Summary
Descrevemos métodos para live-célula vídeo de microscopia
Abstract
Apuramento fagocítica de fungos patogénicos e microrganismos, de modo mais geral, podem ser considerados para consistir de quatro fases distintas: (i) a migração dos fagócitos para o local onde estão localizados os patógenos, (ii) reconhecimento do agente patogénico padrões moleculares associados (PAMPs) através do padrão receptores de reconhecimento (PRRs), (iii) imersão de microorganismos ligados à membrana celular dos fagócitos, e (iv) de processamento de células englobadas dentro de fagossomos vencimento e digestão da partícula ingerida. Estudos que avaliam a fagocitose na sua totalidade são informativas 1, 2, 3, 4, 5, mas são limitados na medida em que normalmente não se dividir o processo em imersão, migração e maturação do fagossoma, o que pode ser afectada diferencialmente. Além disso, estes estudos avaliar a absorção, como um evento único, e não como um processo dinâmico contínuo. Desenvolvemos recentemente tecnologias avançadas vivo de células de imagem, e combinaram estes com a análise funcional de ambos genéticacélulas de patógenos e de acolhimento para criar uma plataforma inter-disciplinar para a análise da função da célula imune inata e patogenicidade. Esses estudos têm revelado novos aspectos de fagocitose, que só poderia ser observados usando análise temporal sistemática das interações celulares e moleculares entre fagócitos humanos e fungos e microorganismos infecciosos em geral. Por exemplo, podemos ter começado a definir o seguinte: (a) os componentes da superfície da célula necessárias para cada fase do processo de imersão, o reconhecimento ea morte de células fúngicas 1, 6, 7, 8, (b) a geometria da superfície como influencia a eficiência de absorção de macrófagos e morte de células de levedura e hifa 7, e (c) como imersão leva a alterações do ciclo celular e no comportamento dos macrófagos 9, 10.
Em contraste com a de um único ponto de tempo de instantâneos, live-célula microscopia de vídeo que permite uma grande variedade de células hospedeiras e organismos patogénicos para ser estudado como coseqüências ntinuous em períodos de tempo longos, fornecendo informação espacial e temporal em uma ampla gama de processos dinâmicos, incluindo a migração celular, replicação e tráfico vesicular. Aqui descrevemos em detalhes como preparar hospedeiro e células fúngicas, e para realizar os experimentos de microscopia de vídeo. Estes métodos podem fornecer um guia para estudos futuros com outros fagócitos e microorganismos.
Protocol
1. C. albicans condições de crescimento e
- Preparar as placas de agar SC-Ura, adicionando 6,9 g de base azotada de levedura sem aminoácidos, 1 ml de NaOH 1 M, 10 mL de 1% (w / v) de sal hemissulfato de adenina e 20 g de agar técnica (previamente descrito em detalhe em 11). Faça-se o volume para 900 ml com água destilada H 2 O. Autoclave, permita ágar arrefecer, mas não o suficiente para solidificar, e depois adicionar 50 ml estéril de 40% de D-glucose e 50 ml estéril a 4% SC-Ura dropout sob condições assépticas. Misturar, verte-se sobre placas de Petri e deixar placas de ágar arrefecer e solidificar. Loja de placas de agar a 5 ° C até à utilização.
- Streak C. albicans serotipo A, estirpe CAI4 + CIp10 de estoques de glicerol armazenada a -80 ° C para SC-Ura placa de ágar.
- Incubar a placa a 30 ° C até as colónias forma e armazenamento a 5 ° C.
- Uma cultura única C. albicans colónia em 5 ml de meio SC-Ura (a receita como em 1.1, mas sem agar técnica) e incubar durante a noite a 30° C, 200 rpm, para gerar fase estacionária C. albicans.
2. C. albicans coloração com isotiocianato de fluoresceína (FITC)
- Adicionar 10 ul C. albicans cultura durante a noite a 990 ul de PBS (pH 7,4) e realizar uma contagem de células utilizando um hemocitómetro.
- Para auxiliar a visualização de C. albicans durante ensaios de fagocitose, mancha 1 × 10 8 C. albicans, utilizando 1 mg / ml de FITC em 0,05 M de tampão de carbonato-bicarbonato de sódio (pH 9,6) durante 10 min à temperatura ambiente no escuro.
- Para remover FITC desvinculado, lavar C. albicans em 1 ml 1 x PBS, centrifugação a 3000 × g durante 5 minutos, remover o sobrenadante e ressuspender o pellet em 1 ml de 1 x PBS. Repita 3 vezes.
- Ressuspender o pellet em 1 x 10 6 células / ml em 1 x PBS.
3. Preparação da Linha Celular J774.1 Rato Macrophage
- Manter J774.1 macrófagos no tecido 75 cm 2frascos de cultura em meio DMEM suplementado com 10% (v / v) de soro fetal de vitelo (FCS), 200 U / ml de penicilina / estreptomicina e 2 mM de L-glutamina, a 37 ° C com 5% de CO 2. A preparação de macrófagos primários são descritos noutro documento em detalhe 12, 13.
- Raspe J774.1 células do frasco de cultura de tecido e transferir para um tubo Falcon de 50 ml. Centrifugar a 600 xg durante 5 min para obter um pellet de células.
- Remover o sobrenadante e ressuspender o pellet em 10 ml de pré-aquecida meio DMEM suplementado. Contar as células utilizando um hemocitómetro e placa 1 x 10 6 J774.1 macrófagos em 2 ml de meio DMEM suplementado em um prato de 35 milímetros de imagens à base de vidro. Incubar durante a noite a 37 ° C, 5% CO 2.
- Antes da imagiologia, substitua meio suplementado com 2 ml de DMEM pré-aquecido suplementado CO meio 2-independente (com 10% (v / v) de soro fetal de vitelo (FCS), 200 U / ml de penicilina / estreptomicina e 2 mM de L-glutamina) contendo 1 mM Lyso Tracker Red DND-99.
4. Vídeo ao vivo celular Ensaio Fagocitose Microscopia
- A escolha do microscópio dependerá do que estiver disponível localmente, mas a configuração microscópio terá de incluir uma fase invertida, uma câmara com ambiente aquecido a 37 ° C e de excitação / emissão de filtros para as manchas escolhidas (FITC e TRITC).
- Ligar o aquecedor do microscópio antes da experiência e permitir tempo suficiente para a câmara de controlo do ambiente aquecer até 37 ° C. O tempo necessário para que a temperatura da câmara para estabilizar pode variar para diferentes configurações do microscópio.
- Ligue o microscópio e computador, e carregar o software de imagem. Monte o prato de imagens no palco microscópio e ajustar o foco para encontrar os J774.1 macrófagos. Optimizar o aspecto das imagens TRITC e DIC, ajustando a percentagem de luz transmitida e tempos de exposição.
- Retire o prato de imagem e adicionar 3 × 10 6 FITC manchado de C. albicans a tele prato. Anote o tempo que C. albicans é adicionada ao prato. Retorne o prato para o palco e otimizar a aparência das imagens FITC, se necessário. Configurar uma lista de pontos, se necessário.
- Começar de imagem quando todos os pontos estão em foco e os canais são otimizados. Capturar imagens com FITC, TRITC e DIC a cada minuto durante 6 horas.
Representative Results
Aqui nós mostramos resultados representativos para C. albicans absorção por uma linha de células de macrófagos de murino J774.1 durante 6 horas uma experiência microscopia vivo de células de vídeo. Figura 1 é um representante vivo de células filme microscopia video, mostrando a fagocitose de C. albicans por murinos J774.1 macrófagos. Live-célula microscopia de vídeo permite a internalização de C. albicans a ser visualizados sem a necessidade de se manchar Candida externa. No entanto, durante estas experiências, C. albicans foi corada usando o corante sensível ao pH com FITC (verde), o que é extinta durante a acidificação do fagossoma macrófago, e facilita a confirmação de que Candida foi internalizado (Figura 1). Para visualização auxílio adicional de C. ingerida albicans, macrófagos foram corados com o corante vermelho fluorescente Lyso Tracker red DND-99, os compartimentos que cora ácidos e serve como um marcador não específico de maturação do fagossoma.A Figura 2 é uma imagem fixa a partir de uma experiência de microscopia vivo de células de vídeo e ilustra a variação do número de C. albicans ingeridos por macrófagos J774.1 individuais. Nesta experiência, 82% de macrófagos J774.1 engolida pelo menos um C. albicans de células no final do ensaio de fagocitose 6 hr. Na Figura 3, o número de internalizada C. albicans células por macrófago é relatado. O número médio de C. albicans assumidas por macrófagos é de 3,4, mas curiosamente os macrófagos podem ingerir até 16 células fúngicas. Figura 4 é uma sequência de imagens estáticas de um representante experiência microscopia live-célula de vídeo mostrando um macrófago fagocitando C. albicans células, hifa de crescimento com o macrófago e lise de macrófagos. finalmente Figura 4 mostra que a microscopia de vídeo permite a análise de eventos após imersão de células-alvo, ou seja, dados podem ser gerados para o killing de macrófagos por C. albicans hifas em relação ao número e morfogénese de células alvo ingeridas, e como morte de macrófagos refere-se a maturação do fagossoma, que pode ser estudado em tempo real.
Figura 1. Live-célula filme microscopia vídeo mostrando a fagocitose de C. albicans por murinos J774.1 macrófagos. Os macrófagos são coradas utilizando o corante vermelho fluorescente Lyso Tracker red DND-99 e C. albicans são corados com FITC (verde). Macrófagos e C. albicans foram co-cultivados durante um período de 6 horas a 37 ° C em CO 2 completo independente meio. As imagens foram capturadas em intervalos de 1 min para 6 horas. Os macrófagos podem ser vistos estabelecer contacto célula-célula com C. albicans, que é então seguida pela absorção de C. albicans em fagossomas macrófagos. As setas indicam a C. albicans antes da imersão por macrófagos J774.1. Este vídeo mostra também que a fluorescência FITC é quenched imersão seguinte de C. albicans. Barra de escala, 10 um. Clique aqui para ver filme .
Figura 2. Representante microscopia de vídeo ao vivo de células variação da imagem ainda mostra o número de C.albicans engolido por macrófagos individuais. Os macrófagos (coradas utilizando Lyso Tracker red DND-99) foram co-cultivados com FITC-stained C. albicans (verde). Há uma variação do número de C. albicans engolida (um número ao lado de uma seta indica o número de C. albicans engolida), e em C. albicans morfologia (ou seja, versos levedura hifa). Barra de escala, 20 m.
Figura 3. Gráfico mostrando o número de C. albicans ingeridos por macrófagos murinos J774.1 no final de 6 ensaios de fagocitose hr. Os dados representam dois experimentos independentes. Um total de 100 macrófagos foram contados a partir de 3 campos de cada experiência, dando um total de 600 macrófagos individuais.
Figura 4. Uma série de imagens a partir de um experimento representativo microscopia vivo de células vídeo mostrando um macrófago (M) e C. albicans (C), antes e durante o reconhecimento de (A, B), e, durante e após a absorção (C, D). C. albicans hifas continuar a crescer dentro do macrófago (E, F), o que pode resultar na lise de macrófagos (G). Outros macrófagos são recrutadas para o local de ruptura e tentam ingerir o C. libertado albicans (H). Os macrófagos são coradas utilizando o corante vermelho fluorescente LysoTracker vermelho DND-99 e C. albicans são corados com FITC (verde). Note-se que a coloração é parada após FITC C. albicans absorção por macrófagos J774.1 (C). Barra de escala, 10 um.
Discussion
Aqui, o método para a utilização de células-vivo microscopia vídeo para estudar a fagocitose de macrófagos é descrito. Microscopia de vídeo oferece múltiplas camadas adicionais de informações para análise. Uma vantagem básica é que os dados de absorção pode ser gerada (a partir de uma única experiência) para qualquer ponto no tempo ao longo do período de observação de 6 horas. Mais importante, o método descrito permite a análise diferencial das fases individuais de fagocitose. Nós temos, por exemplo, mostra que as mudanças na absorção global da C. albicans glicosilação e mutantes morfogênese por linhas celulares de macrófagos e macrófagos primários pode ser uma consequência de mudanças na migração de macrófagos em relação às células-alvo ou de taxa de uma vez a imersão contacto célula-célula é estabelecida 7.
Há uma série de armadilhas a evitar quando condução desses experimentos. Primeiro, é muito importante para garantir a estabilidade das condições ambientais durante o procedimento experimentalDure. Este é o melhor alcançado em uma câmara ambiental que está definida para as condições experimentais várias horas antes de iniciar o experimento. A qualidade do vídeo é altamente dependente de módulos sofisticados que usam lasers infravermelhos para manter automaticamente a amostra z posição independentemente das alterações mecânicas ou térmicas, eliminando assim a necessidade de correções de foco manual.
Dada a natureza prolongada das experiências, é importante para limitar a exposição à luz do laser e efeitos associados fotobranqueamento e fotoconversão, que podem ser minimizados através da utilização de marcadores altamente fluorescentes, o que facilita baixos tempos de exposição. O protocolo de coloração FITC descrito aqui é rápida e fiável. Como FITC é um muito brilhante e estável de manchas, os tempos de exposição baixos são necessários e isso torna ideal FITC por longos time-lapse filmes. No entanto, habitualmente utilizam uma variedade de manchas alvo diferentes, incluindo calcofluor white e corantes PKH, bem como organismos marcados.
Durante este estudo, as imagens foram captadas a intervalos de 1 min ao longo de um ensaio de fagocitose 6 hr. O intervalo entre as imagens podem ser ajustadas de acordo com o processo sob investigação. Por exemplo, o intervalo pode ser diminuído quando se investiga processos rápidos como o tráfico vesicular. O intervalo de tempo mínimo será limitada pelas especificações de microscópio e camera. Há algumas considerações a ter em conta quando se ajusta horários. Primeiro, diminuindo o intervalo entre os instantâneos vai significar menos pontos podem ser visualizados e tamanho do arquivo será aumentado consideravelmente. Pelo contrário, o aumento do intervalo de imagem muito irá fazer o filme perde a continuidade.
Esta abordagem pode ser aplicadaem princípio, para estudar outros patogénios e absorção de morte de células hospedeiras. Por exemplo, recentemente demonstrado que os macrófagos de medula óssea derivadas de camundongos deficientes sialoadhesin exibem muito reduzida de ligação e fagocitose de sialilado Campylobacter jejuni 8. No entanto, o tamanho do alvo é um importante determinante para a viabilidade, tal como a análise de imagens torna-se cada vez mais difícil com a redução do tamanho da célula-alvo. Software de análise sofisticada imagem é essencial para a análise rápida de vídeo microscopia, e isso deve ser acompanhado de suporte de bioinformática adequado para facilitar a geração de algoritmos para estudar a migração de células individuais e populações de células inteiras 7. Live-célula microscopia de vídeo em combinação com um sofisticado software de análise de imagem para a análise minuto-a-minuto da migração e individuais macrófagos C.albicans interações, fornece uma visão única sobre a complexidade da C. albicans fagocitose por macrophages. Há um enorme potencial para expandir estes métodos para estudar outros patogénios e fagócitos (células dendríticas, neutrófilos) e desenvolver a microscopia de vídeo 3D de imagem interacções célula-célula em maior detalhe ou em mais superfícies fisiológicos, tais como camadas de células epiteliais e endoteliais. Esta técnica é parte da próxima geração de ferramentas no estudo da interação patógeno-hospedeiro e vai ajudar a gerar informações detalhadas espacial e temporal em uma ampla gama de processos dinâmicos.
Disclosures
Os autores não têm nada a revelar. NG é um receptor de subvenções de apoio irrestrito para a pesquisa básica pela Gilead Sciences. LE trabalha como consultor para a GSK no desenvolvimento de drogas mais cedo.
Acknowledgments
LPE é Senior Fellow escocês Clínica e reconhece o apoio do Escritório Cientista Chefe (SCD/03). Este trabalho foi financiado pelo Wellcome Trust Projeto Grant para EFL (089.930). Narg foi financiado pelo Wellcome Trust um Programa Grant (080.088) e um Grant equipamento (075.470) (para DeltaVision), e por um Grant FP7-2007-2013 (SAÚDE-F2-2010-260338-ALLFUN). Gostaríamos de agradecer à Universidade de Aberdeen instalação de imagem, em particular, Kevin MacKenzie, de apoio e conselhos úteis.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Yeast nitrogen base without amino acids | Formedium | CYN0402 | |
| NaOH | Sigma | S5881-500G | |
| Adenine hemisulphate salt | Sigma | A3159-25G | |
| Agar technical (no. 3) | Oxoid | LP0013 | |
| D-glucose | Sigma | G7021-1KG | |
| SC-Ura dropout | Formedium | DSCK102 | |
| FITC | Sigma | F7250-1G | |
| Sodium carbonate | BDH | 301215M | |
| Sodium bicarbonate | BDH | 102475W | |
| PBS | Gibco | 18912-014 | |
| DMEM | Lonza | BE12-614F | |
| FCS | Life Technologies | 10106169 | |
| Penicillin/streptomycin | PAA | P11-010 | |
| L-glutamine | Lonza | BE17-605E | |
| LysoTracker Red DND-99 | Invitrogen | L7528 | |
| 35 mm glass-dishes | PAA | PAA12305160X |
References
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