Summary
نفيدكم طريقة لعزل السذاجة السلائف الجلد المشتقة (SKP) خلايا متعددة القدرات من الثقافات الخلايا الليفية الإنسان الأساسية. وتبين لنا أن هذه SKPs المستمدة من الثقافات الليفية تقاسم خصائص الخلايا الجذعية مماثلة لتلك التي تستمد مباشرة من خزعات الجلد البشري. هذه الخلايا تعبر عن علامة قمة العصبية، nestin، بالإضافة إلى علامات متعددة القدرات مثل OCT4 وNANOG.
Abstract
على مدى العقد الماضي، وقد تم تحديد العديد من السكان الكبار الخلايا الجذعية في الجلد البشري 1-4. وذكرت والعزلة السلائف متعددة القدرات الجلدي الكبار أول مرة من قبل ميلر F. D مختبر 5، 6. وصف هذه الدراسات في وقت مبكر متعددة القدرات خلية السكان السلائف من الكبار الأدمة الثدييات 5. هذه الخلايا - SKPs يطلق عليه، لالسلائف الجلد المشتقة - تم عزل وتوسيع نطاقها من القوارض وجلد الإنسان ومتباينة في ذرية على حد سواء العصبي وأرومية متوسطة، بما في ذلك أنواع الخلايا أبدا وجدت في الجلد، مثل الخلايا العصبية 5. كشفت الدراسات Immunocytochemical على SKPs مثقف أن الخلايا أعرب vimentin وnestin، وهو بروتين خيوط الوسيطة التي أعرب عنها في السلائف العضلات العصبي والهيكل العظمي، بالإضافة إلى فبرونيكتين ومتعددة القدرات علامات الخلايا الجذعية 6. حتى الآن، وقد تم عزل الخلايا الجذعية البالغة SKPs السكان من جمعها طازجة خزعات الجلد الثدييات.
ve_content "> في الآونة الأخيرة، وقد أنشأنا وذكرت أن عدد سكانها خلايا الجلد السلائف المستمدة يمكن أن تظل موجودة في الثقافات الليفية الأولية التي أنشئت من خزعات الجلد 7. وكان الافتراض أن عدد قليل من الخلايا الجذعية الجسدية قد تتواجد في الثقافات الليفية الأولية في الأضعاف السكان في وقت مبكر بالاستناد إلى الملاحظات التالية: (1) يتم اشتقاق SKPs والثقافات الليفية الأولية من الأدمة، ويمكن أن تظل موجودة في الثقافات الخلايا الليفية الجلدية الأولية وبالتالي عدد قليل من الخلايا SKP و (2) الثقافات الليفية الأولية نمت من مأخوذة المجمدة التي كانت تعرض لدرجة حرارة غير المواتية أثناء التخزين أو النقل يحتوي على عدد صغير من الخلايا التي ظلت قابلة للحياة 7. هذه الخلايا النادرة كانوا قادرين على توسيع ويمكن passaged عدة مرات. اقترح هذه الملاحظة أن عددا صغيرا من الخلايا مع ارتفاع قوة الانتشار ومقاومة للإجهاد كانت موجودة في الثقافات الخلايا الليفية الإنسان 7.ونحن قد استفادت من تلك النتائج إلى وضع بروتوكول لعزل السريع للخلايا الجذعية البالغة من الثقافات الليفية الأولية التي تتوافر بسهولة من بنوك الأنسجة في جميع أنحاء العالم (الشكل 1). هذا الأسلوب له أهمية كبيرة لأنه يتيح للعزل الخلايا السلائف عندما عينات الجلد لا يمكن الوصول إليها في حين الثقافات الليفية قد تكون متاحة من بنوك الأنسجة، وبالتالي، وفتح فرص جديدة لتشريح الآليات الجزيئية الكامنة وراء الأمراض الوراثية النادرة فضلا عن الأمراض النمذجة في طبق.
Protocol
1. عزل SKP من الثقافات الليفية الابتدائية
- تتم المحافظة على الثقافات الليفية إما من بنوك الخلايا أو الحصول عليها مباشرة من خزعات الجلد في الثقافة في الخلايا الليفية النمو المتوسطة DMEM تحتوي على 15٪ مصل العجل الجنين، 2 مم الجلوتامين، 10 ملغ / مل البنسلين، و 10 ملغ / مل الستربتوميسين.
تم الحصول على الخلايا الليفية الإنسان GMO3349C وGMO8398A من معهد Coriell للأبحاث الطبية (كامدن، ونيو جيرسي) واستخدمت في هذه الدراسة.
- (PPDS) استخدمت الثقافات من الأضعاف السكان 20-35 للثقافات SKP في confluency من 80٪. واحد 10 سم الأنسجة صحن الثقافة دينار بحريني (فالكون) يحتوي على حوالي 1.5x10 6 خلايا.
- غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني واحتضان مع 2 مل من محلول التربسين (0.25٪، إينفيتروجن) لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية.
- جمع الخلايا من اللوحة مع 5 مل PBS ونقل تعليق خلية إلى 15 مل أنبوب الصقر.
- احتضان الخلايا عند 4 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
- إعداد المتوسطة النمو SKP تتألف من DMEM-F12، 03:01 (V / V) و 40 نانوغرام / مل FGF2 (العلوم البيولوجية دينار بحريني، و 20 نانوغرام / مل EGF (العلوم البيولوجية دينار بحريني)، B27 المصل الملحق مجانا 2٪ (إينفيتروجن)، 1 ميكروغرام / مل Fungizone (إينفيتروجن) و 25 ميكرون / مل جنتاميسين (إينفيتروجن).
- بيليه الخلايا في 1،200 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق و resuspend بيليه الخلية مباشرة في 4 مل SKP متوسطة النمو. نقل تعليق الخلية إلى 25 سم 2 الأنسجة قارورة الثقافة دينار بحريني (فالكون).
- احتضان القارورة عند 37 درجة مئوية ورصد الثقافة لتشكيل المجال يوميا لمدة 3 إلى 4 أسابيع.
2. الشروط الثقافة المجال
- خلايا الثقافة في 25 سم 2 قارورة دينار بحريني (فالكون) عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2.
- هز القارورة بقوة يوميا لتجنب الخلايا على الانضمام إلى الجزء السفلي من القارورة. إذا لزم الأمر، ماصة صعودا وهبوطا مع 2 مل ماصة معقمة لفصل الخلايا الملتصقة ونقل الثقافة إلى قارورة جديدة.
- مجالات أول البدء في بناء غضون 3 رس 4 أيام.
- اسمحوا المجالات الرواسب إلى أسفل القارورة وتغير نصف المتوسط كل 3 أيام. للحفاظ على نفس تركيز النهائي من عوامل النمو إضافة عوامل النمو 2X إلى استعداد طازجة متوسطة النمو SKP.
- الحفاظ على حجم أقصى ثابت 4 مل.
- عندما المجالات تصل إلى حجم من ~ 200 مم ينبغي passaged عن طريق تحطيم المجالات إلى حجم أصغر من قبل قوي pipetting صعودا وهبوطا مع 2 مل ماصة.
- يتم تقسيم الثقافة إلى قسمين 25 سم 2 قوارير دينار بحريني (فالكون) والمجالات الثقافات هي تغذية كما هو موضح في الخطوة 2.4).
- يتم جمع المجالات لعلامات الخلايا الجذعية فحص بعد يوم 16-21.
الإجراء من 2.6) و 2.7) وصفا نشر من المجالات ل(1) يسمح اغذية وعوامل النمو المدرجة في SKP المتوسطة على الوصول إلى جميع الخلايا الموجودة في كل مجال و (2) لتوسيع ثقافة المجال SKP قبل الاستخدام.
عادة الثقافات المجال تحت مكعب لديناشروط lture الحفاظ على القدرة على النمو على مدى فترة ثلاثة أشهر، وو passaged بين 3 إلى 4 مرات.
3. كيمياء سيتولوجية مناعية لعلامات الخلايا الجذعية
- ويتم حصاد الثقافات المجال في برنامج تلفزيوني بعد يوم 16-21. الثقافات مكعبات في 1،000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق.
- ومعلق المجالات في حجم صغير من برنامج تلفزيوني.
- رسم دائرتين مع القلم DAKO ما يقرب من 0.5 ميكرون في القطر على شرائح المجهر (فيشر العلامة التجارية).
- إضافة 50 ميكرولتر من تعليق المجال في الدوائر.
- تحقق بواسطة المجهر الضوئي لوجود المجالات في كل قطرة.
- السماح للقطرات الجافة تحت غطاء محرك السيارة.
- إما تجميد الشرائح في -80 درجة مئوية أو المضي قدما في بروتوكول تلطيخ immunofluoresence.
- لتلطيخ المناعي، وتحديد الشرائح مع الميثانول قبل المبردة (100٪) عند درجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
- تغسل الشرائح مع برنامج تلفزيوني.
- منع الشرائح مع PBS/10٪ مصل بقري جنيني / 0.02٪ X100 تريتونلا يقل عن 1 ساعة.
- احتضان مع الأجسام المضادة الأولية (مثل مكافحة Nestin، ومكافحة Oct4، ومكافحة TG30، والأجسام المضادة لمكافحة NANOG، الجدول 3) المخفف في عرقلة العازلة: PBS/10٪ FBS لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
- يغسل 3 مرات مع عرقلة العازلة واحتضان مع الأجسام المضادة الثانوية لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- يغسل 3 مرات مع حجب مرات العازلة و3 مع برنامج تلفزيوني.
- جبل الشرائح مع تصاعد Vectashield المتوسطة (ناقلات وشركة).
- تحليل عينات للتعبير عن علامات الخلايا الجذعية بواسطة المجهر المناعي.
4. تحليل PCR الوقت الحقيقي من مستويات التعبير عن علامات الخلايا الجذعية
- يستغرق حوالي 2-3 الثقافات المجال مل من يوم 18 إلى 21.
- بيليه المجالات في 1،200 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق، ونضح عن المتوسط.
- عزل الحمض النووي الريبي من المجالات باستخدام Minikit RNeasy (QIAGEN، فالنسيا، CA).
- تقييم نقاء RNA بواسطة مطياف وagarose هلام. </ لى>
- توليف [كدنا] (Omniscript الناسخ العكسي (QIAGEN)) باستخدام الحمض النووي الريبي مجموع الخلوية كقالب.
- تحقق من صحة علامات الخلايا الجذعية التي كتبها الحقيقي-PCR باستخدام بادئات لعلامات الخلايا الجذعية (كما هو موضح في الجدول رقم 1) في دولة SYBR الأخضر PCR Mastermix (النظم البيولوجية التطبيقية) بتركيز من 375 نانومتر من كل التمهيدي و 50 نانوغرام من قالب في ميكرولتر 20 حجم رد الفعل. يتم استخدام GAPDH والسيطرة الذاتية.
- لالتضخيم استخدام تمسخ الأولي في 95 درجة مئوية لمدة 2.5 دقيقة تليها 40 دورة في 95 درجة مئوية لمدة 5 ثوانى و 60 درجة مئوية لمدة 20 ثانية.
- تحليل المدى مع 2 (ΔΔCt) الطريقة 8.
5. التمايز الموجهة إلى خلايا العضلات الملساء
- كانت مطلية المجالات من يوم 21-26 إلى 6 أطباق ثقافة جيدا دينار بحريني (فالكون) في SKP المتوسطة.
- وسمح خلايا الالتزام وتتفوق من المجالات في المتوسط SKP لمدة 72 ساعة.
- خلايا العضلات الملساء (SMCS) differentiatبدأ أيون التي بدأها استبدال المتوسطة مع SMC متوسطة التمايز تتكون من الجلوكوز المرتفعة Dulbecco لتعديل النسر المتوسط (إينفيتروجن) تحتوي على 5٪ FBS، 5 نانوغرام / مل PDGF-BB (إينفيتروجن)، و 2.5 نانوغرام / مل TGF-B1 (إينفيتروجن) .
- تم تغيير المتوسطة كل 3 أيام مع استعداد طازجة متوسطة التمايز SMC لفترة من 3 إلى 4 أسابيع في الثقافات.
- تم إجراء فحوص للكشف عن علامات SMC بعد 3 إلى 4 أسابيع بواسطة المناعية.
- تم إصلاح الخلايا مع 4٪ حل بارافورمالدهيد في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة.
- تم permeabilized الخلايا مع برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.3٪ تريتون X-100 لمدة 30 دقيقة.
- وحضنت الخلايا مع أجسام مضادة ضد αSMA (MO851، داكو، 1:100)، أو calponin (M3556، داكو، 1:100) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة ومواصلة تجهيزها كما هو موضح في 3.12) إلى 3.15).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وتبين لنا أن عدد السكان من الخلايا التي تعمل على توسيع انتقائي لتوليد المجالات SKP تحت ظروف النمو للرقابة تتكون من صندوق تعديل العولمة الأوروبي وFGF2 موجودة في الثقافات الخلايا الليفية الجلدية الأولية (الشكل 1) كما ذكرنا مؤخرا 7.
واستخدمت الثقافات الخلايا الليفية من PPDS 15 إلى 25 التي تتوافق عادة إلى سلالات الخلايا الليفية الأولية المتاحة من بنوك الخلايا في هذه الدراسة. الثقافات الليفية المقدمة إلى علاج مزدوج يتألف من العلاج درجات الحرارة الباردة جنبا إلى جنب مع نضوب غذاء لمدة 24 ساعة وصفها في هذه الطريقة بتكاثر الثقافات ولدت تحتوي على مجالات العائمة (ويشار أيضا مضغي الشكل EB الجسم) يشتركون في خصائص نمو مماثلة لتلك المذكورة سابقا لSKPs المستمدة مباشرة من عينات الجلد 7، 9.
هنا نظهر أن استخدام الأسلوب الذي أبلغنا مؤخرا 7، ونحن عزل السكان من اورباLLS من الثقافات الليفية الأولية أن يحمل خصائص مشابهة للخلايا الجذعية / السلائف العصبية متعددة القدرات، عزلها وتعريفها في الأدمة الإنسان والفأر باستخدام الظروف neurosphere ثقافة 5، 10، 11. هذه SKP المستمدة من الثقافات الخلايا الليفية الإنسان الأولية تظهر تجديد الذات رجولية لأنها يمكن توسيعها وpassaged على الأقل لمدة ثلاثة أشهر في المختبر (يرجى الرجوع إلى القسم الأسلوب). عندما وصلت المجالات بحجم 150-200 ميكرون في القطر بعد 18 إلى 21 يوما في الثقافة، وكانوا كسر ميكانيكيا الى اسفل بمعدل 50 ميكرون في القطر، وسمحت لإعادة التوسع في الاستزراع المعلق في SKP المتوسطة. سمح هذه المجالات إلى أسفل كسر في النمو حتى وصلوا إلى 200 ميكرومتر قبل أن passaged مرة أخرى كما هو موضح في قسم الطريقة. يمكن passaged المجالات SKP ثلاث مرات على الأقل. هذه الملاحظة تشير إلى أن الخلايا ضمن مجالات كانت قادرة على تجديد الذات وتوسيع ظل ظروف ثقافة neurosphere كما سthers وأبلغنا 5، 7.
وعلاوة على ذلك، وهذه الخلايا SKP المستمدة من الثقافات الليفية أعرب قمة العصبية والخلايا العصبية الخلايا الجذعية nestin علامة فضلا عن الخلايا الجذعية الجنينية النسخ العوامل NANOG وOct4 والمحفزة خلية علامة السطح TG30 (الشكل 2)، وعلى غرار SKP المستمدة مباشرة من الجلد الخزعات 5، 7، 10. وأشار المناعية في مجالات SKP nestin إشارة إيجابية في السيتوبلازم، 4 أكتوبر أظهرت إشارة النووية تتخللها وأظهرت NANOG إشارة النووية أكثر انتشارا (الشكل 2). بالإضافة إلى ذلك، أعطى علامة سطح الخلية من المحفزة الإنسان الجنينية الجذعية خلايا TG30 إيجابية تلطيخ غشاء هيولي على الاستعدادات المجال SKP (الشكل 2). باستخدام PCR الوقت الحقيقي، ونحن أيضا أكدت وجود mRNAs وترميز nestin وOct4 في إعداد الحمض النووي الريبي معزولة عن المجالات SKP التي جمعتها يوم 18 في ثقافة (الشكل 3 5،10. لمزيد من اختبار multipotency من SKP المستمدة من الثقافات الليفية، ونحن يسببها هذه الخلايا على التمايز إلى خلايا العضلات الملساء (الشكل 4). بعد 3 أسابيع الاستقراء في المتوسط تحتوي على عوامل النمو PDGF-BB وTGF-B1 12، أكد مناعية التعبير عن علامات SMC، αSMA، calponin في SMCS المستمدة من هذه SKPs (الشكل 4).
بشكل جماعي، وهذه الطريقة والنتائج تثبت أن مجالات SKP معزولة عن الثقافات الليفية الأولية تقاسم خصائص مشابهة لتلك التي تستمد من خزعات الجلد، ويجب أن تستمد من الكبار السكان الخلايا الجذعية المقيمين داخل الأدمة جلد الإنسان.
| اسم | Entrez ID | تسلسل التمهيدي | AMPLICON |
| GAPDH | 2597 | F-CTC TGC TCC TCC TGT TCG AC | 144 BP |
| R-TTA AAA GCA دول مجلس التعاون الخليجي CTG GTG AC | |||
| Nestin | 10763 | F-GCCCTGACCACTCCAGTTTA | 200 BP |
| R-GGAGTCCTGGATTTCCTTCC | |||
| 4 أكتوبر | 5460 | F-GAT GGC GTA CTG TGG دول مجلس التعاون الخليجي C | 195 BP |
| R-TGG GAC TCC TCC GGG TTT TG |
الجدول 1. قائمة الاشعال المستخدمة في الوقت الحقيقي PCR وQPCR.
| الجسم المضاد | شركة | عدد كتالوج | تعليقات |
| مكافحة Nestin | Chemicon | MAB5326 | 1/100 |
| مكافحة Oct4 | abcam | ab19857 | 1/400 |
| مكافحة TG30 | ميليبور | TG30 | 1/400 |
| مكافحة NANOG | abcam | ab21624 | 1/400 |
| مكافحة αSMA | داكو | MO851 | 1/100 |
| مكافحة Calponin 1 | داكو | M3556 | 1/100 |
| اليكسا فلور؛ 555 حمار المضادة للأرنب مفتش (H + L) | إينفيتروجن | A31572 | 1/800 |
| اليكسا فلور؛ 555 حمار المضادة للماوس مفتش (H + L) | إينفيتروجن | A31570 | 1/800 |
| اليكسا فلور؛ 488 حمار المضادة للماوس مفتش (H + L) | إينفيتروجن | A21202 | 1/800 |
| اليكسا فلور؛ 488 حمار المضادة للأرنب مفتش (H + L) | إينفيتروجن | A21206 | 1/800 |
الجدول 3. قائمة من الأجسام المضادة المنشأ.
الشكل 1. عزل SKPs من الثقافات الليفية الأولية. ويبين طريقة للثقافة المجال SKP بدءا من المرحلة الابتدائية الثقافات الخلايا الليفية الجلدية GMO3349C في مرور 12. اليوم 0 يظهر التعليق الليفية ابتداء من عام SKP متوسطة النمو. يوم 4 يبين تشكيل المجال المرئي. يوم 17 يظهر نموذجي 3D المجال SKP. شريط النطاق: 50 ملم و 100 ميكرومتر كما هو محدد.arge.jpg "الهدف =" _blank "> اضغط هنا لعرض أكبر شخصية.
الشكل 2. تلوين المناعي من المجالات SKP المستمدة من الثقافات الليفية الأولية. التحليل المناعي التي أجريت على SKPs المستمدة من الثقافات الخلايا الليفية الإنسان الأساسية (GMO3349C). أودعت المجال من يوم 16 على الشرائح المجهر وملطخة مكافحة Nestin، ومكافحة TG30، ومكافحة Oct4 والأجسام المضادة المقاومة للNANOG كما هو محدد. تم counterstained نوى مع الحمض النووي وصمة عار دابي (الأزرق). شريط النطاق: 20 ملم اضغط هنا لعرض أكبر شخصية .
الشكل 4. الخلايا المشتقة من العضلات الملساء من المجالات SKP معزولة عن الثقافات الليفية الأولية. وقد وجهت SKP-المجالات المستمدة من الخلايا الليفية الأولية على التمايز إلى خلايا العضلات الملساء (SMCS). (A) المرحلة التباين التصوير تلخص الخطوات ثقافة مختلفة عن ثقافة المجال SKP لتمايز SMCS (اللوحة العليا). (B) و immunostained SMCS المستمدة من المجالات SKP لعلامات SMC المشار إليه، α-سموتح العضلات الأكتين (αSMA) وcalponin كما هو محدد. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
باستخدام الطريقة الموصوفة هنا، السذاجة الخلايا الجذعية عن طريق الجلد يمكن عزلها عن الثقافات الخلايا الليفية الجلدية الأولية. باستخدام هذا النهج، ونحن ذكرت مؤخرا عزل وتوصيف الخلايا الجذعية البالغة من الثقافات الليفية المستمدة من المرضى الذين يعانون من متلازمة وراثية نادرة، هتشنسون جيلفورد بروجيريا متلازمة 7. كما تظهر هنا تلك السلائف الخلايا صريحة علامات الخلايا الجذعية قادرة على التجديد الذاتي، ويمكن أن توجه إلى تفرق في مختلف الأنساب الخلوية بما في ذلك الخلايا الليفية وخلايا العضلات الملساء (يرجى الرجوع إلى الشكل 4 كتبها نزل وآخرون، 2012) 7. هذا الأسلوب يوفر العديد من المزايا لطريقة ذكرت سابقا لعزل SKPs من عينات الجلد الثدييات 10. SKP يمكن عزلها عن الثقافات الليفية الأولية التي إما أن تكون المنشأة حديثا من خزعات الجلد أو من الثقافات الليفية الأولية الموجودة بالفعل ويمكن الحصول علىمن البنوك المحمولة في جميع أنحاء العالم. هذا النهج الجديد يوفر إمكانية لدراسة الآثار المترتبة على الخلايا الجذعية البالغة في التسبب في الأمراض الوراثية المختلفة والنادرة التي عينات الجلد ليست متاحة بسهولة. وأخيرا، يتيح هذا الأسلوب فرصة لاستكشاف الكبار بيولوجيا الخلايا الجذعية وتشريح تأثيرها أثناء الحالة الفسيولوجية والمرض. في الختام هذا النهج يوفر طريقة جديدة وسريعة لعزل الخلايا السلائف المشتقة الجلد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدينا شيء في الكشف عنها.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل مؤسسة الكسندر فون همبولت (5090371)، ومركز KUHNE كريستين لأبحاث أمراض الحساسية والتعليم (CK-CARE)، وBayerischen Staatsministerium (دينار كويتي).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM high glucose | Invitrogen | 31966-047 | |
| DMEM low glucose | Invitrogen | 21885-108 | |
| fetal bovine serum | Invitrogen | 10270-106 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030-024 | Final conc.: 200 mM |
| Penicillin/ Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | Final conc.: 10 mg/ml /10 mg /ml |
| trypsin solution (0.25%) | Invitrogen | 25200-056 | |
| F-12 Nutrient Mixture (Ham) | Invitrogen | 21765-029 | |
| FGF2 | BD Biosciences | 4114-TC-01M | Final conc.: 40 ng/ml |
| EGF | BD Biosciences | 236-EG-200 | Final conc.: 20 ng/ml |
| PDGFBB | Invitrogen | PHG0043 | Final conc.: 5 ng/ml |
| TGF-b1 | Invitrogen | PHG9204 | Final conc.: 2.5 ng/ml |
| 25 cm2 flask | Omnilab | FALC353109 | |
| PBS w/o CaMg | Invitrogen | 14190-169 | |
| B27 | Invitrogen | 17504-044 | |
| Methanol | Roth | 8388.2 | |
| Vectashield mounting medium | Vector Inc. | H-1200 | |
| RNeasy Minikit | Qiagen, Valencia, CA | 74104 | |
| Omniscript Reverse Transcriptase | Qiagen | 205113 | |
| SsoFast EvaGreen Supermix | BioRad | 172-5201 | |
| Fungizone | Invitrogen | 15290-018 | Final conc.:1 mg/ml |
| Table 2. Specific reagents and equipment. | |||
References
- Jahoda, C. A., Whitehouse, J., Reynolds, A. J., Hole, N. Hair follicle dermal cells differentiate into adipogenic and osteogenic lineages. Exp. Dermatol. 12, 849 (2003).
- Watt, F. M., Celso, L. o, C,, Silva-Vargas, V. Epidermal stem cells: an update. Curr. Opin. Genet. Dev. 16, 518 (2006).
- Blanpain, C., Horsley, V., Fuchs, E. Epithelial stem cells: turning over new leaves. Cell. 128, 445 (2007).
- Hunt, D. P., Jahoda, C., Chandran, S. Multipotent skin-derived precursors: from biology to clinical translation. Vurr. Opin. Biotechnol. 20, 522 (2009).
- Toma, J. G., et al. Isolation of multipotent adult stem cells from the dermis of mammalian skin. Nat. Cell Biol. 3, 778 (2001).
- Fernandes, K. J. L., et al. A dermal niche for multipotent adult skin-derived precursor cells. Nat. Cell Biol. 6, 1082 (2004).
- Wenzel, V., et al. Naïve adult stem cells from patients with Hutchinson-Gilford progeria syndrome express low levels of progerin in vivo. Bio. Open. 1, (2012).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25, 402 (2001).
- Biernaskie, J. A., McKenzie, I. A., Toma, J. T., Miller, F. D. Isolation of skin-derived precursors (SKPs) and differentiation and enrichment of their Schwann cell progeny. Nature Protocol. 1, 2803 (2006).
- Toma, J. G., McKenzie, I., Bagli, D., Miller, F. D. Isolation and characterization of multipotent skin-derived precursors from human skin. Stem Cells. 23, 727 (2005).
- Fernandes, K. J., et al. Analysis of the neurogenic potential of multipotent skin-derived precursors. Electrophoresis. 201, 32 (2006).
- Hill, lK. L., et al. Human embryonic stem cell-derived vascular progenitor cells capable of endothelial and smooth muscle cell function. Exp. Hematol. 38, 246 (2010).
