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Neuroscience

Ex utero elettroporazione e Espianti intero emisfero: un semplice metodo sperimentale per gli studi del primo sviluppo corticale

Published: April 3, 2013 doi: 10.3791/50271
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1
1Department of Neuroscience and Physiology, SUNY Upstate Medical University
* These authors contributed equally

Summary

Questo protocollo descrive un procedimento di espianto che coinvolge

Abstract

Sviluppo corticale comporta complesse interazioni tra neuroni e non neuronali elementi, comprese le cellule precursori, i vasi sanguigni, le meningi e relativi matrice extracellulare. Perché offrire un ambiente appropriato organotipica, espianti fetta corticali sono spesso usati per studiare le interazioni che controllano la differenziazione neuronale e lo sviluppo. Anche se utile, il modello di espianto fetta possono soffrire di inconvenienti tra cui aberrante laminazione cellulare e la migrazione. Qui riportiamo un intero sistema cerebrale espianto emisfero per gli studi di primo sviluppo corticale che è più facile da preparare rispetto fettine corticali e spettacoli coerenti migrazione organotipica e laminazione. In questo sistema modello, laminazione precoce e modelli di migrazione procedere normalmente per un periodo di due giorni in vitro, compreso il periodo della scissione preplate, durante il quale prospettiva strato corticale sei forme. Abbiamo poi sviluppato un ex elettroporazione in utero (EUEP)approccio che ottiene un successo ~ 80% in termini di orientamento espressione GFP ai neuroni in via di sviluppo nella corteccia dorsale mediale.

L'intero modello di espianto emisfero corticale rende sviluppo precoce accessibili per l'elettroporazione, l'intervento farmacologico e approcci di imaging dal vivo. Questo metodo evita l'intervento chirurgico sopravvivenza richiesto in utero elettroporazione (IUEP) approcci, migliorando sia la trasfezione e areale coerenza targeting. Questo metodo faciliterà studi sperimentali neuronale proliferazione, migrazione e differenziazione.

Introduction

Le forme di mammifero attraverso la corteccia cerebrale concertata proliferazione, migrazione e differenziazione dei neuroni successivamente generati. Ogni neurone è nato nella zona ventricolare (VZ) e migra dal VZ nella zona intermedia (IZ), formando la piastra corticale (CP) 1. Come passano attraverso diversi domini corticali, i neuroni migrano visualizzare molteplici modalità di migrazione 2,3 che dipendono dall'ambiente extracellulare e altri elementi cellulari (es glia radiale) all'interno del tessuto di sviluppo. Neuroni corticali quindi arrestare migrazione in alto della piastra di formatura corticale nei processi coincidenti arresto migrazione neuronale e 4 dendritogenesis.

Sviluppo corticale è iniziata tra i giorni embrionali 11-13 (E11-13) 5 tramite la costituzione dello strato primordiale plessiforme 6 o preplate (PP), uno strato di neuroni pionieri che sovrasta il VZ. Potenzialestrato 6 neuroni corticali (cioè i neuroni corticali prima nati nel VZ) poi orientare la loro somata in un modello stereotipato e fondersi in uno strato distinto all'interno del PP 7. Questi eventi dividere il preplate in un superficiale marginale (futuro strato corticale 1) e una zona profonda, quest'ultimo composto da cellule a piastra (strato corticale transitoria 7). Questo processo, chiamato scissione preplate, è un evento fondamentale per la crescita futura della corteccia cerebrale 8.

Molte mutazioni genetiche sono state identificate che inficiano vari aspetti dello sviluppo corticale 9. Sviluppo corticale possono essere influenzate negativamente da esposizione a sostanze tossiche ingerite come la cocaina 10 e alcool 11. Perché malformazioni corticali che si presentano durante lo sviluppo sono tra i probabili disturbi neurologici (autismo es. schizofrenia), indagini empiriche delle perturbazioni allo sviluppo corticale sono inerentily importante. E 'quindi di notevole importanza per stabilire approcci per studiare lo sviluppo corticale che consentono analisi rapide di effetti genetici o tossina, ma che conserva anche le possibili interazioni tra i neuroni di differenziazione, altri tipi di cellule e la matrice extracellulare (ECM) durante questo primo periodo di sviluppo del cervello 12 .

Espianti fetta 13 hanno fornito un tale sistema e sono stati ampiamente utilizzati per saggiare sviluppo corticale neuroni 14-16. Tuttavia, i saggi fetta possono soffrire l'inconveniente che la migrazione neuronale e laminazione può essere anormale 17 forse a causa di danni alle cellule meningee che circondano il cervello in via di sviluppo e ancorare il radiali gliali patibolo. Come le fibre radiali gliali sono un importante substrato per la migrazione dei neuroni corticali 18 interruzione della lamina basale mediante tranciatura può interrompere localmente radiale architettura gliali e portare a alterata migrazione corticale. Inoltre la slisuperfici ced di espianti fornisce una regione di cellule morte che possono alterare la normale composizione della ECM in queste aree.

Approcci più recenti hanno concentrato la loro analisi su cellule trova nel cuore della slice che sono circondati da adeguati tipi di cellule sane e ECM. Tuttavia, in alcuni casi, questi nuovi approcci possono richiedere che l'originale fetta spessa colta essere crio-sezionato o paraffina sezionata dopo fissazione in modo che l'interno relativamente normale della fetta è reso disponibile per l'analisi 19-21. Sia il vibratomo originale sezionamento per preparare le fette diretta cultura nonché la successiva criosezionamento fette fissi per analisi richiede cura e sforzo per questi saggi lavorare.

Per fornire un semplice, approccio complementare allo studio dei primi stadi dello sviluppo corticale, abbiamo modificato una fetta approcci esistenti da 13 a facilitare gli studi di primo sviluppo corticale. Abbiamo sviluppato un whole espianto emisfero modello simile a un modello esistente E14 emisfero che ha coinvolto le culture si stringono a 65 rotazioni al minuto e consentito la crescita organotipica per 16-18 ore 22,23. Nel nostro approccio, espianti emisfero interi sono posti sulla membrana semipermeabile 13 con in un'atmosfera di cultura ossigeno 21,24 estendere organotipica crescita corticale per 48 ore. Questo approccio consente inoltre di elettroporazione coerente di sviluppo neuroni corticali. Gli embrioni vengono rimossi dall'utero e elettroporate introdurre DNA plasmidico e telencefalo viene sezionato. Ogni emisfero è isolato e posizionato lato mediale su un collagene rivestita filtro. L'espianto viene poi coltivata per un periodo di 48 ore, un periodo che comprende splitting preplate 8. Durante il periodo di coltura, L6 neuroni sviluppano da precursore differenziato neurone 25, correttamente posizionata all'interno della piastra corticale. Durante questo periodo in via di svilupponeurone è circondato dalla ECM appropriata e tipi cellulari che confrontano la cella corrispondente in vivo. Questo sistema si è già dimostrato utile nel decifrare gli eventi cellulari che stanno alla base tossicità dell'etanolo 26 strato 6 formazione e preplate scissione 7,25.

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Protocol

1. Elettroporazioni utero Ex con Expression Proteina Fluorescente Verde Plasmid

  1. Soluzioni di iniezione di DNA plasmidici sono preparati con CAG-eGFP DNA 27 diluito alla concentrazione finale di lavoro di 0,33 mg / ml in DDH 2 O. Qiagen Endo-Free Maxi-Preps sono utilizzati per purificare il plasmide da batteri trasformati. Veloce colorante verde a ~ 0,02% (w / v finale) viene aggiunto alla soluzione di DNA come tracciante iniezione.
  2. Per preparare l'area chirurgica, spruzzare banco e la fase microscopio da dissezione con una soluzione di etanolo al 70% e asciugare. Spruzzare forbici chirurgiche e pinze con il 70% di etanolo prima della dissezione e asciugare.
  3. Timed incinte svizzeri / Webster dighe sono sacrificati su E13 da trasferire in una camera riempita con CO 2 da una bombola sotto pressione e la diga è monitorato fino a quando tutto il movimento si è fermato per almeno 1 min. Dopo il sacrificio da CO 2 inalazione gli embrioni vengono rimossi dall'utero e collocati inuna capsula di Petri contenente 10 centimetri ghiacciata Hanks soluzione salina bilanciata (HBSS).
  4. Attenzione sezionare ogni embrione dalle membrane che circondano extraembrionali e tenere in ghiaccio-freddo HBSS.
  5. Trasferire ogni embrione singolarmente per un piatto secondo cm 10 Petri contenente HBSS freddo. Utilizzare una siringa Hamilton da iniettare 2-3 microlitri della miscela DNA veloce verde nel ventricolo dell'emisfero cerebrale sinistro, avendo cura di iniettare in una zona corticale spazialmente separata dalla zona corticale per analisi future.
  6. Per electroporate, tenere l'embrione delicatamente con una pinza e leggermente posizionare la paletta positiva dell'elettrodo pinzetta sulla linea mediana dorsale della testa e leggermente posizionare la pala negativo sotto il mento embrione. Elettroporazioni sono conseguiti con un elettroporatore BTX830 programmato per fornire cinque impulsi 30 V della durata di 50 msec, separati da 950 msec. Queste impostazioni sono per il modello BTX830. Altri sistemi possono essere utilizzati secondo INSTRUCTIO produttorens.

2. Tutta la Emisfero Preparazione Espianto

  1. Dopo elettroporazione gli embrioni sono posti di nuovo in gelide HBSS. Il cervello viene rimosso con due N ° 5 pinze gioielliere per rimuovere la pelle e il cranio cartilagineo dalla testa dell'embrione. Una pinza viene quindi fatto scivolare sotto il cervello per rimuovere il cervello intatto dal cranio. L'emisfero elettroporata (sinistra) viene sezionato dal cervello e allegata mesencefalo tessuto viene rimosso. In tutta la procedura di dissezione cura è presa per non danneggiare le meningi sovrastanti l'emisfero sinistro corticale.
  2. Una volta sezionato ogni embrione viene trasferito in HBSS utilizzando una pipetta con un taglio 1 punta ml pipetta. L'emisfero viene espulsa cautamente su un inserto rivestito cultura collagene. Fino a sei espianti emisfero sono disposti lato mediale verso il basso ogni inserto mm 24. Una volta disposti, HBSS eccesso viene rimosso dalla inserto e l'inserto viene quindi posto in uno ben 35 millimetri di un piatto 6 pozzetti. Il pozzo contiene exactly 2,7 ​​ml di media: DMEM-F12 supporti contenenti Glutamax e integrato con il 2% B-27, 1% e l'1% G5 Penicillina-Strep. Alcune gocce di supporti dal pozzo può essere pipettati sopra l'espianto, ma non aggiungere supporti in eccesso rispetto all'originale 2,7 ml per pozzetto.
  3. Una volta che gli espianti sono stati collocati su filtri di collagene il piatto ben 6 contenente gli espianti è collocato in una Rothenberg Billups (BR) camera (che contiene anche un piatto umidificazione di acqua). A 95% / 5% di ossigeno / CO 2 miscela di gas viene infusa nella camera per almeno 1 minuto prima di sigillare la camera di valvola e scollegamento del 95% / 5% di ossigeno / CO 2 tubo di alimentazione del gas. La camera di BR viene quindi posto in un 37 ° C di coltura tissutale incubatore per il resto del periodo di coltura, 1-2 DIV.

3. Fissazione del tessuto Espianto di Istologia

  1. In una cappa aspirante preparare la soluzione di fissazione Pagano dal primo solubilizzante 8 g di paraformaldeide in 100 ml di preriscaldato (~ 80 & deg; C) DDH 2 O. Aggiungere 1-3 gocce di NaOH concentrati per promuovere la solubilizzazione e mescolare delicatamente. Una volta solubilizzato miscelare la soluzione di paraformaldeide 8% 1:1 con una soluzione 500 mM di saccarosio, 100 mM Hepes, pH 7,4, 50 mM MgCl 2, 5 mM KCl per una concentrazione finale di 4% paraformaldeide in saccarosio 250 mM Hepes 50 mM , 25 mM MgCl2, 2,5 mM KCl, pH 7,4.
  2. Per fissare gli espianti riscaldare la soluzione correzione Pagano a 37 ° C. Rimuovere rapidamente la maggior parte dei mezzi di comunicazione DMEM/F12 da ogni cultura bene e aggiungere 5 ml di Fix Pagano in ciascun pozzetto di espianti. Assicurarsi di coprire ogni espianto completamente in correzione. Fix per 1 ora a temperatura ambiente. Non rimuovere espianti dal filtro prima di 1 ora di fissazione.
  3. Dopo fissazione rimuovere la soluzione di fix Pagano e sostituirlo con soluzione Pagano senza correzione (250 mM saccarosio, 50 mM Hepes 25 mM MgCl2, 2,5 mM KCl, pH 7,4). Aggiungere poche gocce di azide di sodio al 10% e conservare a 4 ° C fino incorporamento.

4. Embedding e Sectioning per Istologia

  1. Preparare una soluzione al 10% di gelatina pelle di vitello solubilizzando 10 g di gelatina pelle di vitello in 100 ml di acqua calda (55-60 ° C). Posizionare soluzione di gelatina su una piastra calda regolata a 60 ° C e agitare periodicamente fino solubilizzato.
  2. Versare circa 10 ml di soluzione al 10% di gelatina sul fondo di una capsula Petri da 10 cm e lasciare 30 min a solidificare. Questo formerà un "pad" per l'incorporamento degli espianti. Queste pastiglie possono essere giorni preparati in anticipo e conservati a 4 ° C. Usare un righello per disegnare una griglia sul fondo della scatola di Petri e trasferire espianti individuali in ogni casella della griglia. Rimuovere residui di soluzione di Pagano e l'utilizzo di una pipetta, coprire ogni espianto con caldo soluzione al 10% di gelatina e lasciare solidificare. Riprendere lenta aggiunta di soluzione di gelatina finché ogni espianto è completamente circondato da gelatina, facendo attenzione a non fondere il pad con l'aggiunta di troppo caldo gelatina in una volta. Consentire la gelatina indurire per ~ 1 ora. Una volta indurito il indivigoli espianti possono essere tagliati in piccoli blocchi di gelatina. I blocchi vengono poi post-fissati in Pagano fissare per 24-48 ore prima del sezionamento con un vibratomo.
  3. Espianti in blocchi gelatina sono posizionati bulbo olfattivo e sezionata nel piano coronale a 100 micron di spessore. Le sezioni vengono raccolti e conservati in PBS + sodio azide 0,1% a 4 ° C fino al procedimento immunoistochimica.
  4. Rilevamento immunoistochimico viene eseguita trasferendo sezioni in una piastra a 24 pozzetti (2-3 sezioni per pozzetto). Primo blocco anticorpo non specifico legame aggiungendo 0,5 ml + B PBST (PBS + 0,5% Triton X 100 e 2% BSA) in ogni pozzetto, incubare 1 ora agitando delicatamente. L'anticorpo primario viene quindi diluito in PBST + B e 0,4 ml per pozzetto viene aggiunto incubazione per tutta la notte a RT. Il primario è lavato con PBS 3X lava per almeno 10 minuti ciascuna. L'anticorpo secondario e 2 ug / ml Hoechst 33342 nucleare macchia vengono quindi diluite in PBST + B ed i campioni vengono incubati per 2 ore a RTagitando delicatamente. Tre lavaggi con PBS (10 minuti ciascuna) vengono eseguite e quindi le sezioni sono montati su vetrini con un 90% di glicerolo 50 mM Tris, pH 7,4, mezzi di montaggio.

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Representative Results

Il roditore embrionale corteccia presenta un gradiente trasversale neurogenetica per tutto il periodo di sviluppo, in modo tale che neocorteccia laterale è di circa 1 giorno in più maturo di dorsale mediale neocorteccia 28. Il grosso strato 6 neuroni sono così generata (cioè esporre loro finale fase S) sulla E12 in corticale laterale (anche chiamato Campo 40 5) e alla E13 nella corteccia dorsale mediale (anche chiamato Campo 1 5). Splitting Preplate inizia circa 1 giorno dopo Layer 6 generazione neurone e quindi viene avviata nella corticale laterale sulla E13 e la corteccia dorsale sulla E14. Per studiare scissione preplate e l'inizio dello sviluppo corticale, abbiamo modificato un test espianto fetta 21,24 in modo tale che tutta la emisferi cerebrali sono stati coltivati ​​in genere da E13 a E15 (Figura 1).

Abbiamo testato la fattibilità della tecnica di espianto corticale esaminando la crescita degli espianti in tutto l'emisfero derived da Tg (Eomes :: eGFP) topi GSAT (Figura 2). Questo ceppo di topi contiene un transgene che riporta i neuroni immaturi della linea eccitatorio corticale 7,29,30. Espianti emisfero corticali sono stati preparati a E13, in un punto di tempo prima preplate scissione nella neocorteccia dorsale (Figura 2A). Espianti corticali della stessa cucciolata erano goccia fissato sequenzialmente su un periodo di 2 DIV e trasformati per la successiva analisi istologica. Al punto iniziale, tempo di analisi (DIV 0), la suddivisione preplate non si è ancora verificato nel campo 1 (neocorteccia dorsale, figure 2A, 2E). Entro il 1 ° DIV il CP è evidente (Figure 2B, 2C, 2F, 2G), e continua a crescere fino a 2 DIV (figure 2D, 2H). Così gli espianti coltivati ​​tutto l'emisfero inizialmente a supporto E13 per due giorni la maturazione della corteccia cerebrale e cattura scissione preplate nella neocorteccia dorsale.

Per confermare la normasviluppo al istologica nella neocorteccia dorsale, abbiamo immunostained due espianti DIV per condroitina solfato proteoglicani (CSPG), una componente della matrice extracellulare, che è anche un indicatore stabilito del PP e dei suoi derivati ​​la MZ e SP 8,31,32. Immunocolorazione per CSPG rivela due bande di CSPG immunoreattività nella corteccia dorsale indica splitting appropriata del PP in MZ e SP durante il periodo di coltura in vitro (Figure 3A-3C). Il PP è diviso da L6 neuroni corticali che sono noti per esprimere i fattori di trascrizione e Ctip2 Tbr1 7,33,34. Il modello immunocolorazione di questi marcatori (Figure 3D-3F, 3G-I, rispettivamente) conferma l'espressione appropriata di questi fattori di trascrizione della CP di nuova formazione. L'insieme di queste analisi confermano organotipica prime fasi dello sviluppo corticale nelle espianti tutto l'emisfero.

In utero elettroporazioni sono stati ampiamente utilizzatiper saggiare la funzione del gene cellula autonoma nello sviluppo corticale 35. Abbiamo quindi verificato se l'elettroporazione potrebbe con successo trasfettare neuroni l'intero modello espianto emisfero. Ventricolo sinistro del intatte E13 embrioni sono stati iniettati con 0,33 mg / ml CAG-GFP plasmide e elettroporate (vedi Metodi) per introdurre il DNA plasmidico nei precursori neuronali che la linea del ventricolo laterale (Figura 1A). Dopo 2 DIV gli espianti sono state ritirate fissa e sezionato per l'analisi istologica. A questo punto nel tempo, le cellule esprimenti GFP sono stati osservati in tutte le zone corticali attraverso la parete cerebrale (figure 4A-4C). GFP potrebbe essere osservata da precursori neuronali nel VZ mentre cellule esprimenti GFP intensi sono stati osservati nel IZ e CP. Soprattutto, numerosi GFP + neuroni sono stati osservati nella parte superiore del CP formatura con dendriti e assoni emergenti. Le cellule hanno formato uno strato discreto all'interfaccia tra il CP e MZ indicating arresto di migrazione e di laminazione (Figure 4A-4C, frecce). I dendriti esteso nel MZ mentre corticofugal assoni si estendono sotto il CP e nella IZ (Figure 4A-4C e 5, Vedi anche S1 Film supplementari). Qui di seguito le cellule di differenziazione sono GFP + cellule in stati diversi di maturità, tra i neuroni con una morfologia bipolare, giustapposti a fibre radiali gliali e sotto di loro, i neuroni multipolari in IZ (figure 4D-4F). Inoltre, i dendriti si osservano estende nel MZ dove la proteina Reelin ECM è opportunamente immunolocalizzate (figure 4I-4G). Le condizioni di elettroporazione e di espianto quindi permettere il normale sviluppo dei neuroni corticali attraverso le fasi di precursore di migrazione neurone a neurone immaturo differenziazione.

Al momento della elettroporazione (E13) 100% dei neuroni prodotti dalle VZ dorsali neocorticali L6 sono neuroni, i neuroniche ha diviso il PP 5. Elettroporazione successo richiede che costrutti essere introdotte neuroni durante l'hr 6 immediatamente prima o durante la fase M del ciclo cellulare 36. Si prevede quindi che la prima postmitotico, GFP + neuroni seguenti E13 elettroporazione nella corteccia dorsale (campo 1) deve compilare il CP di formatura. Questi neuroni sono stati osservati (Figura 4) che indica che il protocollo può attendibilmente indirizzare L6 neuroni corticali per studi di loro migrazione e maturazione.

Per stimare il "tasso di successo" della elettroporazione / espianto procedura che abbiamo analizzato un'indagine in corso dal nostro laboratorio. Nel corso di questo studio, 21 litri di espianti sono stati preparati, per un totale di 248 embrioni sono state elettroporate (come descritto sopra) con CAG-GFP, e un espianto emisfero da ciascun embrione è stato preparato. Degli originali espianti 248, 195 (79%) sono stati giudicati idonei per l'imaging e di analisi. Circa la metà dei 53espianti che non potevano essere analizzati non è riuscito a esprimere GFP o avevano mis-targeting espressione GFP. Le perdite rimanenti sono stati spiegati dalla crescita dismorfico a causa di espianto distacco dal filtro cultura, o problemi connessi con l'elaborazione istologica. Questo tasso di successo di circa il 80% (Figura 5) ha reso il sistema espianto adatto per studi farmacologici 26, così come l'analisi di mutazioni recessive 7 che alterino primo sviluppo corticale.

Figura 1
Figura 1. Intera procedura di espianto emisfero con elettroporazione utero ex. A) E13 embrioni di topo sono iniettati con una soluzione di DNA plasmidico e elettroporate. I cervelli sono sezionati e recisi sagittale. L'elettroporazioneemisfero vengono poi poste lato mediale su un filtro rivestito collagene e coltivate per 2 DIV. Emisferi può quindi essere realizzata live o fissati per l'istologia e l'analisi di immagini successive. B) Una foto di 10 espianti immessi tre filtri in un piatto ben sei coltura tissutale. C) Il piatto ben sei con espianti è collocato in un ambiente di ossigeno elevato (95% O 2/5% CO 2) all'interno di un Billups-Rothenberg Incubator camera, che viene quindi posto in uno standard 37 ° C di coltura tissutale incubatore.

Figura 2
Figura 2. Organotipica di crescita corticale espianti in tutto l'emisfero derivati ​​da una singola cucciolata di Eomes :: embrioni eGFP. A, E) Una sezione coronale da un menu a fisso cervello all'inizio del culto ure periodo (O DIV). Notare che il PP è presente ma che CP deve ancora formare. Il segnale verde è prodotto da espressione GFP in immaturi neuroni eccitatori e il blu è colorante Hoechst che contrassegna il nucleo di tutte le cellule. B, F). Crescita CP, indicata con linee tratteggiate, è osservato da 0,5 DIV e aumenta di 1 DIV (C e G) e 2 DIV (pannelli D e H). Notare lo spessore maggiore della GFP esprimere in cellule dominio AD pannelli, indicando la proliferazione e la differenziazione del lignaggio neurone eccitatorio del espianto. Barre di scala sono 500 micron (pannello A) e 50 micron (pannello H). Abbreviazioni: CP, piatto corticale, IZ, zona intermedia, MZ, zona marginale, SP, a piastra, VZ, zona ventricolare.

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Figura 3. Scissione Preplate in espianti tutto l'emisfero. AC) condroitina solfato proteoglicani (CSPG) immunostaining illustra la divisione (splitting) del PP nel MZ e SP. DF) Espressione del Ctip2 fattore di trascrizione nel CP di nuova formazione. GI) Espressione del trascrizione Tbr1 fattore CP appena formata. Barre di scala sono 50 pm di pannelli C, F, I.

Figura 4
Figura 4. Espressione di GFP in espianti tutto l'emisfero dopo E13 elettroporazione in utero ex. AC) espressione GFP dopo 2 DIV. Notare lo strato di neuroni corticali che formano nella parte superiore del CP (frecce). DF) Nestin (rosso) immunoreactivlità in una sezione da un espianto emisfero. GH) Reelin (rosso) immunoreattività in una sezione derivato da un espianto emisfero. Barre di scala in pannelli C, F, e io sono 50 micron.

Figura 5
Figura 5. Variabilità in termini di orientamento elettroporazioni utero ex di dorsale corteccia mediale (campo 1). Undici embrioni da una cucciolata unico sono stati elettroporate con l'espressione costrutto CAG-GFP (0,33 mg / ml) e coltivate come espianti tutto l'emisfero. AI) nove degli undici espianti ha mostrato espressione di GFP in dorsale corteccia mediale. Anche se l'espressione GFP varia tra espianti, in ogni GFP espianto viene rilevato in tutte e tre le zone corticali (cioè VZ, IZ e CP). Barra di scala è 50 pm di pannello A.

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Discussion

Abbiamo migliorato e valutato un modello sperimentale - espianti tutto l'emisfero - per lo studio delle prime fasi dello sviluppo corticale (E13-E15). Il modello si è dimostrato utile per l'analisi della migrazione e differenziazione del lignaggio neurone eccitatorio che costituisce lo strato 6 della corteccia cerebrale 25,37. I principali vantaggi del sistema sono 1) la crescita organotipica per 2 DIV, 2) la semplicità di preparazione, e 3) accesso sperimentale alle neuroni per elettroporazione, manipolazione farmacologica e imaging durante questo primo, periodo critico dello sviluppo cerebrale. Abbiamo usato il sistema per documentare sottili differenze nella morfologia, l'orientamento e la crescita dendritica dei neuroni corticali strato 6 7,38 durante il periodo di scissione preplate.

I neuroni eccitatori che popolano strato 6 sono in gran parte composto di neuroni di proiezione corticothalamic che forniscono ingresso reciproco al talamo dorsale 39,40 41. Anche se questi neuroni sono fisiologicamente specializzati, il processo di generazione, la migrazione e la maturazione dei neuroni strato 6 parti caratteristiche di base con tutti i neuroni eccitatori nei livelli 2-6 della corteccia. In particolare, tutti i neuroni corticali eccitatori vengono generati nella VZ dorsale telencephalic, migrano attraverso la IZ come neuroni multipolari, e differenziare all'interno del CP 7. La maturazione dei neuroni corticali eccitatori è guidato da un nucleo di fattori di trascrizione sequenza espressi: Pax6, tbr2 e Tbr1 29. Questa sequenza è condiviso da tutti i neuroni eccitatori in strati 2-6 42 e abbiamo confermato l'espressione appropriata Tbr1 nel CP di nuova formazione (figure 3G-3I). Utilizzando questo approccio per indagare lo sviluppo di strato 6 neuroni corticali dovrebbe quindi fornire intuizioni essenziali per lo sviluppo di neuRons che costituiscono tutti gli strati corticali.

Espianti emisfero integrare gli approcci esistenti per gli studi di sviluppo neurone corticale. Gli studi precedenti hanno impiegato un intero approccio E14 espianto emisfero per studiare lo sviluppo corticale per 1 DIV 22,23. Abbiamo accoppiato espianti tutto l'emisfero con elettroporazione utero ex indagare 2 giorni di sviluppo corticale durante il periodo di formazione e L6 splitting preplate. In contrasto con in elettroporazioni utero a E13, il tasso di successo di elettroporazioni utero ex seguite da espianto emisfero è più alta: nelle nostre mani abbiamo raggiungere il successo ~ 80% in termini di orientamento elettroporazione al telencefalo dorsale. Inoltre, in elettroporazioni utero richiedono un intervento chirurgico di sopravvivenza e richiedere un impegno molto più tecnico che l'intero approccio utero ex emisfero. Infine, in studi utero non sono facilmente recuperabili per farmacologica precisamanipolazioni e approcci di imaging. Preciso controllo temporale nella consegna o di attivazione di farmaci e agenti molecolari (vettori di espressione, costrutti silenziatori, ecc) in concentrazioni di cui è dotato gli espianti tutto l'emisfero, ma è più difficile da realizzare in utero. Vivo monitoraggio ottico degli effetti risultanti di tali manipolazioni, con risoluzione spaziale nella gamma micron, è prontamente disponibile con EUEP, ma non IUEP. Tale precisazione è probabile che migliori nettamente la potenza interpretativa dei dati raccolti da esperimenti che coinvolgono lo sviluppo corticale e la funzione. Così, per gli studi dei primi espianti corticali dell'emisfero intero sviluppo in possesso di diversi vantaggi rispetto all'approccio sperimentale in utero. In questo momento, però, per gli studi di livello superiore di neuroni corticali e gli esperimenti che richiedono la raccolta di dati> 48 ore, espianti fetta e negli approcci utero rimane preferibile.

Esistono diversi requisiti critici per il successo di tutta la tecnica espianto emisfero. Primo, la crescita della espianto è altamente sensibile per l'integrità meccanica delle meningi. Danni fisici alle meningi (punture cioè o strappi), avrà, di interrompere lo sviluppo locale della corteccia sottostante. In secondo luogo, la crescita espianto è sensibile al volume totale del supporto all'interno della coltura così: con mezzi troppo espianti si disinnesta dal filtro e sviluppare architettura distorta CP; con mezzi troppo piccoli e gli espianti sono suscettibili a disidratarsi e sperimentare eccessiva delle cellule morte . Infine, con gli espianti tecniche attuali abbiamo documentato una crescita corticale per 2 DIV. Quando si inizia a E13 questa finestra di tempo di sviluppo, pur riconoscendo molte indagini importanti, limita l'analisi ad un periodo precedente alla sinaptogenesi e canonica comunicazione neuronale. Anche se i neuroni corticali a E14.5 mRNA espressi molti codifica proteine ​​sinaptiche (w.genepaint.org "target =" _blank "www.genepaint.org>), sinaptogenesi non inizia fino a ~ E15 nella corteccia laterale, e questo sinaptogenesi si limita a preplate cellule piuttosto che strato 6 neuroni 43. alcune questioni critiche relative formazione delle sinapsi corticali e la funzione sono quindi al momento non indirizzabile con l'intero sistema espianto emisfero.

In conclusione, il tutto preparato espianto emisfero può essere utilizzato in modo affidabile e coerente per indagare primi stadi dello sviluppo corticale in modelli murini di ereditarie malformazioni cerebrali. La tecnica è facilmente adattabile a RNAi, shRNA e altre manipolazioni molecolari e farmacologici. L'espianto emisfero è anche adatto per studi riguardanti applicata proteina ricombinante, farmaci e tossine ambientali.

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Disclosures

Gli autori dichiarano di non avere conflitto di interessi finanziari.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni NINDS (NS066071) e il NIAAA. (P50AA017823) a ECO. Gli autori ringraziano il Dr. Robert Quinn e il personale del Dipartimento delle Risorse Animali di laboratorio per la cura degli animali. Ringraziamo Judson Belmont per il supporto tecnico, Nicole Belletier di assistenza, come Fellow Undergraduate Research Estate (SURF). Ringraziamo anche il dottor David Cameron per i commenti e le modifiche in una versione precedente del manoscritto.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
DMEM/F12 + GlutaMAX GIBCO 10565
G5 Supplement 100X Invitrogen 17503-012
B27 Serum-Free Suppl. 50X Invitrogen 1504-044
Pen / Strep Liquid 100X Invitrogen 15140-122
HBSS 500 ml GIBCO 14025
Culture insert collagen coated Costar 3492
Bovine skin gelatin Sigma G9382
H–chst 33342 Invitrogen H1399
Bovine Serum Albumin Sigma 7906
EndoFree Plasmid Maxi Kit Qiagen 12362
Equipment
BTX 830 Electroporator Harvard Apparatus 450052
Tweezer electrodes 10mm Harvard Apparatus 450166
Incubator Billups Rothenberg MIC-101
Hamilton syringe (5uL) Hamilton 87930
Hamilton syringe needle Hamilton 7803-04 Specify 1" and style 4
Dumont #5 Forceps FST 11251-10
Fine Scissors Tough Cut 9 cm FST 14058-09

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References

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<em>Ex utero</em> elettroporazione e Espianti intero emisfero: un semplice metodo sperimentale per gli studi del primo sviluppo corticale
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Nichols, A. J., O'Dell, R. S., Powrozek, T. A., Olson, E. C. Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development. J. Vis. Exp. (74), e50271, doi:10.3791/50271 (2013).

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