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Bioengineering

Polymeric जीन डिलीवरी के मूल्यांकन nanoparticle ट्रैकिंग विश्लेषण और उच्च throughput प्रवाह cytometry द्वारा नैनोकणों

Published: March 1, 2013 doi: 10.3791/50176
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2,3,4
1Biomedical Engineering Department, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Translational Tissue Engineering Center, Johns Hopkins University School of Medicine, 3Wilmer Eye Institute, Johns Hopkins University School of Medicine, 4Institute for Nanobiotechnology, Johns Hopkins University School of Medicine

Summary

Nanoparticle ट्रैकिंग विश्लेषण (NTA) और उच्च throughput प्रवाह polymeric जीन डिलीवरी नैनोकणों का मूल्यांकन cytometry के लिए एक प्रोटोकॉल में वर्णित है. NTA nanoparticle कण आकार के वितरण और प्लाज्मिड प्रति कण वितरण को चिह्नित करने के लिए उपयोग किया जाता है. उच्च throughput प्रवाह cytometry जीन डिलीवरी biomaterials के एक पुस्तकालय के लिए मात्रात्मक अभिकर्मक प्रभावकारिता मूल्यांकन के लिए सक्षम बनाता है.

Abstract

गैर वायरल जीन polymeric नैनोकणों का उपयोग कर वितरण जीन चिकित्सा आनुवंशिक बीमारियों 1 के इलाज के लिए एक आकर्षक दृष्टिकोण के रूप में और पुनर्योजी दवा 2 के लिए एक प्रौद्योगिकी के रूप में उभरा है. वायरस है, जो महत्वपूर्ण सुरक्षा मुद्दों के विपरीत, polymeric नैनोकणों गैर विषैले, गैर immunogenic, गैर mutagenic आसान है, के लिए synthesize, रासायनिक बहुमुखी, बड़ा न्यूक्लिक एसिड कार्गो और biodegradable और / या पर्यावरण उत्तरदायी ले जाने में सक्षम करने के लिए तैयार किया जा सकता है. Cationic पॉलिमर electrostatic 100 एनएम कि सामान्यतः polymeric नैनोकणों कहा जाता है के आदेश पर परिसरों के रूप में बातचीत के माध्यम से नकारात्मक आरोप लगाया डीएनए के साथ स्वयं को इकट्ठा. Nanoscale polycationic जीन डिलीवरी नैनोकणों किया biomaterials के उदाहरण polylysine, polyphosphoesters, पाली (amidoamines) और polyethylenimine (पी), जो एक गैर degradable बंद शेल्फ cationic बहुलक सामान्यतः न्यूक्लिक एसिड 1,3 प्रसव के लिए प्रयोग किया जाता है. पाली (बीटा अमीनोएस्टर ओं) (PBAEs) cationic 4 पॉलिमर कि hydrolytically 5,6 degradable हैं और जीन मानव रेटिना endothelial कोशिकाओं (HRECs) 7 के रूप में इस तरह के मुश्किल से transfect सेल प्रकार के वितरण में प्रभावी होना दिखाया गया है के एक नए वर्ग हैं, माउस स्तन उपकला 8 कोशिकाओं, मानव मस्तिष्क कैंसर 9 कोशिकाओं और macrovascular (मानव नाल की शिरा, HUVECs) endothelial 10 कोशिकाओं.

एक नया प्रोटोकॉल nanoparticle ट्रैकिंग विश्लेषण (NTA) का उपयोग करने के लिए polymeric नैनोकणों विशेषताएँ वर्णित है. इस दृष्टिकोण में, दोनों कण आकार के वितरण और कण प्रति plasmids की संख्या का वितरण 11 प्राप्त कर रहे हैं. इसके अलावा, एक उच्च throughput polymeric नैनोकणों अभिकर्मक प्रभावकारिता की तेजी से जांच के लिए 96 अच्छी तरह से थाली अभिकर्मक परख प्रस्तुत किया है. इस प्रोटोकॉल में, (बीटा अमीनो एस्टर) पाली (PBAEs) मॉडल पॉलिमर और मानव रेटिना endothelial कोशिकाओं (HRECs) के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं मो के रूप में इस्तेमाल किया जाता हैडेल मानव कोशिकाओं. इस प्रोटोकॉल आसानी से हो सकता है किसी भी polymeric nanoparticle और एक बहु - अच्छी तरह से थाली प्रारूप में ब्याज की किसी भी कोशिका प्रकार का मूल्यांकन करने के लिए अनुकूलित कर सकते हैं.

Introduction

nanoparticle प्रति complexed plasmids की संख्या का निर्धारण करने के लिए महत्वपूर्ण है सह कई plasmids के एक ही सेल लक्ष्य वितरण के लिए विशेष रूप से प्रभावी nanoparticle आधारित जीन वितरण रणनीति, डिजाइन, जैसा कि अक्सर 12 अध्ययन reprogramming स्टेम सेल में आवश्यक है. कुछ एक nanoparticle के साथ जुड़े plasmids की संख्या की गणना करने के लिए दृष्टिकोण का वर्णन किया गया है, और प्रत्येक दृष्टिकोण 13-16 आकलन के लिए इस्तेमाल की तकनीक में कमियां है. क्वांटम डॉट (QD) मंदिर के साथ संयुक्त लेबलिंग chitosan आधारित नैनोकणों में कण प्रति plasmids का अनुमान लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया है. संभावना है कि सीधे समझाया unlabeled डीएनए का पता नहीं है, संभावित अतिव्यापी plasmids और कणों के 2d मंदिर छवियों में QDs, इस QD तकनीक के साथ आकलन के लिए डीएनए है, जो अपने स्वयं विधानसभा संपत्तियों को बदल सकता है लेबल की जरूरत की वजह से जटिल है और अन्य 13 को सरल बनाने मान्यताओं. एक वैकल्पिक दृष्टिकोण है कि एकजब pplicable आदेश दिया microdomains कणों में मौजूद करने के लिए किया गया है क्रायो - संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायो - मंदिर), एक्स - रे बिखरने और गतिशील प्रकाश बिखरने (DLS) 14,15 के माध्यम Lipopolyamine डीएनए परिसरों का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया. दुर्भाग्य से, polymeric नैनोकणों यहाँ जांच के रूप में ऐसी सामग्री इस विधि के साथ लागू नहीं कर रहे हैं. हालांकि, उनकी विधि केवल बड़े माइक्रोन आकार 16 कणों का मूल्यांकन कर सकते हैं, एक अन्य अध्ययन में, कोलिन्स एट अल एक प्रवाह कण छवि विश्लेषण तकनीक अध्ययन करने के लिए (Lys) 16 युक्त पेप्टाइड / डीएनए परिसरों का इस्तेमाल किया. इस प्रकार, हम हाल ही में एक उपन्यास और लचीला 11 nanoparticle प्रति plasmids की संख्या यों परख विकसित की है.

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Protocol

1. सेल सीडिंग

  1. कोशिकाओं overconfluency के लिए विकसित करने की अनुमति न दें. जब प्राथमिक कोशिकाओं transfecting जल्द पारित कोशिकाओं का उपयोग करें.
  2. चौबीस घंटे अभिकर्मक करने से पहले, trypsinize कोशिकाओं, एक hemocytometer कोशिकाओं का उपयोग कर गिनती, और मीडिया के साथ सेल निलंबन वांछित घनत्व सेल (कोशिकाओं / मात्रा) को प्राप्त करने के जलमिश्रित. स्पष्ट ऊतकों में बीज कोशिकाओं फ्लैट नीचे 96-अच्छी तरह से उपयोग कर प्लेटें एक जलाशय और multichannel pipettes संस्कृति इलाज. चुना घनत्व 70-80% अभिकर्मक के दिन पर confluency देना चाहिए. उदाहरण के लिए, के रूप में 1 तालिका में प्रदर्शित, कोशिकाओं अभिकर्मक यहाँ दिखाया डेटा के लिए 25 से 50 / कोशिकाओं μl थे पतला.

2. सेल अभिकर्मक

  1. बहुलक और डीएनए शेयरों के कमजोर पड़ने. कमरे के तापमान (आर टी) बहुलक और पिघलना के डीएनए स्टॉक समाधान. स्पष्ट 96-अच्छी तरह से एक बारह चैनल विंदुक का उपयोग कर प्लेटें में बहुलक स्टॉक समाधान और डीएनए स्टॉक समाधान, अलग पतला, डीएनए वजन अनुपात (wt / wt) के लिए वांछित बहुलक वजन प्राप्त करने के लिए आवश्यक सांद्रता के लिए उपयुक्त विलायक के साथ. इस मामले में, चुना विलायक 25 मिमी सोडियम एसीटेट बफर (5.2 पीएच =) है.
    1. कमजोर पड़ने डीएनए. आमतौर पर, 1 मिलीग्राम / एमएल में संग्रहीत डीएनए सोडियम एसीटेट बफर में एक प्लेट स्पष्ट गैर टिशू कल्चर का इलाज 96-अच्छी तरह से (एक एकल तैयार करने के लिए एक अच्छी तरह से) में 0.03-0.06 मिलीग्राम / एमएल के एक एकाग्रता पतला है टेबल 2 से पता चलता है एक ही तैयार करने के लिए एक 96 अच्छी तरह से थाली में चरण 1 से कोशिकाओं के साथ वरीयता प्राप्त चार दोहराने कुओं transfect ठेठ डीएनए कमजोर पड़ने प्रोटोकॉल.
    2. पॉलिमर कमजोर पड़ने. 100 मिलीग्राम / एमएल / बहुलक DMSO समाधान सोडियम एसीटेट बफर में डीएनए अनुपात / wt wt वांछित बहुलक प्राप्त करने के लिए आवश्यक एकाग्रता के अनुसार पतला है. wt / wt अनुपात आम तौर पर (बीटा अमीनो एस्टर) है पाली (PBAEs) के साथ जीन डिलीवरी के लिए इस्तेमाल किया की सीमा 20 से 100 है. PBAE पॉलिमर 1 10 मिलीग्राम / एमएल पतला कर रहे हैं, कमजोर पड़ने पी द्वारा पीछाrotocol के रूप में 3 तालिका में दिखाया गया है. बहुलक dilutions एक गैर टिशू कल्चर का इलाज स्पष्ट 96-अच्छी तरह से थाली कि डीएनए कमजोर पड़ने की थाली के नमूना उन्मुखीकरण मैच में प्रदर्शन किया जा सकता है.
  2. Nanoparticle गठन. प्लास्मिड डीएनए एक बारह चैनल विंदुक का उपयोग कर समाधान की एक समान मात्रा PBAE समाधान जोड़ें और सख्ती मिश्रण. आत्म विधानसभा की अनुमति के लिए 10 मिनट के लिए आर टी में मिश्रण सेते चलो.
  3. Nanoparticle अभिकर्मक. आत्म विधानसभा के बाद, 20 μl नैनोकणों प्रति अच्छी तरह से संस्कृति के माध्यम dropwise बारह चैनल विंदुक का उपयोग करने के लिए जोड़ रहे हैं. दोहराएँ कुओं अनुपचारित छोड़ दिया जाता या नियंत्रण के रूप में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध अभिकर्मकों साथ ट्रांसफ़ेक्ट. ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं 37 पर incubated ° सी दो से चार घंटे और फिर कुओं के लिए ताजा मीडिया (100 μl / अच्छी तरह से) के साथ बदल रहे हैं. ऊष्मायन समय का चुनाव सेल लाइन, संस्कृति की स्थिति, और अभिकर्मक प्रणाली पर निर्भर करेगा. अभिकर्मक में अंतरसेल और ऊष्मायन अवधि बदलती के एक परिणाम के रूप विषाक्तता दक्षता विश्लेषण चरण 3 में वर्णित प्रोटोकॉल द्वारा मात्रा निर्धारित किया जाएगा.

3. अभिकर्मक दक्षता और सेल विषाक्तता का विश्लेषण

अभिकर्मक दक्षता नेत्रहीन एक प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी के साथ विश्लेषण किया है और एक प्रवाह cytometer अड़तालीस घंटे के बाद अभिकर्मक का उपयोग मात्रा निर्धारित है. सेल विषाक्तता नेत्रहीन एक प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी के साथ विश्लेषण किया है और CellTiter 96 जलीय एक परख चौबीस घंटे के बाद अभिकर्मक का उपयोग quantified.

  1. प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी. नेत्रहीन ट्रांसफ़ेक्ट रिपोर्टर (उदाहरण के लिए, EGFP या DsRed) जीन उचित प्रतिदीप्ति चैनल का उपयोग की अभिव्यक्ति के लिए कुओं का विश्लेषण. प्रत्येक के लिए अच्छी तरह छवियों को प्राप्त करने के लिए, चुनने देखने के क्षेत्रों है कि उचित विशेष योगों (1 चित्रा) के लिए अभिकर्मक दक्षता का प्रतिनिधित्व करते हैं. किसी भी सेल नेत्रहीन विषाक्तता मनाया के एक नोट करें.
  2. फ्लो.
    1. Multichannel pipettes प्रयोग प्रवाह cytometry के लिए थाली 96-अच्छी तरह से तैयार है. पीबीएस के साथ धोने, μl / अच्छी तरह से trypsin / EDTA के 30, 170 μl FACS बफर (पीबीएस + FBS 2%) के साथ बेअसर, पिपेट ऊपर और नीचे प्रत्येक में अच्छी तरह से, किनारों के आसपास सहित trypsinize, और पूरे 200-μl की मात्रा हस्तांतरण एक दौर नीचे या वि नीचे 96-अच्छी तरह से थाली में इसी कुओं में हर अच्छी तरह से.
    2. 5 मिनट के लिए 130 XG 4 पर थाली अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस
    3. प्रत्येक अच्छी तरह से और विंदुक कोशिकाओं को resuspend से 170 μl मीडिया निकालें जबकि बुलबुले से बचने. एक अच्छी तरह से इस्तेमाल करने के लिए: एक व्यवहार्यता propidium आयोडाइड (पीआई) की तरह दाग, FACS बफर + PI (PI स्टॉक एकाग्रता 1 मिलीग्राम / एमएल PI मन्दन 50:1 FACS बफर) के 10 μl जोड़ें. तुरंत बर्फ पर जगह और प्रकाश से कवर.
    4. शुरू C6 Accuri प्रवाह cytometer, 96-अच्छी तरह से लगाव HyperCyt और HyperView सॉफ्टवेयर. HyperView डिजाइन और प्रोटोकॉल टैब का उपयोग करने के लिए उपयुक्त पी का चयनदेर प्रकार, थाली, लेआउट और शेक / घूंट जैसे अन्य सेटिंग्स / कुल्ला / समय हिला. ऊपर प्रोटोकॉल के लिए निम्नलिखित मापदंडों का इस्तेमाल किया गया, एक मिनट, और 2400 आरपीएम पर 30 सेकंड के लिए एक पूर्व प्लेट हिला के लिए एक प्लेट पूर्व प्रधानमंत्री. पीएं समय 15 सेकंड के लिए 15 rpm पर स्थापित किया गया था, एक जांच हर 2 सेकंड के लिए अच्छी तरह से, कुल्ला और एक अंतर - अच्छी तरह से 2400 आरपीएम पर 12 सेकंड के लिए हर 12 कुओं हिला. हिला अंतर - अच्छी तरह से रखने के लिए कोशिकाओं को मीडिया में छितरी हुई है, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से बेहतर करने के लिए कुओं के समूहों के बीच समय विराम (इस मामले 12 सेकंड में) को शामिल करके डेटा की प्रक्रिया करने की क्षमता के लिए महत्वपूर्ण है.
    5. HyperView खैर पहचान टैब का उपयोग करने के लिए उपयुक्त अच्छी तरह से (2 चित्रा) में और डेटा अलग प्रक्रिया है. आदेश में व्यक्तिगत कुओं की पहचान करने के लिए, यह सॉफ्टवेयर शोर फिल्टर, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से एक भी उन्नत सेटिंग्स के तहत फिल्टर आधार सहित का उपयोग करने में मदद कर सकते हैं.
    6. उपयुक्त gating द्वारा सकारात्मक ट्रांसफ़ेक्ट जीवित कोशिकाओं के प्रतिशत यों पॉप अलग अलगulations (3 चित्रा). पहले एक FSC बनाम SSC तितर बितर साजिश पर प्रवाह डेटा को देखने के क्रम में मलबे (चित्रा 3A) से अलग कोशिकाओं. यदि propidium आयोडाइड (पीआई) का इस्तेमाल किया गया था, गेट व्यक्तिगत सेल आबादी और दृश्य है कि एक FSC बनाम FL3 साजिश पर डेटा के क्रम में मृत कोशिकाओं और जीवित कोशिकाओं के गेट से जीवित कोशिकाओं को अलग करने के लिए. आदेश में ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं की संख्या यों, उचित चैनलों पर रहते सेल की आबादी को देखने के लिए, उदाहरण के लिए, GFP FL1 में देखा जा सकता है. इलाज जनसंख्या का उपयोग, गेट अनुपचारित कोशिकाओं क्रम में पृष्ठभूमि संकेत (3B चित्रा) की पहचान. सकारात्मक ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं तो इस गेट का उपयोग कर अलग - थलग किया जा सकता है और ट्रांसफ़ेक्ट आबादी दोनों तितर बितर और समोच्च भूखंडों (चित्रा 3C और 3 डी) का उपयोग कर देखने के द्वारा. सकारात्मक ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं के एक सातत्य हो सकता है, के रूप में विभिन्न कक्षों प्रतिदीप्ति के विभिन्न डिग्री के लिए ट्रांसफ़ेक्ट जाएगा.
  3. CellTiter 96 जलीय एक परख
    1. बिल्कुल सेल विषाक्तता माप के लिए एक ही तरीके से दूसरे प्लेट transfect.
    2. Premix CellTiter 96 जलीय 10 मिलीलीटर ताजा मीडिया के साथ एक परख समाधान के 1 मिलीग्राम. कोशिकाओं से मीडिया निकालें और premixed समाधान के 110 μl + अच्छी तरह से प्रति मीडिया को जोड़ने के लिए एक multichannel विंदुक का उपयोग करने के लिए.
    3. 490 एनएम पर हर एक घंटे के अंतराल 1 से 4 घंटा absorbance उपाय है तक अनुपचारित शर्त के साथ अच्छी तरह से absorbance परख की रैखिक रेंज में है. चार एक पृष्ठभूमि absorbance पढ़ने के लिए एकमात्र समाधान + मीडिया के साथ नियंत्रण कुओं को शामिल करें.
    4. स्थिति के अनुसार चार दोहराने कुओं से औसत absorbance मूल्यों और प्रत्येक औसत से औसत पृष्ठभूमि absorbance घटाना. अनुपचारित प्रतिशत सेल व्यवहार्यता का निर्धारण हालत की सही औसत प्रत्येक इलाज हालत के लिए सही औसत सामान्यकरें.
NTA और प्लास्मिड प्रति कण गणना के साथ आकार _title "Nanoparticle> 4.

  1. प्रधानमंत्री fluidics प्रणाली NanoSight NS500 तनुकारक (वस्तु) लगभग 1/5th अधिकतम गति लगभग 1/10th अधिकतम गति पर नमूना पिछड़े पंप पंप पर आगे चल रहा है. जारी रखें जब तक fluidics प्रणाली तनुकारक (वस्तु) के साथ प्लावित है.
  2. विश्लेषण किया जा नैनोकणों तैयार. , PBAEs के मामले में अलग से स्टॉक प्लाज्मिड डीएनए (1 मिलीग्राम / एमएल) और सोडियम एसीटेट बफर में शेयर (100 मिलीग्राम / एमएल) Eppendorf ट्यूब में (25 मिमी, पीएच 5) PBAE पतला.
  3. 0.06 मिलीग्राम / एमएल प्लास्मिड डीएनए एकाग्रता पतला. पॉलिमर एकाग्रता डीएनए बहुलक के लिए आवश्यक वजन वजन अनुपात के आधार पर भिन्न हो सकते हैं (उदाहरण के लिए, 60 / wt wt कणों के लिए, बहुलक 3.6 मिलीग्राम / एमएल पतला है).
  4. प्लास्मिड डीएनए समाधान की एक समान मात्रा बहुलक समाधान जोडें और सख्ती मिश्रण. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए मिश्रण सेते आत्म विधानसभा की अनुमति.
  5. Diवीणा पीबीएस में 100 गुना nanoparticle एकाग्रता के लिए क्रम में nanoparticle समाधान NTA के लिए उपयुक्त रेंज में हो और कम से कम 500 μl की एक अंतिम मात्रा प्राप्त.
  6. NanoSight में नमूना Eppendorf ट्यूब (4A चित्रा) में लोड ट्यूब डाल द्वारा नमूना लोड. सुनिश्चित करें कि हवा बुलबुले परिचय नहीं.
  7. कब्जा मोड में, कैमरे के स्तर में वृद्धि जब तक कण को ​​देखा जा सकता है. ध्यान इतना है कि कणों चिकनी देखो (4A और 4B चित्रा) को समायोजित करें.
  8. जबकि मानक मोड में, मुद्दा यह है कि सभी कणों स्क्रीन पर देखा जा सकता है अतीत कैमरा स्तर को समायोजित. तो ऐसी है कि कणों के सभी अभी भी देखा जा सकता है सबसे कम स्तर के लिए कैमरे का स्तर कम है. यदि एक मध्यवर्ती कैमरा स्तर की जरूरत है, उन्नत मोड में जाने और कैमरे के शटर को संशोधित और उचित स्तर हासिल करने के लिए.
  9. दिखने में यकीन है कि वहाँ 20 के बीच कर रहे हैं बनाने के लिए जाँच - एस पर 100 कणोंcreen. Nanoparticle ट्रैकिंग के लिए एक आदर्श संख्या लगभग 50 कणों है. अगर वहाँ बहुत अधिक या बहुत कुछ कर रहे हैं, NS500 फ्लश, पीबीएस में कमजोर पड़ने समायोजित है, और फिर लोड नमूना.
  10. मानक मोड तालिका के अनुसार कब्जा अवधि को समायोजित करें. 30 आमतौर पर 60 सेकंड एक उपयुक्त कब्जा लंबाई (4B चित्रा) है.
  11. अगले नमूना लोड सिस्टम फ्लश, तो फिर से लोड नया नमूना.
  12. एक बार वीडियो पर कब्जा कर रहे हैं, एक वीडियो फ़ाइल खोलने से प्रसंस्करण चरण के लिए आगे बढ़ना है.
  13. मानकों की एक संख्या है कि आदेश में देखते जा सकता है सबसे अच्छा एक वीडियो की प्रक्रिया (चित्रा 4C) हैं. लक्ष्य के लिए मापदंडों का चयन सबसे अच्छा है कि स्क्रीन पर प्रत्येक कण के रूप में प्रत्येक कण (5 चित्रा) पर स्क्रीन पर एक रेड क्रॉस के निशान से संकेत पर कब्जा है.
  14. स्क्रीन लाभ को बढ़ाने के लिए बेहतर कणों देख. मानक या उन्नत मोड के तहत चयन, ऑटो clickin द्वारा मापदंडों के लिए समायोजितछ उपयुक्त बक्से. मामला है कि ऑटो सेटिंग्स पर्याप्त रूप से कणों का चयन नहीं करते, unclick बॉक्स और मैन्युअल मानकों (चित्रा 4C) सेट.
  15. एक बार सभी कणों स्क्रीन पर उठाया जाता है, सॉफ्टवेयर की प्रक्रिया बटन पर क्लिक करें वीडियो फ़ाइल (चित्रा 4C) की प्रक्रिया. यह कण आकार के वितरण, औसत आकार, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से कण एकाग्रता प्रदान करता है.
  16. आदेश में करने के लिए कुछ है कि कण एकाग्रता सटीक है, 2x द्वारा कमजोर पड़ने में वृद्धि से पीबीएस, कमजोर पड़ने इस तरह के रूप में बदलने के लिए, और उपरोक्त प्रक्रिया को दोहराएँ. एक ही नमूना के कई dilutions मापने के लिए सुनिश्चित करें कि नमूना की एकाग्रता माप सही है की सिफारिश की है. माप के लिए एक अच्छी रेंज 10 -10 7 9 कणों / मिलीलीटर है.
  17. सत्यापित करें कि सभी plasmids नैनोकणों के जेल वैद्युतकणसंचलन चल रहा है और मूल्यांकन कि किसी भी मुफ्त डीएनए मौजूद है नैनोकणों में शामिल कर रहे हैं.यदि plasmids सब नहीं कर रहे हैं समझाया, मानक तकनीक का उपयोग करने के लिए डीएनए absorbance मापने के लिए कुल समझाया plasmids यों.
  18. कण प्रति plasmids की औसत संख्या की गणना करने के लिए, कुल NTA मापा कण एकाग्रता द्वारा समझाया प्लाज्मिड एकाग्रता को विभाजित. आदेश में प्लाज्मिड प्रति कण नमूना वितरण का अनुमान लगाने के लिए, 1 NTA कण आकार हिस्टोग्राम का उपयोग करने के लिए प्रत्येक कण के बिन 1-एनएम की मात्रा अंश की गणना. कुल प्लाज्मिड राशि से गुणा इस मात्रा अंश वितरण प्रत्येक बिन में plasmids की संख्या प्राप्त करने के लिए. प्रत्येक कण आकार (6 चित्रा) लिए plasmids प्रति कण की संख्या प्राप्त करने के लिए प्रत्येक बिन में कणों की संख्या से इन नंबरों फूट डालो.

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Representative Results

चित्रा 1 प्लाज्मिड EGFP साथ HRECs की एक सफल अभिकर्मक का एक उदाहरण के एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी छवि को दर्शाता है. brightfield छवि करने के लिए सुनिश्चित करें कि कोशिकाओं को अपनी सामान्य आकारिकी को बनाए रखने के लिए मददगार है. इसके अतिरिक्त, सेल टन या इसी तरह assays के रूप में व्यवहार्यता assays, nanoparticle 7 विषाक्तता का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. प्रवाह cytometry, के रूप में वर्णित है, अभिकर्मक दक्षता यों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. जब HyperCyt बहु - अच्छी तरह से थाली लगाव का उपयोग, डेटा के लिए उचित संसाधित किया जा क्रम में सही ढंग से कुओं की पहचान की आवश्यकता होगी. चित्रा 2, सही पैनल के रूप में देखा जा सकता है जब सेल मायने रखता है अच्छा (अच्छी तरह से प्रति कोशिकाओं के हजारों) कर रहे हैं, और fluidics सही ढंग से काम कर रहे हैं, व्यक्तिगत कुओं आसान करने के लिए बाहर दोनों मैन्युअल और सॉफ्टवेयर द्वारा लेने हैं. हालांकि, अगर कोशिका की गिनती भी कम कर रहे हैं या वहाँ fluidics के साथ एक समस्या है, यह बहुत अधिक individ की पहचान करने के लिए मुश्किल हो जाता हैual (2 चित्रा बाएं पैनल), कुओं और प्रयोग की संभावना को दोहराया जाना चाहिए. Hypercyt की टयूबिंग जगह अक्सर नमूना प्रवाह के साथ समस्याओं को ठीक कर सकते हैं. एक बार व्यक्ति अच्छी तरह से डेटा प्राप्त कर रहे हैं, सबसे आम प्रवाह cytometry सॉफ्टवेयर निर्यात FCS फ़ाइलों का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. चित्रा 3 में, FlowJo अनुपचारित कुओं की तुलना गेट सकारात्मक ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं के लिए प्रयोग किया जाता है.

100 के बीच PBAE नैनोकणों आम तौर पर कर रहे हैं - आकार में 200 एनएम के रूप में NanoSight NTA मापा. जब NTA प्रदर्शन, यह महत्वपूर्ण है कि स्क्रीन पर नैनोकणों की संख्या 20 के बीच हो - तो 100 है कि सॉफ्टवेयर के लिए सही कणों को ट्रैक करने में सक्षम हो जाएगा चित्रा 5A भी कई कणों का एक उदाहरण है, जबकि चित्रा 5B का एक उदाहरण दिखाता है. एक उपयुक्त संख्या. कब्जा वीडियो प्रसंस्करण में किया जाना चाहिए कि मनाया परदे पर कणों softwar द्वारा उठाया जाता है ई, लाल पार बाल के साथ प्रतिनिधित्व किया. जब कणों को चुनने के लिए सीमा बहुत कम है का एक उदाहरण चित्रा 5C में देखा जा सकता है, जबकि एक बेहतर दहलीज स्तर की एक उदाहरण चित्रा 5D में देखा जाता है. नमूने की एक अलग कमजोर पड़ने लगता है कि नमूना सही एकाग्रता रेंज में है करने के लिए किया जा सकता है. नए कण एकाग्रता NanoSight द्वारा दिए गए नए कमजोर पड़ने से मेल खाना चाहिए. एक बार आकार और कण एकाग्रता प्राप्त कर रहे हैं, प्लाज्मिड प्रति कण औसत और वितरण की गणना की जा सकती है. उदाहरण परिणाम चित्रा 6 में देखा जा सकता है. प्रयोगात्मक समय 7 चित्रा में दिखाया गया है.

/ वेल्स प्लेट / आयतन खैर (μl) / खैर कोशिकाओं
96 100 2,500 से 5,000
NT "> तालिका 1 एक थाली 96 प्रारूप के लिए ठेठ सेल चढ़ाना प्रोटोकॉल.

/ वेल्स प्लेट / आयतन खैर (μl) कण / खैर मात्रा (μl) डीएनए / खैर (छ) डीएनए (छ / μl) डीएनए 1 शेयर / छ μl (μl) राष्ट्रीय मूल्यांकन एवं प्रत्यायन परिषद (μl)
96 100 20 0.6 0.06 3 47

तालिका 2. एक थाली 96 प्रारूप के लिए विशिष्ट डीएनए कमजोर पड़ने प्रोटोकॉल.

पॉलिमर डीएनए (wt wt /) कण / खैर मात्रा (μl) # वेल्स को दोहराने डीएनए / खैर(छ) पॉलिमर / खैर (छ) बहुलक / छ / μl स्टॉक (μl) 10 राष्ट्रीय मूल्यांकन एवं प्रत्यायन परिषद (μl)
20 20 4 0.6 12 6 44
40 20 4 0.6 24 12 38
60 20 4 0.6 36 18 32
100 20 4 0.6 60 30 20

तालिका 3. एक थाली 96 प्रारूप के लिए विशिष्ट बहुलक कमजोर पड़ने प्रोटोकॉल.

चित्रा 1
चित्रा1. एकल PBAE साथ ट्रांसफ़ेक्ट HRECs का रंग चैनल प्रतिदीप्ति इमेजिंग (बाएं) GFP प्रतिदीप्ति, हरे रंग, (मध्य) Brightfield छवि, (सही) समग्र छवि.

चित्रा 2
चित्रा 2. Hypercyt सॉफ्टवेयर एकत्र डेटा के बाद अच्छी तरह से पहचान कदम (बाएं) समस्याग्रस्त fluidics साथ कम मायने रखता है या मुद्दा कारण डेटा का उदाहरण. (सही) साफ डेटा का उदाहरण, आसानी से पहचाना कुओं के साथ बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 3
चित्रा 3. प्लाज्मिड EGFP साथ ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं के लिए FlowJo gating (ए) FSC बनाम अनुपचारित कोशिकाओं के लिए एसएससी, (बी) FL1 बनाम FL3 के लिए यूntreated कोशिकाओं, (सी, डी) FL1 बनाम PBAE साथ ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं के लिए FL3. दोनों छद्म रंग घनत्व (सी) और (डी) समोच्च भूखंडों फाटकों को आकर्षित करने के लिए स्थान निर्धारित करने के लिए उपयोगी होते हैं.

चित्रा 4
चित्रा 4. NanoSight nanoparticle ट्रैकिंग विश्लेषण सॉफ्टवेयर, 2.2 संस्करण के कुछ हिस्सों के स्क्रीनशॉट (ए) fluidics नियंत्रण, (बी) कब्जा मोड, नैनोकणों के वीडियो पर कब्जा करने के लिए प्रयोग किया जाता है, (सी) प्रसंस्करण एक पहले से कब्जा कर लिया वीडियो खोलने के बाद उपलब्ध मोड. लाल बक्से उजागर प्रोटोकॉल में चर्चा में कार्य करता है. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

/ चित्रा 5. वीडियो पर कब्जा से पहले NanoSight वीडियो को पकड़ने और विश्लेषण के उदाहरण के नमूने के लिए नमूना स्क्रीनशॉट है कि पर्याप्त नहीं पतला (ए), और उचित कमजोर पड़ने के साथ (बी), कण का पता लगाने की सीमा के साथ विश्लेषण मोड के स्क्रीनशॉट बहुत कम है (सी) सेट और उचित ढंग से सेट (डी), के साथ रेड क्रॉस के सभी कणों उचित बाल की पहचान. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 6
6 चित्रा. आकार के वितरण और प्लाज्मिड PBAE के प्रति कण वितरण डेटा (B5S3E7, 60:1 बहुलक डीएनए wt / wt) नैनोकणों आधारित NanoSight ट्रैकिंग विश्लेषण तकनीक का उपयोग का विश्लेषण किया. [14] लघु, 8, भिसे, एन एस, Shmueli, आरबी, गोंजालेज से Reprinted ,जे, और ग्रीन, नैनोकणों बहुलक, 367-373, विले - VCH से अनुमति के साथ कॉपीराइट 2012, द्वारा समझाया plasmids की संख्या बढ़ाता के लिए एक उपन्यास परख जे जे. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

7 चित्रा
चित्रा 7. प्रायोगिक समय.

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Discussion

ऊपर प्रोटोकॉल nanoparticle योगों के अभिकर्मक प्रभावकारिता, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से एक कण आकार और नैनोकणों के डीएनए लोड विशेषताएँ का मूल्यांकन करने की विधियों का वर्णन करते हैं. कण प्रति plasmids की संख्या एक महत्वपूर्ण पैरामीटर है कि कण के प्रभाव की भविष्यवाणी करने में मदद कर सकते हैं और भी खुराक निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. Nanoparticle ट्रैकिंग विश्लेषण नमक एकाग्रता में भिन्न करने वालों के रूप में विभिन्न जलीय समाधान, की एक श्रृंखला में किया जा सकता है. अक्सर इस लक्षण वर्णन पीबीएस में किया जाता है, शारीरिक खारा नकल. जबकि पीबीएस में आकार मीडिया या शारीरिक खारा में नैनोकणों के आकार का एक अच्छा अनुमान दे सकते हैं, सीरम वर्तमान की राशि और 17 नैनोकणों के आकार स्थिरता को प्रभावित कर सकते हैं. इसलिए, सीरम के विभिन्न सांद्रता में कण लक्षण वर्णन कुछ अनुप्रयोगों के लिए महत्वपूर्ण के रूप में अच्छी तरह से हो सकता है. आदेश में सीरम, एक additio में कणों और विशेषताएँएनएएल कदम सीरम प्रोटीन की उच्च पृष्ठभूमि बिखरने की वजह से सिफारिश की है. इस मामले में, कण fluorescently सकता है, टैग चाहिए इतना है कि कणों प्रतिदीप्ति फिल्टर के उपयोग के माध्यम से, विशेष रूप से सीरम प्रोटीन से किया जा सकता है साफ़ नज़र रखी.

प्लाज्मिड प्रति कण मात्रा का ठहराव काफी सामान्य करने के लिए अन्य polymeric या अकार्बनिक कण प्रणालियों सहित विभिन्न nanoparticle योगों, के साथ इस्तेमाल किया जा रहा है. विभिन्न सामग्री, वीडियो पर कब्जा और प्रसंस्करण मानकों के विभिन्न प्रकाश बिखरने व्यवहार के कारण संशोधित करने की आवश्यकता हो सकती है. इसके अतिरिक्त, NTA की संवेदनशीलता सामग्री के आधार पर बदल सकता है. प्लाज्मिड प्रति कण ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल नैनोकणों निस्र्पक के लिए एक तेजी से और उपयोगी विधि है.

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Disclosures

लेखक ब्याज की कोई संघर्ष की रिपोर्ट.

Acknowledgments

लेखक का समर्थन करने के लिए धन्यवाद TEDCO (2009 - MSCRFE ००९८ 00) MSCRF और R21CA152473 NIH.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent
Phosphate Buffered Saline, 1x (PBS) Invitrogen 10010
EGM-2MV BulletKit Lonza CC-3202
Trypsin Invitrogen 25300
Sodium acetate buffer Sigma-Aldrich S7899 Dilute to 25mM in deionized water
Dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich 276855
pEGFP DNA Elim Biopharmaceuticals NA
DsRed DNA Addgene 21718
PEI, branched Sigma-Aldrich 408727
CellTiter 96 AQueous One Promega G3580
Materials
Clear flat bottom 96-well plate, sterile Sarstedt 82.1581.001
Clear round bottom 96-well plate, sterile Sarstedt 82.1582.001
12-channel Finnpipette Thermo Scientific NA 5-50 and 50-300 μl
Fluorescence Microscope Zeiss NA Model number: AX10
C6 Accuri flow cytometer BD Biosciences NA
HyperCyt attachment Intellicyt NA
NS500 Nanosight NA

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References

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Polymeric जीन डिलीवरी के मूल्यांकन nanoparticle ट्रैकिंग विश्लेषण और उच्च throughput प्रवाह cytometry द्वारा नैनोकणों
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Shmueli, R. B., Bhise, N. S., Green, J. J. Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (73), e50176, doi:10.3791/50176 (2013).

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