Summary
We beschrijven werkwijzen voor levende cellen videomicroscopie van
Abstract
Fagocytische klaring van schimmels en micro-organismen meer in het algemeen worden geacht te bestaan uit vier verschillende fasen: (i) migratie van fagocyten naar de plaats waar ziekteverwekkers zich bevinden; (ii) erkenning van pathogeen geassocieerde moleculaire patronen (PAMPs) door pattern herkenningsreceptoren (PRRS), (iii) afblazen van micro-organismen gebonden aan het celmembraan fagocyt en (iv) verwerking van overspoeld cellen rijpen in fagosomen en digestie van de opgenomen deeltjes. Studies die fagocytose beoordelen in zijn geheel informatief 1, 2, 3, 4, 5 maar zijn beperkt omdat zij normaal niet het proces af te breken in migratie afblazen en fagosoom rijping, die verschillend kunnen worden beïnvloed. Bovendien zijn dergelijke studies beoordelen opname als een enkele gebeurtenis, niet als een continu dynamisch proces. We hebben recent ontwikkelde geavanceerde live-cell imaging technologieën, en hebben samen deze met genetische functionele analyse van zowelpathogeen en gastheer cellen om een cross-disciplinair platform voor de analyse van aangeboren immuunsysteem cel functie en schimmel pathogenese te creëren. Deze studies hebben aangetoond vernieuwende aspecten van fagocytose die alleen kunnen worden waargenomen met behulp van systematische temporele analyse van de moleculaire en cellulaire interacties tussen menselijke fagocyten en schimmels en besmettelijke micro-organismen meer in het algemeen. Zo zijn we begonnen voor het volgende: (a) de bestanddelen van het celoppervlak voor elke fase van het proces van herkenning, afblazen en doden van schimmelcellen 1, 6, 7, 8, (b) hoe oppervlaktegeometrie beïnvloedt de efficiency van macrofaag opname en doden van gist en hyphale cellen 7, en (c) hoe engulfment leidt tot wijziging van de celcyclus en het gedrag van macrofagen 9, 10.
In tegenstelling tot enkel tijdstip snapshots, levende cellen videomicroscopie maakt een grote verscheidenheid van gastheercellen en pathogenen worden bestudeerd continu sequenties over langere perioden, het verstrekken van ruimtelijke en temporele informatie over een breed scala aan dynamische processen, met inbegrip van celmigratie, replicatie en vesiculair transport. Hier beschrijven we in detail hoe u gastheer en schimmelcellen voor te bereiden, en om de video microscopie experimenten uit te voeren. Deze methoden kunnen een door de gebruiker gids voor toekomstige studies met andere fagocyten en micro-organismen.
Protocol
1. C. albicans Groei en voorwaarden
- Bereid SC-Ura agarplaten door toevoeging 6,9 g giststikstofbase zonder aminozuren, 1 ml 1 M NaOH, 10 ml 1% (w / v) adenine hemisulfaat zout en 20 g technische agar (eerder in detail beschreven in 11). Vul volume tot 900 ml met gedestilleerd H 2 O. Autoclaaf, laat agar afkoelen, maar niet genoeg om te stollen, en vervolgens 50 ml steriel 40% D-glucose en 50 ml steriel 4% SC-Ura uitval toe te voegen onder aseptische omstandigheden. Meng, giet in petrischalen en laat agarplaten afkoelen en stollen. Store agarplaten bij 5 ° C tot gebruik.
- Streak C. albicans serotype A stam CAI4 + CIp10 van glycerol voorraad bij -80 ° C op SC-Ura agar plaat.
- Incubeer plaat bij 30 ° C tot kolonies vormen en bewaar bij 5 ° C.
- Cultuur een C. albicans kolonie in 5 ml SC-Ura medium (recept als in 1.1, maar zonder technische agar) en incubeer overnacht bij 30° C, 200 rpm tot de stationaire fase C. genereren albicans.
2. C. albicans kleuring met fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC)
- Voeg 10 ul C. albicans kweek gedurende de nacht tot 990 ul PBS (pH 7,4) en het uitvoeren van een celgetal met een hemocytometer.
- Om visualisatie van C. helpen albicans tijdens fagocytose assays, vlek 1 × 10 8 C. albicans met 1 mg / ml FITC in 0,05 M carbonaat-bicarbonaat buffer (pH 9,6) gedurende 10 min bij kamertemperatuur in het donker.
- Om ongebonden FITC te verwijderen, wassen C. albicans in 1 ml 1 x PBS, centrifuge bij 3000 x g gedurende 5 minuten, verwijder supernatant en resuspendeer pellet in 1 ml 1 x PBS. Herhaal dit 3 keer.
- Hersuspendeer pellet bij 1 x 10 6 cellen / ul in 1 x PBS.
3. Voorbereiding van de J774.1 Mouse macrofaagcellijn
- Behoud J774.1 macrofagen in 75 cm 2 weefselkweekflessen in DMEM medium aangevuld met 10% (v / v) foetaal kalfsserum (FCS), 200 U / ml penicilline / streptomycine en 2 mM L-glutamine bij 37 ° C met 5% CO2. De bereiding van primaire macrofagen elders in detail 12, 13.
- Schrapen J774.1 cellen van het weefselkweekfles en overbrengen naar een 50 ml Falcon buis. Centrifugeer bij 600 xg gedurende 5 minuten aan een cel pellet te verkrijgen.
- Verwijder supernatant en resuspendeer pellet in 10 ml voorverwarmde DMEM aangevuld medium. Tellen cellen met behulp van een hemocytometer en plaat 1 × 10 6 J774.1 macrofagen in 2 ml aangevuld DMEM medium in een 35 mm glas-based imaging schotel. Incubeer overnacht bij 37 ° C, 5% CO2.
- Voorafgaand aan beeldvorming, aangevuld DMEM medium vervangen met 2 ml voorverwarmd aangevuld CO 2-onafhankelijke medium (met 10% (v / v) foetaal kalfsserum (FCS), 200 U / ml penicilline / streptomycine en 2 mM L-glutamine) met 1 uM LysoTracker Rode DND-99.
4. Live Cell Video Microscopie Fagocytose Assay
- De keuze van de microscoop zal afhangen van wat er beschikbaar is ter plaatse, maar de microscoop setup moet een omgekeerde fase, een klimaatkamer verwarmd tot 37 ° C zijn en excitatie / emissie filters voor de gekozen vlekken (FITC en TRITC).
- Voorafgaande Zet de microscoop kachel aan het experiment en of voldoende tijd voor de milieu-regelkamer te warmen tot 37 ° C. De tijd die nodig is voor de kamer temperatuur te stabiliseren zal variëren voor verschillende microscoop opstellingen.
- Zet de microscoop en computer, en laad de imaging software. Monteer de beeldvorming schotel op de microscoop podium en pas de scherpstelling aan de J774.1 macrofagen te vinden. Optimaliseer de verschijning van TRITC en DIC beelden door een aanpassing van het percentage van doorvallend licht en sluitertijden.
- Verwijder de beeldeenheid schotel en voeg 3 × 10 6 FITC-gekleurde C. albicans thij schotel. Noteer het tijdstip waarop C. albicans wordt toegevoegd aan de schotel. Zet de schotel naar het podium en optimaliseren van de verschijning van FITC beelden indien nodig. Stel een punten lijst indien nodig.
- Begin beeldvorming als alle punten zijn scherp en de kanalen zijn geoptimaliseerd. Capture FITC, TRITC en DIC beelden elke minuut gedurende 6 uur.
Representative Results
Hier laten we representatieve resultaten voor C. albicans opname door een murine macrofaag cellijn J774.1 gedurende 6 uur levende cellen videomicroscopie experiment. Figuur 1 is een representatief levende cellen videomicroscopie film geeft fagocytose van C. albicans by murine J774.1 macrofagen. Live-cell microscopie video maakt internalisatie van C. albicans te worden gevisualiseerd zonder de noodzaak om externe Candida kleuring. Tijdens deze experimenten C. albicans werd gekleurd met de pH-gevoelige kleurstof FITC (groen) wordt gedoofd tijdens verzuring van de macrofaag fagosoom en faciliteert de bevestiging dat Candida is geïnternaliseerd (figuur 1). Om verdere steun visualisatie van de ingenomen C. albicans, macrofagen werden gekleurd met de rode fluorescerende kleurstof LysoTracker rood NS-99, dat vlekken zure compartimenten en dient als niet-specifieke marker van fagosoom rijping.Figuur 2 is een foto van een levende cellen videomicroscopie experiment en illustreert de variatie in het aantal C. albicans ingenomen door individuele J774.1 macrofagen. In dit experiment 82% van J774.1 macrofagen overspoeld tenminste een C. albicans cel aan het einde van de 6 uur fagocytose assay. In figuur 3 is het aantal geïnternaliseerde C. albicans cellen per macrofaag beschreven. Het gemiddelde aantal C. albicans up per macrofaag genomen is 3,4, maar interessant macrofagen kunnen innemen tot 16 schimmelcellen. Figuur 4 is een reeks van stilstaande beelden van een representatief levende cellen videomicroscopie experiment geeft een macrofaag fagocyteren C. albicans cellen, hypha groei met de macrofagen en uiteindelijk macrofaag lysis. Figuur 4 illustreert dat videomicroscopie maakt analyse van gebeurtenissen na afblazen van doelwitcellen, dwz data worden gegenereerd voor de killing van macrofagen door C. albicans hyfen in verhouding tot het aantal en morfogenese van ingenomen doelcellen en hoe macrofaag doden betreft fagosoom rijping die bestudeerd kan worden in real time.
Figuur 1. Live-cell microscopie video filmpje dat fagocytose van C. albicans by murine J774.1 macrofagen. Macrofagen zijn gekleurd met behulp van de rode fluorescerende kleurstof LysoTracker rode DND-99, en C. albicans worden gekleurd met FITC (groen). Macrofagen en C. albicans werden samen gekweekt gedurende 6 uur bij 37 ° C in volledige CO 2-onafhankelijke medium. Beelden werden vastgelegd met een min tussenpozen gedurende 6 uur. Macrofagen kunnen worden gezien tot oprichting van cel-cel contact met C. albicans, die vervolgens wordt gevolgd door opname van C. albicans in macrofaag fagosomen. Pijlen wijzen C. albicans voorafgaand aan afblazen door J774.1 macrofagen. Deze video laat ook zien dat FITC fluorescentie QuEnc ished volgende afblazen van C. albicans. Scale bar, 10 um. Klik hier om film te bekijken .
Figuur 2. Representatieve levende cellen videomicroscopie stilstaand beeld met variatie in het aantal C.albicans overspoeld door individuele macrofagen. Macrofagen (rood gekleurd met LysoTracker NS-99) werden samen gekweekt met FITC-gekleurde C. albicans (groen). Er variatie in het aantal C. albicans overspoeld (een getal naast een pijl geeft het aantal van C. albicans overspoeld), en met C. albicans morfologie (dwz gist verzen hypha). Schaal bar, 20 urn.
Figuur 3. Grafiek met het aantal C. albicans ingenomen per J774.1 murine macrofagen eind 6 uur fagocytose assays. De gegevens stellen 2 onafhankelijke experimenten. Een totaal van 100 macrofagen werden geteld vanaf 3 velden van elk experiment, wat een totaal van 600 individuele macrofagen.
Figuur 4. Een reeks beelden van een representatief levende cellen videomicroscopie experiment toont een macrofaag (M) en C. albicans (C) voorafgaand aan en tijdens herkenning (A, B) en tijdens en na opname (C, D). C. albicans hyfen blijven groeien binnen de macrofagen (E, F), wat kan resulteren in macrofaag lysis (G). Andere macrofagen worden gerekruteerd voor de site van breuk en poging om de vrijgekomen C. innemen albicans (H). Macrofagen zijn gekleurd met behulp van de rode fluorescerende kleurstof LysoTracker rode DND-99, en C. albicans worden gekleurd met FITC (groen). Merk op dat FITC kleuring wordt gedoofd na C. albicans opname door macrofagen J774.1 (C). Schaal bar, 10 urn.
Discussion
Hier de werkwijze voor het gebruik van levende cellen videomicroscopie om macrofaag fagocytose studie beschreven. Video microscopie biedt meerdere extra lagen met informatie voor analyse. Een belangrijkste voordeel is dat de opname gegevens kunnen worden verkregen (van een experiment) voor elk tijdstip gedurende de 6 uur observatieperiode. Belangrijker beschreven werkwijze maakt differentiële analyse van de verschillende fasen van fagocytose. We hebben bijvoorbeeld aangetoond dat veranderingen in de totale opname van C. albicans glycosylering en morfogenese mutanten door macrofaag cellijnen en primaire macrofagen kan een gevolg zijn van veranderingen in de macrofaag migratie naar doelcellen of de snelheid van afblazen eenmaal cel-cel contact is gevestigd 7 is vastgesteld.
Er zijn een aantal valkuilen bij het uitvoeren van deze experimenten. Ten eerste is het zeer belangrijk om stabiele omgevingsomstandigheden in de gehele experimentele procedure. Dit wordt het best bereikt in een klimaatkamer die is ingesteld op de experimentele omstandigheden enkele uren voordat het experiment. Video kwaliteit is sterk afhankelijk van geavanceerde modules die infrarode lasers gebruiken om automatisch onderhouden sample z-positie, ongeacht mechanische of thermische veranderingen waardoor de noodzaak voor handmatige correcties.
Gezien de aard van de uitgebreide experimenten is belangrijk te beperken blootstelling aan laserlicht en bijbehorende fotobleken en fotoconversie effecten die kunnen worden geminimaliseerd door hoog fluorescente markers die laag belichtingstijden vergemakkelijken. De FITC kleuringsprotocol hier beschreven is snel en betrouwbaar. Als FITC is een zeer lichte en stabiele vlek, lage belichtingstijden nodig zijn en dit maakt FITC ideaal voor langere time-lapse filmpjes. Maar we routinematig gebruik van een verscheidenheid van verschillende doel vlekken, waaronder Calcofluor White en PKH kleurstoffen en gelabeld organismen.
Tijdens dit onderzoek werden beelden opgenomen met een min tussenpozen gedurende 6 uur fagocytose assay. Het interval tussen afbeeldingen kunnen worden aangepast afhankelijk van de werkwijze onderzocht. Bijvoorbeeld kan het interval verlaagd bij het onderzoek snel processen zoals vesiculair transport. De minimale tijdsinterval zal worden beperkt door microscoop en camera specificaties. Er zijn een aantal overwegingen in gedachten te houden bij het aanpassen van timings. Ten eerste, zal het verminderen van de interval tussen snapshots betekent minder punten kunnen worden afgebeeld en de bestandsgrootte zal flink worden verlengd. Integendeel, zal het verhogen van de beeld-interval te veel make van de film verliest continuïteit.
Deze benadering kan worden toegepastin principe aan andere pathogenen en opname van stervende gastheer cellen te bestuderen. Zo hebben we onlangs aangetoond dat beenmerg afgeleide macrofagen van sialoadhesine-deficiënte muizen vertonen sterk verlaagde binding en fagocytose van gesialyleerde Campylobacter jejuni 8. Echter, beoogde omvang is een belangrijke determinant voor de haalbaarheid, zoals beeldanalyse wordt het steeds moeilijker met een vermindering van de doelcel grootte. Geavanceerde beeldanalyse software is essentieel voor een snelle videomicroscopie analyse en dient gepaard met geschikte bio steun voor de generatie van algoritmen migratie van individuele cellen en gehele celpopulaties 7 studieprestaties. Live-cell microscopie video in combinatie met geavanceerde beeldanalyse-software voor de minuut tot minuut analyse van migratie en individuele macrofaag-C.albicans interacties, geeft uniek inzicht in de complexiteit van C. albicans fagocytose door macrophages. Er een enorm potentieel om deze werkwijzen uit te breiden naar andere pathogenen en fagocyten (dendritische cellen, neutrofielen) bestuderen en 3D videomicroscopie ontwikkelen image cel-cel interacties nader of meer fysiologische oppervlakken zoals epitheliale en endotheliale cellagen. Deze techniek maakt deel uit van de volgende generatie hulpmiddelen in de studie van gastheer-pathogeen interacties en zal helpen bij het genereren gedetailleerde ruimtelijke en temporele informatie over een breed scala van dynamische processen.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen. NG is een ontvanger van onbeperkte subsidies voor fundamenteel onderzoek door Gilead Sciences. LE werkt als consultant voor GSK in het begin van de ontwikkeling van geneesmiddelen.
Acknowledgments
LPE is een Schotse Senior Clinical Fellow en erkent de steun van de Chief Scientist Office (SCD/03). Dit werk werd gefinancierd door Wellcome Trust Project Grant aan LPE (089.930). NARG werd gefinancierd door een Wellcome Trust Programme Grant (080088) en een uitrusting Grant (075.470) (voor DeltaVision), en door een FP7-2007 tot +2.013 Grant (GEZONDHEID-F2-2.010 tot 260.338-Allfun). We willen de Universiteit van Aberdeen imaging faciliteit, in het bijzonder Kevin MacKenzie, dank voor nuttige ondersteuning en advies.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Yeast nitrogen base without amino acids | Formedium | CYN0402 | |
| NaOH | Sigma | S5881-500G | |
| Adenine hemisulphate salt | Sigma | A3159-25G | |
| Agar technical (no. 3) | Oxoid | LP0013 | |
| D-glucose | Sigma | G7021-1KG | |
| SC-Ura dropout | Formedium | DSCK102 | |
| FITC | Sigma | F7250-1G | |
| Sodium carbonate | BDH | 301215M | |
| Sodium bicarbonate | BDH | 102475W | |
| PBS | Gibco | 18912-014 | |
| DMEM | Lonza | BE12-614F | |
| FCS | Life Technologies | 10106169 | |
| Penicillin/streptomycin | PAA | P11-010 | |
| L-glutamine | Lonza | BE17-605E | |
| LysoTracker Red DND-99 | Invitrogen | L7528 | |
| 35 mm glass-dishes | PAA | PAA12305160X |
References
- McKenzie, C. G. J., et al. Contribution of Candida albicans cell wall components to recognition by and escape from murine macrophages. Infect. Immun. 78, 1650-1658 (2010).
- Mora-Montes, H. M., et al. Recognition and blocking of innate immunity cells by Candida albicans chitin. Infect. Immun. 79, 1961-1970 (2011).
- Keppler-Ross, S., et al. Recognition of yeast by murine macrophages requires mannan but not glucan. Eukaryot. Cell. 9, 1776-1787 (2010).
- Vijayan, D., et al. Mincle polarizes human monocyte and neutrophil responses to Candida albicans. Immunol. Cell Biol. , (2012).
- Seider, K., et al. The facultative intracellular pathogen Candida glabrata subverts macrophage cytokine production and phagolysosome maturation. J. Immunol. 187, 3072-3086 (2011).
- Sheth, C., et al. Glycosylation status of the C. albicans cell wall affects the efficiency of neutrophil phagocytosis and killing but not cytokine signalling. Med. Mycol. (5), 513-524 (2011).
- Lewis, L. E. Stage specific assessment of Candida albicans phagocytosis by macrophages identifies cell wall composition and morphogenesis as key determinants. PLoS Pathog. 8 (3), e1002578 (2012).
- Klaas, M., et al. Sialoadhesin Promotes Rapid Proinflammatory and Type I Interferon Responses to a Sialylated Pathogen, Campylobacter jejuni. J. Immunol. , In Press (2012).
- Lewis, L. E., et al. Candida albicans infection inhibits macrophage cell division and proliferation. Fungal Genet. Biol. , (2012).
- Bain, J. M., et al. Non-lytic expulsion/exocytosis of Candida albicans from macrophages. Fungal Genet. Biol. , (2012).
- Mora-Montes, H., et al. Interactions between macrophages and cell wall oligosaccharides of Candida albicans. Methods Mol. Biol. 845, 247-260 (2012).
- McPhillips, K., et al. Assessment of apoptotic cell phagocytosis by macrophages. Methods Mol. Biol. 559, 247-256 (2009).
- Erwig, L. -P., et al. Differential regulation of phagosome maturation in macrophages and dendritic cells mediated by Rho GTPases and ezrin-radixin-moesin (ERM) proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103 (34), 12825-12830 (2006).
