Summary
私たちは、初代ヒト線維芽細胞培養からナイーブ多能皮膚由来の前駆体（SKP）細胞を単離する方法を報告する。我々は、線維芽細胞培養物に由来するこれらのSKPsは、ヒト皮膚生検から直接誘導されるものに類似した幹細胞の特性を共有することを示している。これらの細胞は、そのようなOCT4とNanogのような多能性マーカーに加えて、神経堤マーカー、ネスチンを発現。
Abstract
過去10年間で、いくつかの成体幹細胞集団はヒトの皮膚1-4に同定されている。多能成人皮膚前駆体の単離は、最初の6ミラーF. D実験室5、により報告された。これらの初期の研究では成体哺乳類の真皮5から多能性前駆細胞集団を記述した。これらの細胞は-と呼ばSKPs、皮膚由来の前駆体のためには、 -単離され、げっ歯類とヒトの皮膚から拡大し、そのようなニューロン5などの皮膚に見たことがない種類の細胞を含む神経と中胚葉の両方の子孫へと分化させた。培養SKPs上の免疫細胞化学的研究は、細胞は、フィブロネクチンおよび多能性幹細胞マーカー6に加えて、ビメンチンおよびネスチン、神経および骨格筋において発現前駆体中間体フィラメントタンパク質を発現することを明らかにした。今までは、成体幹細胞集団のSKPsを、新たに収集された哺乳動物の皮膚生検から単離されている。
ve_content ">最近、我々は皮膚の人口に由来前駆細胞は、皮膚生検7から確立された主要な線維芽細胞培養中に存在し続けたことを確立し、報告している。少数体性幹細胞は、早期の集団倍加一次線維芽細胞培養にある可能性があることは前提だった（1）SKPs及び一次線維芽細胞培養は、真皮から誘導されるので、SKP少数の細胞は、一次皮膚線維芽細胞培養物とされている凍結アリコートから成長した（2）一次線維芽細胞培養物中に存在残る可能性が以下の観測結果に基づいて7生残った少数の細胞を含有する貯蔵又は転送時に好ましくない温度にさらさこれらの稀な細胞を数回拡大すると、継代され得ることができた。この観察は示唆高い増殖能やストレスに対する抵抗性を有する細胞の数が少ないヒト線維芽細胞培養7に存在していた。我々は、世界中の組織バンク（ 図1）から容易に入手可能である一次線維芽細胞培養からの成体幹細胞の迅速な分離のためのプロトコルを確立するために、これらの知見を利用した。線維芽細胞培養がで稀な遺伝性疾患と同様にモデリング疾患の根底にある分子機構を分析するための新しい機会を開くため、組織バンクから入手可能かもしれないが皮膚サンプルにアクセスできないときには前駆細胞の単離を可能にするため、この方法では、重要な意義を持っているディッシュ。
Protocol
1。プライマリ線維芽細胞培養からSKPアイソ
- 線維芽細胞培養物のいずれか細胞バンクから、または直接、皮膚生検から得られた15％ウシ胎児血清、2mMグルタミン、10 mg / mlのペニシリン、および10 mg / mlのストレプトマイシンを含有する繊維芽細胞増殖培地DMEMで培養で維持される。
ヒト線維芽細胞GMO3349CとGMO8398Aは、医学研究のための医学研究所（キャムデン、NJ）から得られた結果であり、本研究で使用した。
- 集団倍加から培養物（PPDファイル）が20〜35は80％の集密度でSKP培養に用いた。 One 10センチ組織培養ディッシュ（BDファルコン）は、約1.5×10 6個の細胞が含まれています。
- ℃で37℃で1時間、2ミリリットルトリプシン溶液（0.25％、Invitrogen社）を含むPBSとインキュベートして細胞を洗浄
- 5ミリリットルのPBSでプレートから細胞を回収し、15ミリリットルファルコンチューブに細胞懸濁液を移す。
- 24時間4℃で細胞をインキュベート。
- DMEM-F12、3:1（V / V）および40 ngの/ mlのFGF2（BD Biosciences社、20 ngの/ mlのEGF（BD Biosciences社）、B27血清フリーサプリメント2％（Invitrogen）を、1μgの成るSKP増殖培地を調製/ mlのファンギゾン（Invitrogen社）および25μmの/ mlのゲンタマイシン（Invitrogen社）。
- ペレットを5分間1,200 rpmで細胞および4ミリリットルSKP増殖培地中で直接細胞ペレットを再懸濁し。 25cm 2の組織培養フラスコ（BDファルコン）に細胞懸濁液を移す。
- 37℃でフラスコをインキュベートすると、3〜4週間毎日球形成のために文化を監視します。
2。球の培養条件
- 37°C、5％CO 2で25cm 2のフラスコ（BDファルコン）における培養細胞。
- フラスコの底に付着した細胞を回避するために、積極的に毎日のフラスコを振る。必要であれば、接着細胞を切り離し、新しいフラスコに文化を転送するには、2 mlの滅菌ピペットでピペッティングと。
- 最初の球は3トン以内の構築を開始O 4日。
- 3日おきにフラスコの底に球が沈殿しましょうと培地の半分を変更してください。成長因子の同一の最終濃度を維持するためには、新たに調製したSKP増殖培地に2X成長因子を追加します。
- 4ミリリットル最大音量を一定に保つ。
- 球が〜200mmのサイズに達すると、それらは激しく2ミリリットルピペットで上下にピペッティングによって小さいサイズに球を分解することによって継代されるべきである。
- 文化は）ステップ2.4で説明したようにフィード二つ25cm 2のフラスコ（BDファルコン）と球培養に分割されます。
- 球体21日16によってスクリーニング幹細胞マーカーのために収集される。
2.6から手順）と2.7）が（1）〜球の伝播を記述する各球内のすべてのセルにアクセスするために、（2）先使用をSKP球文化を拡大するSKP培地に含まれる栄養分や成長因子を可能にします。
当社CU下通常スフィア培養lture条件は、3ヶ月の期間を上に成長する能力を維持し、3〜4回の間で継代する。
3。幹細胞マーカーのための免疫細胞化学
- 球培養物を、16日目で21にPBSで収穫される。文化は5分間1,000 rpmでペレット化されています。
- 球はPBSを少量に再懸濁する。
- 顕微鏡スライド（フィッシャーブランド）で直径約0.5μmのDAKOペンで二つの円を描画します。
- サークルに球懸濁液50μLを加える。
- 各ドロップ球の存在を光学顕微鏡で確認してください。
- ボンネットの下に滴が乾燥してみましょう。
- どちら-80℃でスライドを凍結または免疫蛍光染色プロトコルを進める。
- 免疫蛍光染色のために、10分間-20℃で予冷メタノール（100％）でスライドを固定します。
- PBSでスライドを洗浄します。
- PBS/10％ウシ胎児血清/ 0.02％トリトンX100でスライドをブロック少なくとも1時間。
- PBS/10％4で室温で2時間または一晩のためにFBS℃まで：ブロッキングバッファーで希釈した一次抗体（ 例えば 、抗ネスチン、抗Oct4の、抗TG30、抗Nanogの抗体を、 表3）とインキュベート
- ブロッキング緩衝液で3回洗浄し、室温で1時間二次抗体と共にインキュベートする。
- PBSでバッファと3回をブロックで3回洗浄します。
- ベクタシールドマウント培地（株式会社ベクター）でスライドをマウントします。
- 免疫蛍光顕微鏡検査によって幹細胞マーカーの発現のためのサンプルを分析する。
4。幹細胞マーカーの発現レベルのリアルタイムPCR解析
- 18日目から21日まで約2〜3ミリリットルのスフィアの文化を取る。
- ペレットを5分間1,200 rpmで球とすべて培地を吸引。
- をRNeasyミニキット（キアゲン、バレンシア、CA）を使用して、球からRNAを分離します。
- 分析し、アガロースゲルでのRNA純度を評価する。</李>
- テンプレートとして全細胞RNAを用いて（オムニスクリプト逆転写酵素（キアゲン））cDNAを合成。
- 20μlの各プライマーの375 nmおよびテンプレート50ngの濃度のパワーのSYBR Green PCRマスターミックス（Applied Biosystems社）における幹細胞マーカー（ 表1に示されている）のためのリアルタイム-PCRプライマーを用いによって幹細胞マーカーを検証反応容積。 GAPDHは、内在性コントロールとして使用される。
- 増幅のために95℃で初期変性95℃で40サイクル℃で5秒、20秒のために60°CのためのCに続いて2.5分のためのCを使用しています。
- 2（ΔΔCT）法8と走りを分析します。
5。平滑筋細胞内に向け分化
- 一日21〜26球はSKP培地中で6ウェル培養皿（BDファルコン）に播種した。
- 細胞は、72時間付着し、SKP培地中球から脱却させた。
- 平滑筋細胞（平滑筋細胞）differentiatイオンは、高グルコース5％FBS、5 ngの/ mlのPDGF-BB（Invitrogen社）、および2.5 ng / mlのTGF-B1（Invitrogen）を含むダルベッコ改変イーグル培地（Invitrogen）を成るSMC分化培地で培地に交換することによって開始開始。
- 媒体は文化で、3〜4週間の期間のために新たに調製SMC分化培地で3日ごとに変更されました。
- SMCマーカーのスクリーニングは、免疫組織化学によって、3〜4週間後に行った。
- 細胞を10分間、PBS中の4％パラホルムアルデヒド溶液で固定した。
- 細胞をPBSで30分間、0.3％トリトンX-100を含有する透過処理した。
- 細胞は、3.15へ）を室温で1時間αSMA（MO851、ダコ、1:100）、またはカルポニン（M3556、ダコ、1:100）に対する抗体でインキュベートし、3.12で説明したようにさらに処理された）。
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Representative Results
我々は、最近7を報告したように選択的にEGFとFGF2からなる制御された成長条件の下でSKP球を生成するために展開した細胞の集団は、一次皮膚線維芽細胞培養（ 図1）中に存在することを示している。
典型的には、細胞バンクから入手可能な一次線維芽細胞株に対応するPPDは15〜25線維芽細胞培養は、本研究で使用した。この方法で説明した24時間のために栄養の枯渇とともに低温処理から成る二重治療に提出線維芽細胞培養は、一つとして同じような成長特性を共有するフローティング球を（また、胚様体のEBと称する）を含む再現生成された文化が直接派生SKPsについて前述皮膚サンプル7,9から。
ここで我々は、最近7を報告している方法を使用している、我々は、CEの人口を分離見せるニューロスフィアの培養条件5、10、11を用いて、ヒトおよびマウスの真皮に単離され、同定され、多能性神経幹/前駆細胞に類似した特性を示す一次線維芽細胞培養物からLLS。彼らが展開され、in vitroで三ヶ月のうち少なくとも期間（方法の項を参照してください）のために継代することができますように、これらの主要なヒト線維芽細胞培養物からSKP由来は、自己複製能力を示しています。球は文化の中で18から21日後に直径が150〜200μmの大きさに達したとき、それらは機械的に、直径50μmの平均的に分解し、SKP培地に懸濁培養で再拡大させた。彼らは方法の項で説明したように前に再び継代されて200μMに達するまで、これらの壊れたダウン球は増殖させた。 SKP球が少なくとも3回継代することができる。この観察は、球内の細胞がoとしてニューロスフィアの培養条件下で自己を更新し、拡大することができたことを示しているその他、我々は5,7を報告した。
また、線維芽細胞培養由来これらSKP細胞は神経堤を表明し、同様に皮膚から直接派生SKPへ同様に胚性幹細胞の転写要因NanogのとOct4の多能性細胞表面マーカーTG30（ 図2）のような神経幹細胞マーカーのネスチン、バイオプシー5、7、10。 SKP球上の免疫組織は細胞質内のネスチン陽性のシグナルを示し、10月4日には、句読点核信号を示し、Nanogのはより拡散し、核信号（ 図2）を示した。また、多能性のヒト胚性幹細胞TG30の細胞表面マーカーは、SKP球製剤（ 図2）に正の細胞質膜染色を行った。リアルタイムPCRを用いて、我々はまた、培養中の18日目によって収集SKP球（ 図3から単離されたRNAの調製におけるネスチンをコードするmRNAおよびOct4のの存在を確認した5,10由来SKPsに対して報告多能性幹細胞マーカーを発現することを示している。さらに、線維芽細胞培養物由来のSKPの多分化をテストするために、我々は、平滑筋細胞（ 図4）に分化するように、これらの細胞を誘導した。成長因子PDGF-BBとTGF-B1 12を含む培地で3週間の誘導後、免疫細胞はSMCマーカー、αSMA、これらSKPs由来平滑筋細胞におけるカルポニン（ 図4）の発現を確認した。
集合的に、この方法と所見は、一次線維芽細胞培養物から単離されたSKP球は皮膚生検由来のものに類似の特性を共有し、人間の皮膚の真皮内に存在する成体幹細胞集団から派生しなければならないことを示している。
| 名前 | EntrezのID | プライマー配列 | 単位複製配列 |
| GAPDH | 2597 | F-CTC TGC TCC TCC TGT TCG AC | 144 bpの |
| R-TTA AAA GCA GCC CTG GTG AC | |||
| ネスチン | 10763 | F-GCCCTGACCACTCCAGTTTA | 200 bpの |
| R-GGAGTCCTGGATTTCCTTCC | |||
| 4〜10月 | 5460 | F-GAT GGC GTA CTG TGG GCC C | 195 bpの |
| R-TGG GAC TCC TCC GGG TTT TG |
表1。リアルタイムPCRや定量PCRに用いたプライマーのリスト。
| 抗体 | 会社 | カタログ番号 | 注釈 |
| 抗ネスチン | ケミコン | MAB5326 | 1/100 |
| 抗Oct4の | アブカム | ab19857 | 1/400 |
| 抗TG30 | ミリポア | TG30 | 1/400 |
| 抗Nanogの | アブカム | ab21624 | 1/400 |
| 抗αSMA | ダコ | MO851 | 1/100 |
| 抗カルポニン1 | ダコ | M3556 | 1/100 |
| アレクサ弗素; 555ロバ抗ウサギIgG（H + L） | インビトロジェン | A31572 | 1/800 |
| アレクサ弗素; 555ロバ抗マウスIgG（H + L） | インビトロジェン | A31570 | 1/800 |
| アレクサ弗素; 488ロバ抗マウスIgG（H + L） | インビトロジェン | A21202 | 1/800 |
| アレクサ弗素; 488ロバ抗ウサギIgG（H + L） | インビトロジェン | A21206 | 1/800 |
表3。抗体由来のリスト。
図1。プライマリー繊維芽細胞培養からSKPsの分離。通路12でGMO3349Cプライマリー真皮線維芽細胞培養から始まるSKP球培養用方法が概説されています0日目にSKP増殖培地における出発線維芽細胞懸濁液を示している。 4日目には、目に見える球形成を示す。 17日目は、一般的な3D SKP球を示しています。スケールバー：50 mmで示されるように、100μmである。arge.jpg "ターゲット=" _blank ">より大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください。
図2。主要な線維芽細胞培養由来SKP球の免疫蛍光染色。ヒト初代線維芽細胞培養（GMO3349C）に由来SKPsで行わ免疫蛍光分析。 16日目から球を顕微鏡スライド上に堆積され、示されているように、抗ネスチン、抗TG30、抗あるOct4とNanogの抗抗体で染色した。核はDNA DAPI（青）で対比染色した。スケールバー：20ミリメートルより大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください 。
図4。平滑筋細胞由来の初代線維芽細胞培養物から単離された球体からSKP。一次線維芽細胞由来のSKP球、平滑筋細胞（平滑筋細胞）に分化するように指示した。 （A）位相コントラストイメージングは、平滑筋細胞の分化（上部パネル）にSKP球培養物から異文化の手順をrecapitulating。 （B）は、SKP球由来平滑筋細胞は、α-スムート、指示されたSMCマーカー免疫染色したH筋アクチン（αSMA）とカルポニンが示されるように。 より大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください 。
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Discussion
本明細書に記載した方法を用いて、ナイーブ皮膚幹細胞は、一次皮膚線維芽細胞培養物から単離することができる。このアプローチを使用して、我々は最近まれな遺伝症候群、ハッチンソン·ギルフォード早老症候群7患者由来線維芽細胞培養からの成体幹細胞の単離と特性を報告した。としてそれらの前駆細胞を発現幹細胞マーカーは自己再生が可能であり、（お願いヴェンツェルらによって、図4を参照してください、2012年）線維芽細胞および平滑筋細胞7を含む異なる細胞系列に分化するよう指示することができますここに表示されます。この方法は、以前に哺乳類の皮膚サンプルからSKPs 10を単離するための報告された方法にはいくつかの利点を提供しています。 SKPのいずれか新たに皮膚生検から、または既に存在している一次線維芽細胞培養物から確立され得ることができる一次線維芽細胞培養物から単離することができる世界中の細胞バンクから。この新しいアプローチは、皮膚のサンプルが容易に入手できないであるため、様々な遺伝的および稀な疾患の病因に成体幹細胞の含意を検討する可能性を提供しています。最後に、この方法では、成体幹細胞生物学を探索し、生理と病気の状態の間に彼らの影響力を解剖する機会の窓を提供しています。結論として、このアプローチは、皮膚由来の前駆細胞を分離するための新規かつ迅速な方法を提供します。
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Disclosures
我々は、開示することは何もありません。
Acknowledgments
この作品は、アレクサンダー·フォン·フンボルト財団（5090371）、アレルギーの研究教育のためのクリスティンキューネセンター（CK-CARE）、およびバイエルンStaatsministerium（KDへ）によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM high glucose | Invitrogen | 31966-047 | |
| DMEM low glucose | Invitrogen | 21885-108 | |
| fetal bovine serum | Invitrogen | 10270-106 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030-024 | Final conc.: 200 mM |
| Penicillin/ Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | Final conc.: 10 mg/ml /10 mg /ml |
| trypsin solution (0.25%) | Invitrogen | 25200-056 | |
| F-12 Nutrient Mixture (Ham) | Invitrogen | 21765-029 | |
| FGF2 | BD Biosciences | 4114-TC-01M | Final conc.: 40 ng/ml |
| EGF | BD Biosciences | 236-EG-200 | Final conc.: 20 ng/ml |
| PDGFBB | Invitrogen | PHG0043 | Final conc.: 5 ng/ml |
| TGF-b1 | Invitrogen | PHG9204 | Final conc.: 2.5 ng/ml |
| 25 cm2 flask | Omnilab | FALC353109 | |
| PBS w/o CaMg | Invitrogen | 14190-169 | |
| B27 | Invitrogen | 17504-044 | |
| Methanol | Roth | 8388.2 | |
| Vectashield mounting medium | Vector Inc. | H-1200 | |
| RNeasy Minikit | Qiagen, Valencia, CA | 74104 | |
| Omniscript Reverse Transcriptase | Qiagen | 205113 | |
| SsoFast EvaGreen Supermix | BioRad | 172-5201 | |
| Fungizone | Invitrogen | 15290-018 | Final conc.:1 mg/ml |
| Table 2. Specific reagents and equipment. | |||
References
- Jahoda, C. A., Whitehouse, J., Reynolds, A. J., Hole, N. Hair follicle dermal cells differentiate into adipogenic and osteogenic lineages. Exp. Dermatol. 12, 849 (2003).
- Watt, F. M., Celso, L. o, C,, Silva-Vargas, V. Epidermal stem cells: an update. Curr. Opin. Genet. Dev. 16, 518 (2006).
- Blanpain, C., Horsley, V., Fuchs, E. Epithelial stem cells: turning over new leaves. Cell. 128, 445 (2007).
- Hunt, D. P., Jahoda, C., Chandran, S. Multipotent skin-derived precursors: from biology to clinical translation. Vurr. Opin. Biotechnol. 20, 522 (2009).
- Toma, J. G., et al. Isolation of multipotent adult stem cells from the dermis of mammalian skin. Nat. Cell Biol. 3, 778 (2001).
- Fernandes, K. J. L., et al. A dermal niche for multipotent adult skin-derived precursor cells. Nat. Cell Biol. 6, 1082 (2004).
- Wenzel, V., et al. Naïve adult stem cells from patients with Hutchinson-Gilford progeria syndrome express low levels of progerin in vivo. Bio. Open. 1, (2012).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25, 402 (2001).
- Biernaskie, J. A., McKenzie, I. A., Toma, J. T., Miller, F. D. Isolation of skin-derived precursors (SKPs) and differentiation and enrichment of their Schwann cell progeny. Nature Protocol. 1, 2803 (2006).
- Toma, J. G., McKenzie, I., Bagli, D., Miller, F. D. Isolation and characterization of multipotent skin-derived precursors from human skin. Stem Cells. 23, 727 (2005).
- Fernandes, K. J., et al. Analysis of the neurogenic potential of multipotent skin-derived precursors. Electrophoresis. 201, 32 (2006).
- Hill, lK. L., et al. Human embryonic stem cell-derived vascular progenitor cells capable of endothelial and smooth muscle cell function. Exp. Hematol. 38, 246 (2010).
