30913.02 | |
| 6-well plate Falcon | Dominique Dutscher | 353046 | |
| 2 ml pipette Falcon | Dominique Dutscher | 357507 | |
| 5 ml pipette Falcon | Dominique Dutscher | 357543 | |
| 10 ml pipette Falcon | Dominique Dutscher | 357551 | |
| 25 ml pipette Falcon | Dominique Dutscher | 357535 | |
| 50 ml pipette Falcon | Dominique Dutscher | 357550 | |
| 50 ml tube Falcon | Dominique Dutscher | 352070 | |
| 15 ml tube Falcon | Dominique Dutscher | 352096 | |
| 1.8 ml cryotube Nunc | Dominique Dutscher | 55005 | |
| 100 ml shaker flasks Pyrex | Dominique Dutscher | 211917 | |
| 250 ml shaker flasks Pyrex | Dominique Dutscher | 211918 | |
| 500 ml shaker flasks Pyrex | Dominique Dutscher | 211919 | |
| 2 L shaker flasks Pyrex | Dominique Dutscher | 211921 | |
| Certomat Orbital Shaker + plateau | Sartorius | 4445110, 4445233 | |
| Liquid nitrogen tank dewar 35 L | Fisher Scientific | M76801 | |
| Biological Safety Cabinet Faster | Sodipro | FASV20000606 | |
| Optical Microscope | Zeiss | 451207 | |
| Sf21 Insect cells | |||
| Hi5 Insect cells | Invitrogen | B855-02 | |
| Tecan freedom EVO running Evoware plus | TECAN | ||
| 10 μl conductive tips (black), | TECAN | 10 612 516 | |
| 200 μl conductive tips (black) | TECAN | 10 612 510 | |
| disposable trough for reagents, 100 ml | TECAN | 10 613 049 | |
| twin.tec PCR plate 96, skirted | Eppendorf | 0030 128.648 | |
| 96 well V bottom, non sterile | BD falcon | 353263 | |
| 96 deepwell plate color natural, PP) | Fisher | M3752M | |
| PS microplate, 96 well flat bottom | Greiner | 655101 | |
| 96 deepwell plate | Thermo scientific | AB-0932 | |
| 24 well blocks RB | Qiagen | 19583 | |
| DpnI restriction enzyme | NEB | R0176L | 20 U/uL |
| NEBuffer 4 10X | NEB | B7004S | |
| 2X phusion mastermix HF | Finnzyme | ref F-531L | |
| 2X phusion mastermix GC | Finnzyme | ref F-532L | |
| DGLB 1.5X | homemade | 7.5% glycerol, 0.031% Bromophenol blue, 0.031% Xylen cyanol FF | |
| High DNA Mass Ladder for e-gel | Life Technologies | 10496-016 | |
| Low DNA Mass Ladder for e-gel | Life Technologies | 10068-013 | |
| E-gel 48 1% agarose GP | Life Technologies | G8008-01 | |
| Nucleo Spin- robot-96 plasmid kit | Macherey Nagel | 740 708.24 | |
| PCR clean-up kit, Nucleospin Robot-96 Extract | Macherey Nagel | 740 707.2 | |
| Gotaq green master mix | Promega | M7113 | |
| T4 DNA polymerase, LIC-qualified | Novagen | 70099-3 | |
| DTT 100 mM | homemade | ||
| Urea 2 M | homemade | ||
| EDTA 500 mM pH 8.0 | Homemade | ||
| LB broth (Miller) 500 g | Athena ES | 103 |
References
- Nie, Y., Viola, C., Bieniossek, C., Trowitzsch, S., Vijay-Achandran, L. S., Chaillet, M., Garzoni, F., Berger, I. Getting a Grip on Complexes. Curr. Genomics. 10 (8), 558-572 (2009).
- Robinson, C. V., Sali, A., Baumeister, W.
- Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nat. Biotechnol. 23 (5), 567-575 (2005).
- Bieniossek, C., Imasaki, T., Takagi, Y., Berger, I. MultiBac: expanding the research toolbox for multiprotein complexes. Trends Biochem. Sci. 37 (2), 49-57 (2012).
- Fitzgerald, D. J., Berger, P., Schaffitzel, C., Yamada, K., Richmond, T. J., Berger, I. Protein complex expression by using multigene baculoviral vectors. Nat. Methods. 3 (12), 1021-1032 (2006).
- Bieniossek, C., Richmond, T. J., Berger, I. MultiBac: multigene baculovirus-based eukaryotic protein complex production. Curr. Protoc. Protein Sci. Chapter 5, Unit 5.20 (2008).
- Trowitzsch, S., Bieniossek, C., Nie, Y., Garzoni, F., Berger, I. New baculovirus expression tools for recombinant protein complex production. J. Struct. Biol. 172 (1), 45-54 (2010).
- Vijayachandran, L. S., Viola, C., Garzoni, F., Trowitzsch, S., Bieniossek, C., Chaillet, M., Schaffitzel, C., Busso, D., Romier, C., Poterszman, A., Richmond, T. J., Berger, I. Robots, pipelines, polyproteins: enabling multiprotein expression in prokaryotic and eukaryotic cells. J. Struct. Biol. 175 (2), 198-208 (2011).
- Thomas, M. C., Chiang, C. M. The general transcription machinery and general cofactors. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 41 (3), 105-178 (2006).
- Klinge, S., Voigts-Hoffmann, F., Leibundgut, M., Ban, N.
- Melnikov, S., Ben-Shem, A., Garreau de Loubresse, N., Jenner, L., Yusupova, G., Yusupov, M. One core, two shells: bacterial and eukaryotic ribosomes. Nat. Struct. Mol. Biol. 19 (6), 560-567 (2012).
- Cramer, P., Bushnell, D. A., Fu, J., Gnatt, A. L., Maier-Davis, B., Thompson, N. E., Burgess, R. R., Edwards, A. M., David, P. R., Kornberg, R. D. Architecture of RNA polymerase II and implications for the transcription mechanism. Science. 288 (5466), 640-649 (2000).
- Berger, I., Fitzgerald, D. J., Richmond, T. J. Baculovirus expression system for heterologous multiprotein complexes. Nat. Biotechnol. 22 (12), 1583-1587 (2004).
- Bieniossek, C., Nie, Y., Frey, D., Olieric, N., Schaffitzel, C., Collinson, I., Romier, C., Berger, P., Richmond, T. J., Steinmetz, M. O., Berger, I. Automated unrestricted multigene recombineering for multiprotein complex production. Nat. Methods. 6 (6), 447-450 (2009).
- Nie, Y., Bieniossek, C., Frey, D., Olieric, N., Schaffitzel, C., Steinmetz, M. O., Berger, I. ACEMBLing multigene expression constructs by recombineering. Nat. Protocols. , (2009).
- Wasilko, D. J., Lee, S. E., Stutzman-Engwall, K. J., Reitz, B. A., Emmons, T. L., Mathis, K. J., Bienkowski, M. J., Tomasselli, A. G., Fischer, H.D. titerless infected-cells preservation and scale-up (TIPS) method for large-scale production of NO-sensitive human soluble guanylate cyclase (sGC) from insect cells infected with recombinant baculovirus. Protein Expr. Purif. 65 (2), 122-132 (2009).
- Chao, W. C., Kulkarni, K., Zhang, Z., Kong, E. H., Barford,
- Yamada, K., Frouws, T. D., Angst, B., Fitzgerald, D. J., DeLuca, C., Schimmele, K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Structure and mechanism of the chromatin remodelling factor ISW1a. Nature. 472 (7344), 448-453 (2011).
