Summary
Se presenta un método de diagnóstico rápido y de bajo costo para la identificación de los reguladores transcripcionales utilizando alto rendimiento transfecciones robóticos y un ensayo de luciferasa dual brillo casero. Este protocolo genera rápidamente datos funcionales directos de lado a lado para miles de genes y es fácilmente modificable para apuntar cualquier gen de interés.
Abstract
Se presenta un protocolo de cribado de alto rendimiento rápido y barato para identificar reguladores de la transcripción de la alfa-sinucleína, un gen asociado con la enfermedad de Parkinson. Células 293T se transfectaron de forma transitoria con plásmidos de una biblioteca de expresión ORF dispuestos, junto con plásmidos informadores de luciferasa, en un formato de microplaca de un gen-por-así. Actividad de la luciferasa de la luciérnaga se ensaya después de 48 horas para determinar los efectos de cada gen de la biblioteca después de la transcripción alfa-sinucleína, normalizada para la expresión de una construcción de control interno (un promotor de hCMV dirigir la luciferasa de Renilla). Este protocolo se ve facilitada por un robot de sobremesa encerrado en una cabina de bioseguridad, que realiza la manipulación de líquidos aséptica en formato de 96 pocillos. Nuestro protocolo de transfección automatizado es fácilmente adaptable a la producción de alto rendimiento biblioteca lentiviral u otros protocolos de cribado funcionales que requieren triples-transfecciones de un gran número de plásmidos de la biblioteca únicos en conjugadoFuncione con un conjunto común de plásmidos auxiliares. También presentamos una alternativa económica y validado para comercialmente disponibles reactivos de luciferasa duales, que emplea el PTC124, EDTA, y pirofosfato para suprimir la actividad luciferasa de luciérnaga antes de la medición de la luciferasa de Renilla. El uso de estos métodos, que exhibió 7.670 genes humanos y se identificaron 68 reguladores de la alfa-sinucleína. Este protocolo es fácilmente modificables para atacar otros genes de interés.
Introduction
La capacidad de identificar elementos reguladores genéticos clave y los factores que actúan sobre ellas es fundamental para la exploración de numerosos procesos biológicos. Sin embargo, los factores que regulan la expresión de genes en los tipos de células raras, como la identificación de poblaciones neuronales específicas, puede ser un reto. Aquí, se presenta un protocolo para la identificación de nuevos reguladores transcripcionales de alfa-sinucleína (SNCA), un gen asociado con la enfermedad de Parkinson y expresado en las neuronas dopaminérgicas en la substantianigra pars compacta de la región del cerebro medio. Esto lo logramos mediante una pantalla reportero de alto rendimiento, doble luciferase, in vitro para deconstruir la expresión de alfa-sinucleína en las células 293T. El promotor de alfa-sinucleína se clona primero en un plásmido que contiene el gen reportero de luciferasa de luciérnaga. Un plásmido comercialmente disponible que contiene la luciferasa de Renilla bajo el control de un promotor constitutivamente activo sirve como un control interno. Thesconstrucciones e reportero se transfectan conjuntamente en células 293T en microplacas con plásmidos de una biblioteca de expresión de ADN, de tal manera que cada pocillo se transfectaron con un único plásmido de la biblioteca. Después de 48 horas, la actividad de la luciferasa para cada reportero se mide de forma secuencial utilizando un ensayo de doble resplandor. La expresión relativa de alfa-sinucleína en respuesta a cada gen biblioteca se deduce por la relación de luciérnaga: la actividad de luciferasa de Renilla en cada pocillo (F: relación R) después de la normalización a base de placa.
Este protocolo proporciona la capacidad de detectar un gran número de genes (~ 2,500 por semana) por su capacidad para transactivar un gen reportero usando mano de obra mínima (1-2 personas) y un costo mínimo (unos 3 dólares el costo de reactivos por ensayo de microplacas). Reguladores de la transcripción de los genes neuronales (por ejemplo, alfa-sinucleína), que son difíciles de estudiar en neuronas cultivadas refractarios a la manipulación genética, se pueden comparar lado a lado en este ensayo funcional directa. Incluimos en nuestroprotocolo de un método detallado para la clonación y el crecimiento de plásmidos que contienen el promotor de alfa-sinucleína, ya que encontramos que los plásmidos que contienen esta región son inestables cuando se cultivan con procedimientos convencionales (véase la discusión). También incluimos una alternativa económica a los reactivos disponibles en el mercado dual de luciferasa para ensayos de alto rendimiento. Este protocolo se puede adaptar fácilmente para dirigirse a otros elementos reguladores de interés, o a cualquier proceso que requiere de alto rendimiento transfecciones transitorias.
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Protocol
Para una visión general experimental, ver Figura 1.
1. Preparar reportero plásmidos que contienen la alfa-sinucleína Promotor
Los elementos reguladores del gen de la alfa-sinucleína (Figura 2) abarcan aproximadamente 10 kb, desde el upstream NACP (A no componente beta amiloide) secuencia de repetición del dinucleótido 1,2 través intrón 2 3. Incluimos una parte de esta región en nuestro reportero construir. Encontramos que los plásmidos que contienen el intrón 2 se requieren procedimientos especiales para el crecimiento, que se detallan a continuación. Los plásmidos de luciferasa, pGL4.10 y pGL4.75 (Figura 3), están disponibles comercialmente de Promega y se pueden propagar a través de protocolos de biología molecular convencionales.
- Amplificar los 2 componentes de el promotor de alfa-sinucleína en las PCR separadas utilizando la receta en la Tabla 1 y los cebadores de la Tabla 2.
- Verify productos de PCR en un gel de agarosa y se limpia utilizando el kit de purificación de PCR Qiaquick (Qiagen), eluyendo en 50 l de TE (Tris-EDTA). Almacenar el fragmento de 0,9 kb eluido a -20 ° C para su uso futuro.
- Digerir todo el volumen del fragmento de PCR de 3,4 kb, así como 5 g de pGL4.10, con SacI y XhoI. Tratar el vector con fosfatasa alcalina de intestino de ternero (Roche) y gel de purificar utilizando el kit de PureLink Gel Extracción rápida (Invitrogen).
- Se liga el fragmento y el vector utilizando ADN ligasa T4 (NEB). Limpiar la reacción completada usando el kit de PCR PureLink Micro (Invitrogen), eluyendo en 10 l de tampón TE.
- Transformar 2 l de la limpiado, reacción de ligación en 20 l de células competentes ElectroMAX Stbl4 (Invitrogen) y electroporar de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Agitar en un 30 ° C incubadora a 225 rpm durante 90 min. Spread 2 volúmenes en placas de LB que contenían 100 mg / ml de ampicilina y se incuba a 30 ° C durante 2 días.
- Con un palillo, seleccione 4-6 pequeñas colonias de inoculación en 2 ml de TB (Terrific Broth). Cultivar estas culturas miniprep en un 30 ° C coctelera O / N.
- Se purifica ADN plasmídico a partir de 1,5 ml de cada cultivo Miniprep utilizando el kit de PureLink HiPure plásmido Miniprep (Invitrogen).
- Digerir las minipreparaciones con BamHI y a electroforesis en un gel de agarosa. El clon correcto debería producir fragmentos de 2,8 kb y 4,9 kb.
- Restreak la cultura Miniprep restante del clon correcto en un LB (caldo de Luria) placa fresca y crecer a 30 ° C durante 2 días.
- Seleccionar una pequeña colonia e inocular un cultivo iniciador 1,5 ml de TB. Agite O / N a 30 ° C. No deje que el cultivo iniciador crecer hasta la saturación.
- Diluir todo el cultivo iniciador en 150 ml de TB precalentada y agitar a 30 º C durante 2 días. Antes de proceder al paso siguiente, utilizar 1,5 ml de este cultivo para una miniprep y la digestión adicional para confirmar que el clon no mutar durante replicati en.
- Se purifica ADN de plásmido a partir del cultivo restante utilizando el kit de PureLink HiPure plásmido maxiprep (Invitrogen). Los rendimientos esperados de este plásmido intermediario son de 50-150 mg por 150 ml de la cultura.
- Descongelar el fragmento de 0,9 kb congelada en el paso 1.2. Repita los pasos 1.3 a 1.12 para clonar el fragmento de 0,9 kb en el plásmido intermedio, digiriendo lugar con KpnI y SacI. Ligar, transformar, seleccionar y crecer durante Maxipreps que el anterior. La digestión con BamHI debe producir fragmentos de 5,8 kb y 2,8 kb. Este es el plásmido que se utilizará para la pantalla.
2. Preparar las células 293T, el reportero plásmidos y ADN Library for Screening
Células 293T se sembraron primero en placas de 96 pocillos y se transfectaron el día siguiente. Reportero plásmidos y ADN de biblioteca se diluyen en placas de 96 pocillos. Se obtuvieron placas de ADN biblioteca transfección de grado a partir del ADN del núcleo en el Hospital General de Massachusetts (obtener = "_blank"> dnacore.mgh.harvard.edu). Este protocolo transfecta una placa única biblioteca en 2 placas idénticas de células 293T (Figura 1), por lo tanto, 2 placas de células deben ser sembradas para cada placa de la biblioteca que se proyectarán.
Nota: Se cultivan las células en medio sin rojo fenol o antibióticos, ya que éstos interfieren con los ensayos de luciferasa y aumentan la toxicidad durante la transfección, respectivamente.
- Para cada placa de la biblioteca de ser controlados, volver a suspender las células 293T tratadas con tripsina a una concentración de 1,5 x 10 5 células / ml en DMEM que contenía 14% de FBS. Vierta la mezcla en un recipiente estéril (Axygen).
- Coloque el depósito, 2 de fondo claro-, placas de 96 pocillos (Corning), y una caja de puntas de pipeta filtro (Agilent) en la cubierta del robot. Dispensar 100 l de células en cada pocillo de ambas placas, para una densidad de 1,5 x 10 4 células por pocillo.
- Centrifugar las placas de las células a 50 xg durante 2 min, con bajas velocidades de rampa para garantizar la igualdaddensidad celular a lo largo de cada pocillo. Incubar a 37 ° C y 10% de CO 2 O / N.
- Diluir la luciérnaga y Renilla reportero plásmidos a 5 ng / l en medio libre de suero. Combinar las diluciones en una proporción de 05:03 de luciérnaga a plásmido de Renilla (en volumen) en un tubo cónico de 15 ml.
- Pipet los plásmidos combinados en cada pocillo de una placa de 96 pocillos, dosificar 17 l por placa de biblioteca, además de 2-10 l exceso, en cada pocillo.
- Obtener las placas de la biblioteca de ADN transfección grado que el anterior y diluir a 13,3 ng / l de agua libre de endotoxinas. El volumen mínimo por pozo debe ser de 28 l.
3. Lleve a cabo transfecciones
En el día 2 de la pantalla, reportero plásmidos y ADN de biblioteca se transfectaron en células 293T.
- Para cada placa de biblioteca, mezclar 107,5 l de RT Optifect (Invitrogen) con 4,3 ml de medio libre de suero (1:40 dilución) en un tubo de poliestireno. Incubar durante 5 min a TA, y elN prescindir de 44 l (por placa biblioteca) en cada pocillo de una placa de 96 pocillos, de fondo en V de poliestireno (Greiner).
- Coloque el plato de diluida Optifect, reportero plásmidos (Paso 2.5), los ADN de la biblioteca (Paso 2.6), y una caja de puntas de pipeta en la cubierta del robot.
- Aspirar 17 l de reportero plásmidos, 43 l de diluirse Optifect, y 26 l de ADN de la biblioteca, la inserción de un espacio de aire 5 l entre cada aspiración. El ADN de la biblioteca debe ser aspirado pasado para evitar la contaminación cruzada. Vierta el contenido de las puntas en una nueva placa de poliestireno V de fondo, mezclar, tapar y dejar de lado por 20 minutos para permitir que los complejos de lípido / ADN para formar. Si la transfección de múltiples placas de biblioteca, reemplace las puntas de pipeta y placa de biblioteca, y repetir.
- Destape la placa de mezcla Optifect / ADN y lo coloca en la cubierta del robot con 2 placas de células 293T. El uso de una sola caja de puntas de pipeta, aspire 80 l de la Optifect: mezcla de ADN y lentamente dispensar 40 l en cada placa de células. Si transfecting múltiples placas de biblioteca, repita para todos Optifect: placas de ADN. Cubra las células.
- Centrifugar las placas de células a 1200 xg durante 30 min. Cubrir y volver a la incubadora.
- Se incuban las células durante 4-6 horas. Durante esta incubación, preparar medio fresco mediante la mezcla de 12 ml de DMEM que contiene 10% de FBS y 10 mg / ml de ciprofloxacina (CellGro) para cada placa de biblioteca transfectadas. Verter medio fresco en un depósito estéril.
- Coloque 2 cajas de puntas de robots, una sola placa de las células, el depósito que contiene medio fresco, y un depósito de residuos en la cubierta del robot. Aspirar 100 l de medio de las células y dispensar en el depósito de residuos parcialmente lleno con etanol al 70%. Utilizando puntas frescas, aspirado de 100 l de medio fresco y se dispensa lentamente sobre las células. Repita el procedimiento para todas las placas de células.
- Placas Volver a la incubadora durante 48 horas.
4. Realizar Dual-Luciferase ensayos
El día 4 de la pantalla, lase llevan a cabo ensayos de luciferasa de luciérnaga y Renilla.
Nota: El ensayo de doble luciferasa requiere la adición secuencial de 2 tampones de ensayo, 3X tampón de ensayo de luciérnaga y de Renilla 3X tampón de ensayo, como se describe en la Tabla 3 de la luciérnaga y de Renilla luciferasas no se secretan, por lo tanto las células deben ser lisadas antes de medir la actividad luciferasa. . Tampón de ensayo Firefly lisa células y proporciona sustrato para la luciferasa de luciérnaga; tampón de ensayo Renilla apaga la señal de luciérnaga y proporciona sustrato para la luciferasa de Renilla.
- Para cada placa de biblioteca, preparar 8 ml de 3X tampón de ensayo de luciérnaga a partir de soluciones madre como se describe en la Tabla 3, y dispensar 82 l en cada pocillo de una placa de 96 pocillos con fondo en V.
- Para cada placa de biblioteca, también preparar 12 ml de tampón de ensayo 3X de Renilla y dispensar 122 l en cada pocillo de una placa de 96 pocillos con fondo en V. Ponga a un lado tanto elluciérnagas y Renilla tampones de ensayo.
- Coloque una caja de puntas de pipeta, un depósito de residuos, y 2 placas de células (transfectadas del mismo plato biblioteca) en la cubierta del robot.
- Aspirar 60 l de los medios de comunicación de cada placa y desechar en el depósito de residuos parcialmente lleno de etanol al 70%. Las placas de cubierta y reservar. Si la transfección de múltiples placas de biblioteca, repita para todos los conjuntos de placas.
- Coloque 2 cajas de puntas de pipeta, la placa de 3X tampón luciérnaga ensayo, y un conjunto de placas de las células de la cubierta del robot.
- Aspirar 40 l de tampón 3X luciérnaga ensayo y la agregan a la primera placa de células, mezclando bien. El cambio a las nuevas puntas de pipeta, repita el procedimiento para la segunda placa de la célula. Colocar las células a temperatura ambiente durante 10 minutos para completar la lisis. Si la transfección de múltiples placas de biblioteca, cambie las cajas de puntas y placas de las células, y repetir.
- Luminiscencia Record de cada pocillo de cada placa de células en un luminómetro, grabar durante 1 segundo por pocillo. Placas Volver al robotcubierta.
- Coloque 2 cajas de puntas de pipeta, la placa de tampón de ensayo 3X Renilla, y un conjunto de placas de las células de la cubierta del robot.
- Aspirar 60 l de tampón de ensayo 3X Renilla, y agregarlo a la primera placa de células, mezclando bien. El cambio a una nueva caja de puntas de pipeta, repita el procedimiento para la segunda placa de la célula. Si la transfección de múltiples placas de biblioteca, repita para todos los conjuntos de placas de las células.
- Luminiscencia Registro de todas las placas en un luminómetro, registrando cada pocillo durante 1 segundo el anterior. Deseche las placas.
5. Análisis de Datos
- Calcular la luciérnaga: relación Renilla luminiscencia ("F: relación R") para cada bien dividiendo los condes de la señal de la luciérnaga por los condes de señal de Renilla.
- Calcular el valor de inducción dividiendo la relación F: R de cada pocillo por el promedio de F: relación R de la placa, excluido el de mayor y más bajo 25% de los pozos.
- La media de los valores de inducción a través de repeticionespara una placa de biblioteca única transfectadas. Los genes que inducen o reprimen la alfa-sinucleína más de tres pliegues son considerados "hits" en esta pantalla y están sujetas a una mayor validación y pantallas secundarias.
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Representative Results
Luciferase valores típicos, F: R ratios y valores de inducción para un único medio de placas se muestran en la Figura 4 Nota del éxito en el pozo H2, un inductor de 32 veces.. Los genes que causan una toxicidad excesiva (por ejemplo, así E3), o los pozos que fueron mal transfectadas, producirán valores bajos para ambos luciérnaga y luciferasa Renilla, pero un valor medio de inducción. Los genes que causan la inducción no específica de la actividad de la luciferasa, tal vez a través de la interacción con la columna vertebral PGL4, inducirán luciérnaga y luciferasa Renilla por igual, lo que resulta en un valor medio de inducción. Las grandes discrepancias en los valores de inducción entre las réplicas deben plantear la sospecha de errores de ejecución. Es importante verificar que la pantalla se lleva a cabo dentro del intervalo lineal de los ensayos de reportero de modo que los clones que causan el aumento de expresión se miden como el aumento de la actividad de luciferasa. Estamos transfectadas creciente cantidad de cada gen reportero para validar la linealidaddel reportero de ensayo bajo condiciones experimentales (Figura 5). También es importante para llevar a cabo los ensayos inmediatamente después de la etapa de incubación para evitar la no linealidad debido al agotamiento del substrato. Se observó una significativa actividad de luciferasa de luciérnaga hasta 1 hora después de la adición de los reactivos (Figura 6).
Figura 1. Visión general Experimental. Cada placa única de ADN de la biblioteca se combina con 2 construcciones reportero y se utiliza para transfectar placas duplicadas de las células. Después de 48 h, la actividad de cada indicador de luciferasa se mide secuencialmente. La inducción específica del plásmido promotor SNCA por cada plásmido biblioteca se calcula por la relación de luciérnaga a luciferasa de Renilla después de normalizatio a base de placan.
Figura 2. Esquema de la región 5 'de la alfa-sinucleína (SNCA), localizado en el cromosoma 4, utilizado en el plásmido reportero de luciérnaga. Nombres de cebadores corresponden a las secuencias de la Tabla 2. Marcas de sombreado indican un segmento de aproximadamente 8 kb eliminado de la figura , de lo contrario a escala. El codón de inicio ATG para SNCA se encuentra en el exón 3.
Figura plásmidos informadores 3. Luciferasa utilizados en este protocolo de cribado. Las regiones genómicas SNCA se clonan en el sitio de clonación múltiple de pGL4.10 inmediatamente aguas arriba de la luciferasa de luciérnaga. Un plásmido con la de hCMV-IE1 (citomegalovirus humano inmediato temprano 1) promotor que dirige la expresión de la luciferasa de Renilla se utilizó como control interno. Ambos plásmidos están disponibles comercialmente de Promega.
Figura 4. Los resultados representativos de la mitad de una sola placa de 96 pocillos. A. primas los recuentos luciferasa de luciérnaga recuentos de luciferasa Renilla Raw B. C. F:.. Cocientes R, calculado dividiendo el valor en A por el valor de los valores de B. D. inducción para cada pozo, que se calcula dividiendo cada F: relación R por el promedio de F:. relación R de la placa, con exclusión de la parte superior e inferior 25% de los pozos E. Representación gráfica de los valores de orientación que proporcione una sola placa, con el pozo H2, un éxito positivo, destacó. Golpe H2 es un factor de transcripción neuronal no asociados previamente con la expresión de PGC. Haz clic aquí para ver más grande la figura .
Figura 5. Ensayos de linealidad. Las células fueron transfectadas con cantidades crecientes de luciérnaga y plásmidos de luciferasa de Renilla bajo el control del fuerte promotor de hCMV-IE1 y se ensayaron con el protocolo anterior. (Cantidad total de ADN transfectado se mantuvo constante mediante el uso de un plásmido equilibrador neutro). Ensayo de linealidad A. luciérnaga. Tenga en cuenta que la actividad de luciérnaga sigue siendo lineal a través de una amplia gama de valores. Linealidad de ensayo B. de Renilla. Tenga en cuenta el aplanamiento de la curva por encima de 15 ng / pocillo.
.. Figura 6 Evolución temporal de la señal de la decadencia para el ensayo de luciferasa de luciérnaga se añadieron reactivos de luciferasa a una sola placa transfectadas con CMV-luciferase construir en el tiempo 0; mediciones en serie fueron hechas sin la adición de otros reactivos.
| Componente | Volumen | Concentración final |
| BAC 2002-D6 a 5 ng / l | 4 l | - |
| 5X Phusion GC Buffer | 20 l | 1X |
| DMSO | 6 l | 6% |
| dNTP (10 mm) | 2 l | 200 M |
| Cebador (100 mM) | 1 l | 10 M |
| Reverse Primer (100 M) | 1 l | 10 M |
| ddH2O | 65 l | - |
| Phusion ADN polimerasa | 1 l | - |
| Total: 100 l |
Tabla 1. PCR puesta a punto para amplificar el promotor de alfa-sinucleína.
| Nombre | Secuencia | Restricción del sitio |
| SNCA7 | 5'-gtc GGTACC tgaagttaacctcccctcaatacc-3 ' | KpnI |
| SNCA8 | 5'-tgc GAGCTC aagaagacagccatctgcaagcc-3 ' | SacI |
| SNCA1 | 5'-TCT GAGCTC tctgagcatttccctaggtg-3 ' | SacI |
| SNCA2 | 5'-tag CTCGAG ggctaatgaattcctttaca-3 ' | XhoI |
.. Tabla 2 cebadores para amplificar el promotor de alfa-sinucleína El Repita amplicón NACP debe producir un fragmento de 0,9 kb; la otra longitud amplicón es de 3,4 kb. Para conocer las ubicaciones de imprimación, por favor refiérase a la Figura 2.
| A: 3X Firefly tampón de ensayo | ||
| Soluciones de archivo (conservar a -80 ° C) | Volumen por 100 ml 3X Firefly tampón de ensayo | Concentración final (3X) |
| TDT 500 mM | 3,0 ml | 15 mM |
| 10 mM de coenzima A | 6,0 ml | 0,6 mM |
| ATP 100 mM | 0,45 ml | 0,45 mM |
| 80 mg / mlluciferin | 0.525 ml </ Td> | 4,2 mg / ml |
| Tampón de lisis Triton | 90.025 ml | - |
| B. Triton Tampón de Lisis | ||
| Componente (conservar a temperatura ambiente) | Volumen por 100 ml de tampón de lisis Triton | Concentración final |
| Polvo de Tris-HCl | 1,705 g | 0,1082 M |
| Polvo de Tris-base | 0,508 g | 0.0419 M |
| M de NaCl 5 | 1,50 ml | 75 mM |
| 1 M de MgCl 2 | 0,30 ml | 3 mM |
| Triton X-100 líquido puro | 0,75 ml | 0,25% |
| Agua | al volumen total de 100 ml | - |
| C. 3X de Renilla Tampón de Ensayo | ||
| Volumen por ~ 100 ml 3X Renilla tampón de ensayo | Concentración final (3X) | |
| MM PTC124 10 en DMSO | 0,6 ml | 0,06 mM |
| 2 mM h-CTZ en etanol | 0,5 ml | 0,01 mM |
| Renilla Sales | 100 ml | - |
| D. Renilla Sales | ||
| Componente (conservar a temperatura ambiente) | Volumen por 100 ml Renilla Sales | Concentración final |
| 0,5 M de Na 2 EDTA | 9,0 ml | 45 mM |
| Na Pirofosfato | 1,34 g | 30 mM |
| NaCl | 8,33 g | 1.425 M |
| Agua al volumen total de 100 ml | - | |
Tabla 3. Las soluciones madre y tampones de ensayo para las luciérnagas y Renilla luciferase ensayos. A. 3X receta tampón de ensayo de luciérnaga. TDT, ditiotreitol. Salvo que se indique, todos los componentes son solubles en agua. B. Triton lisis receta tampón. C. 3X de Renilla receta tampón de ensayo. H-CTZ, H-coelenterazina. Hacer 2 mM h-CTZ añadiendo 10 mg h-CTZ a 12,2 ml de EtOH al 100% y 120 l de HCl concentrado. PTC124 es soluble en DMSO. D. Renilla sales receta. Triton tampón de lisis y sales de Renilla son estables durante varias semanas a 4 º C y RT, respectivamente. 3X tampón de ensayo de luciérnaga y de Renilla 3X tampón de ensayo deben mezclarse dentro de 3-4 horas de realizar el ensayo de luciferasa.
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Discussion
Alfa-sinucleína se ha implicado en la enfermedad de Parkinson (EP) como un componente de los cuerpos de Lewy 4, inclusiones intracelulares considerados patognomónicos de la enfermedad. Numerosos estudios de asociación del genoma han relacionado polimorfismos de nucleótido único en la alfa-sinucleína con un mayor riesgo para los esporádicos PD 5,6,7. Aunque menos común que la enfermedad de Parkinson esporádica, PD familiar puede estar también causada por mutaciones en alfa-sinucleína 8, así como la duplicación y triplicación del locus alfa-sinucleína 9,10,11, un fenómeno también se observa en la enfermedad de Parkinson esporádica 12. En conjunto, estos estudios refuerzan la centralidad de la alfa-sinucleína en la patogénesis de la enfermedad de Parkinson. El objetivo de esta pantalla fue identificar los genes que regulan la alfa-sinucleína y por lo tanto puede desempeñar un papel en la patogénesis de la enfermedad de Parkinson. El uso de este protocolo, que exhibió 7.670 genes humanos y se identificaron 154 visitas preliminares (por lo menos 3 veces inductores), lo que representa 140genes únicos. Estos éxitos fueron sometidos a ensayos secundarios que utilizan las nuevas preparaciones de ADN para determinar hit reproducibilidad. Impactos en el rango de 3 veces reproducidas en el 28% de los ensayos de luciferasa posteriores. La reproducibilidad se incrementó a 59%, 69% y 78% en 4 -, 5 -, y los inductores de 5 veces, respectivamente. Solicitudes con inducciones más de 7 veces reproducidas 100% del tiempo. En última instancia, se identificaron 68 nuevos reguladores de la transcripción de la alfa-sinucleína.
Varias líneas de evidencia sugieren que los 68 resultados que obtuvimos son reguladores reales de alfa-sinucleína. Nuestra lista de éxitos identificados incluye GATA3, un miembro de la familia de factores de transcripción GATA mostrados anteriormente para regular la expresión de PGC 3. Puntaje uno de los pocos reguladores conocidos SNCA da una gran confianza en la fiabilidad de nuestra pantalla. Además, independientemente marcamos como golpea a varios miembros de una misma familia de factores de transcripción neuronales, lo que sugiere que la pantalla es reproducible y no la identificación de genesal azar. Lo más importante, en los ensayos de seguimiento adicionales, la capacidad de nuestro top golpea para regular la expresión endógena SNCA en las células neuronales fue validado en la sobreexpresión y ensayos desmontables. Sobreexpresamos algunos de los grandes éxitos utilizando BacMamvectors 3 en las células dopaminérgicas SY5Y y pudimos aumentar los niveles endógenos SNCA 2-8 veces, mientras shRNA desmontables de estos éxitos se tradujo en niveles de ARNm SNCA disminuido. Estos estudios demuestran de forma concluyente que nuestros principales éxitos son reguladores de los niveles endógenos SNCA y no son simplemente artefactos del sistema de luciferasa deconstruido. Se requieren estudios adicionales de seguimiento para otros golpes para determinar las verdaderas tasas de positivos y falsos negativos falsos para la lista completa de los hits en nuestra pantalla. Una descripción completa de los golpes y su relación con la enfermedad de Parkinson se encuentra en preparación 14.
Es importante tener en cuenta las limitaciones de nuestra metodología de selección. Cabe obvious que la pantalla no sería identificar cualquier regulador no presentan en la biblioteca de cribado. Aunque nuestra biblioteca de examen era sustancial, que contiene alrededor de un cuarto del genoma humano, que no era completa. Dada la simplicidad de nuestro ensayo, librerías adicionales podrían ser examinados con facilidad. Hemos aumentado el número de genes seleccionados de forma selectiva mediante la inclusión de paralogs de hits, cuando estén disponibles, en nuestros ensayos secundarios. Tampoco podríamos anotar cualquier golpe que une a regiones genómicas fuera de los incluidos en nuestro reportero construir. Para maximizar las posibilidades de incluir a la región correcta, nuestro reportero contenía las secuencias de acompañamiento inmediatos para los múltiples sitios de inicio de transcripción se encuentran en el promotor SNCA. Es probable que los factores adicionales se unen a regiones lejos fuera de la región inmediata promotor para regular la expresión SNCA. Estos podrían ser detectados mediante la realización de pantallas con regiones aguas arriba y aguas abajo adicionales, si se desea, aunque sólo ~ 10 kb en un momento podrían ser unssessed de esta manera debido a las limitaciones en la clonación eficiente en vectores plasmídicos y la estabilidad de los vectores de alto número de copias PGL4. Alternativamente, el constructo de luciferasa podría ser adaptado en los ADN de BAC que contiene el locus SNCA. Una desventaja de este último enfoque es que la transfección de BAC, incluso bajo condiciones ideales es> 100 veces menos eficiente que plásmidos de 15. Otro enfoque sería "knock-in" el reportero de la luciferasa en el locus SNCA endógena, un método que es mucho más laborioso entonces nuestro enfoque. Tampoco podríamos anotar cualquier golpe que ya se expresa en niveles de saturación por lo que la sobreexpresión no se traduce en aumento de la actividad de la luciferasa. Por este motivo se optó por emplear células 293T no neuronales, que podrían carecer de factores neuronales que regulan SNCA, y de hecho lo hicimos marcar un número de factores de transcripción neuronales. Una desventaja potencial de las células 293T, sin embargo, es que tal vez no marcó ningún gen como un éxito si se requiere unafactores neuronales dditional funcionen correctamente. Por lo tanto, al igual que todas las pantallas, nuestro estudio podía faltar una serie de posibles reguladores SNCA. Sin embargo, en términos prácticos, los 68 éxitos que obtuvieron aumento del número de reguladores conocidos de SNCA en más de 10 veces y se requieren años de trabajo para el seguimiento, visitas de manera adicional puede no ser necesario en nuestro caso.
También es importante tener en cuenta los posibles artefactos que pudieran ocurrir con esta metodología. En las pantallas de químicos, luciferasa es notorio por compuestos artefacto de puntuación mediante la estabilización de la proteína luciferasa en lugar de por la inducción de la transcripción. Para descartar artefactos de estabilización de proteínas, hemos examinado nuestros golpes contra varias otras construcciones de promotor-luciferase y no encontrar ninguna pega que parecían actuar post-transcripcionalmente mediante la elevación de la expresión de promotores constitutivos. Otro artefacto potencial podría ser un factor transactivador que se une a la cadena principal del vector PGL4 en lugar deel promotor SNCA. Se empleó el vector PGL4 que ha sido mutagenizado extensivamente para eliminar factor de transcripción sitios de unión para evitar este problema. Para evaluar si alguno de nuestros éxitos requiere el esqueleto del vector para la inducción, se utilizó PCR para amplificar la región vector SNCA-luciferasa carente de cualquier columna vertebral y utilizamos este fragmento lineal como reportero de ensayos secundarios. No se encontraron diferencias significativas en los valores de inducción entre nuestro reportero plásmido completo y la construcción-espina dorsal libre lineal con una excepción. GATA2 mostró la inducción ~ 15 veces con el plásmido reportero, pero sólo ~ 2,7 veces con el reportero lineal, lo que sugiere que algunos de la inducción GATA2 puede ser debido a la unión a los componentes de la cadena principal.
Un número de otros métodos para identificar reguladores de la transcripción se han descrito. Hace casi 30 años, fue-est de la cartografía de los elementos de control de transcripción que actúan en cis de los promotores virales fuertes a través de la expresión del gen reportero transfectadasablished 16. Este método, que a veces se denomina "promotor golpear," ha caído en desgracia para el mapeo de promotores específicos de tipo celular, ya que es difícil de obtener y transfectar líneas celulares primarios adecuados, y estas líneas no puede representar con exactitud su tejido de origen. La de un sistema híbrido de levadura 17 evita este problema proporcionando un sistema indicador deconstruido para detectar interacciones entre una biblioteca de genes de fusión y un elemento cis-actuando específica. Nuestro enfoque es similar a la levadura de un sistema híbrido en su diseño deconstruido, pero en nuestro sistema que emplean clones de expresión normales en lugar de fusiones de genes, que emplean células de mamífero en lugar de la levadura, y emplean robótica que permite cuantitativa de lado a lado lecturas funcionales para cada gen de ensayo. Un método prometedor llamado proteómica de segmentos aislados de la cromatina (PICH), que permite la identificación de proteínas unidas a regiones específicas del genoma se ha descrito 18, pero no tiene todavíaha aplicado con éxito a los genes humanos de un solo ejemplar. Genoma toda la cromatina immunoprecipitation (CHIP-seq y chip-chip) los estudios se han utilizado para identificar las regiones que actúan en cis a gran escala 19. Este método puede ser de gran alcance, pero, como Pich, puede ser menos útil para los tipos de células, como las poblaciones neuronales específicas que no se obtienen fácilmente en la cultura homogénea. Por otra parte, cuando hemos comprobado las bases de datos de chip para nuestros éxitos validados, no han demostrado la unión de estos éxitos al promotor SNCA. La razón de esto no está claro, ya que hemos sido capaces de demostrar la unión de estos factores a la promotora SNCA de chip convencional 14; pero puede ser debido a la falta de toda la región del promotor SNCA ser empleado en estudios de chip usando lecturas de microarrays (chip-chip). Pich, chip-ss, y otros enfoques proteómicos pueden por lo tanto ser más útil cuando se acopla a las lecturas funcionales directos que nuestro método genera.
Dual-luciferaseensayos empleando luciérnaga y luciferasa Renilla ofrecer un método sensible para el estudio de numerosos procesos intracelulares en formato de alto rendimiento 20. La fusión de un promotor diana para la luciferasa de luciérnaga se ha utilizado para estudiar la regulación y promotor estructura transcripcional de numerosos objetivos in vitro, incluido el alfa-sinucleína 1,2. Desarrollamos una alternativa económica a los reactivos de doble luciferasa comercialmente disponibles que proporcionan la señal robusta y fue lineal en el rango de nuestro ensayo (Figura 6). Nuestro método es una adaptación de un protocolo generosamente proporcionado por Ron Johnson en el NIH y una doble luciferase ensayo no comercial descrito previamente 21. El tampón de ensayo de luciérnaga lisa células y proporciona ATP y luciferina, los sustratos de luciferasa de luciérnaga. Este ensayo produce una reacción resplandor con una vida media de aproximadamente 1 h (Figura 7). El tampón de ensayo Renilla apaga la firefly señal y proporciona sustrato apropiado (coelenterazina). Tenga en cuenta que el propio tampón de ensayo de Renilla no lisar las células y debe ser utilizado en combinación con tampón de lisis Triton o tampón de ensayo de luciérnaga. Se encontró que previamente descritos tampones de ensayo de Renilla precipitados fácilmente a TA, así que eliminan sulfato de sodio y la disminución de la cantidad de pirofosfato de sodio en un 60%. Nuestro ensayo también incluye el PTC124, un potente inhibidor de la luciferasa de luciérnaga 22 que contribuye enfriamiento adicional en el ensayo. La reacción se paró la actividad también se proporciona por EDTA, NaCl, y pirofosfato en la memoria intermedia de Renilla. Con estas nuevas formulaciones, aproximadamente el 99,5% de la actividad de luciérnaga se inactivó mediante la memoria intermedia de Renilla. La intensidad y la reproducibilidad de las señales de luciferasa de Renilla y luciérnaga se mejoraron ligeramente por mezcla después de la adición de los tampones (Pasos 4,6 y 4,10).
En nuestra experiencia, la de una completapromotor lpha-sinucleína en pGL4.10 es singularmente difícil para amplificar y clonar, tal vez debido a las regiones ricas en GC y estructura secundaria compleja en el intrón 2. Estábamos más exitoso con células competentes STBL4, que están optimizados para la clonación de insertos inestables. Incluso después de estas precauciones, frecuentemente recuperamos un mutante en el que E. Se insertó ADN genómico coli en el extremo 3 'de la construcción. Este mutante crea bandas de aproximadamente 5,8 kb y 4 kb cuando se digiere con BamHI (frente a 5,8 kb y 2,8 kb en el clon correcto) y aparece como colonias más grandes en placas selectivas. Crecimiento cuidadosa de células competentes a 30 ° C y la prevención de las culturas de alcanzar disminuciones de saturación, pero no elimina, la probabilidad de recuperar el mutante. Se recomienda la verificación de la pureza de todas las preparaciones de ADN por digestión de restricción y electroforesis en gel antes de la transfección.
Este protocolo de cribado se adapta fácilmente a otros promotores, unad debe ser optimizado en consecuencia, el uso de controles de genes positivos y negativos ya conocidos para regular el promotor diana. Varias consideraciones se aplican a la clonación y transfección de los plásmidos indicadores. Cuando la clonación del promotor diana en el plásmido informador de luciferasa de luciérnaga, el sitio de inicio de la luciferasa debe aproximar el sitio de inicio de la traducción en el gen diana. Pantallas Dual-Luciferase típicamente colocan el plásmido de Renilla bajo el control de un promotor mínimo, tal como el promotor de HSV-tk, para minimizar los efectos de la cadena principal del plásmido. Sin embargo, encontramos que uno de nuestros controles positivos inducidos este promotor, así que optamos por el promotor CMV. La cantidad relativa de cada plásmido reportero debe ser determinada empíricamente y está influenciada por la actividad constitutiva de cada promotor. Ideal basal (transfectadas, pero no inducida) conteos luciferasa deben ser por lo menos de cinco a diez veces más de fondo a partir de células no transfectadas, para permitir la detección de librarY los genes que reprimen o que la toxicidad causa, lo que resultará en señal inferior. Antes de la detección, compruebe que los recuentos de luciferasa esperados caen dentro del intervalo lineal de cada ensayo, que puede variar entre luminómetros. (Tenga en cuenta que nuestra cuenta de Renilla típicamente caer en el extremo superior de la gama lineal en nuestro ensayo.) Se encontró que el aumento de la proporción de ADN de la librería de plásmido reportero luciérnaga resultó en inducciones más altas, por lo tanto se utilizó la cantidad mínima de este reportero.
El protocolo de transfección se debe optimizar así. Elegimos 293T células por su relativa facilidad de la transfección, la eficiencia de las cuales se incrementó 50 veces con la adición de una etapa de centrifugación (Paso 3.5). El SY5Y línea dopaminérgica es más de 100 veces menos transfectable en nuestras manos, y, como se mencionó anteriormente, puede no ser óptimo para realizar el cribado sobreexpresión. Nuestro tiempo óptimo del ensayo se determinó empíricamente que 48 horas, las células se sembraron por lo tanto, a una densidad inicial baja, Lo que exige el uso de Optifect, que está diseñado para transfectar células en 10-70% de confluencia. Otras líneas de células pueden requerir diferentes densidades de partida y los diferentes reactivos de transfección. Decidimos cambiar el medio celular después de la transfección añadir antibióticos (que podrían causar toxicidad si está presente durante la transfección). Aunque esto disminuye la probabilidad de contaminación bacteriana, aumenta el costo de los materiales (especialmente las puntas de pipeta robot), por lo tanto la necesidad de este paso se debe evaluar al adaptar este protocolo a otros sistemas. Los ensayos de luciferasa se pueden utilizar con la optimización de mínimos, pero antes de realizar este ensayo en alto rendimiento con un tipo de célula diferente, verificar que las células se lisan apropiadamente por el tampón de lisis Triton. Tenga en cuenta que el Triton X-100 hace que la autofluorescencia coelenterazina. La señal de Renilla en nuestro ensayo era lo suficientemente fuerte como para trivializar este efecto, pero cuando la optimización de este ensayo para otros tipos de células, limita Triton X-100 volúmenes a la millasnimal cantidad requerida para la lisis celular.
Hemos presentado un método de detección rápido y relativamente barato para la identificación de nuevos reguladores transcripcionales de alfa-sinucleína usando células transfectadas transitoriamente con un sistema de doble luciferase reportero. Este protocolo es fácilmente modificable para dirigirse a otros genes de interés y también se puede adaptar para cualquier aplicación que requiera transfecciones de alto rendimiento, tales como la producción de lentivirus 23.
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Disclosures
Este trabajo fue apoyado por las regalías obtenidas por BacMamreagents licencia (patente EE.UU. 5.731.182).
Acknowledgments
Damos las gracias a John Darga del MGH ADN Core para la preparación de la biblioteca de detección de ADN. Christopher Chigas de Perkin Elmer prestó apoyo invalorable para nuestra Wallac 1420 luminómetro. Steven Ciacco y Martin Thomae de Agilent proporcionó apoyo para el robot Bravo. Damos las gracias a Ron Johnson y Steve Tito en el NIH para ofrecer generosamente su protocolo de ensayo de luciferasa dual resplandor.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| QIAQuick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | |
| PureLink Quick Gel Extraction Kit | Invitrogen | K2100-12 | |
| PureLink PCR Micro Kit | Invitrogen | K310250 | |
| PureLinkHiPure Plasmid Miniprep Kit | Invitrogen | K2100-03 | |
| PureLinkHiPure Plasmid Maxiprep Kit | Invitrogen | K2100-07 | |
| Bravo Robot | Agilent | - | |
| Robot Pipet Tips with Filter | Agilent | 19477-022 | |
| Robot Pipet Tips without Filter | Agilent | 19477-002 | |
| Clear-bottomed 96-well Plates | Corning | 3610 | |
| Reservoirs | Axygen | RES-SW96-HP-SI | |
| Polystyrene V-bottomed 96-well Plate | Greiner | 651101 | |
| Polypropylene V-bottomed 96-well Plate | Greiner | 651201 | |
| Adhesive Plate Covers | CryoStuff | #FS100 | |
| Reagent | |||
| Phusion DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530L | |
| BAC 2002-D6 | Invitrogen | 2002-D6 | |
| Calf Intestine Alkaline Phosphatase | Roche | 10713023001 | |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202L | |
| pGL4.10 | Promega | E6651 | |
| pGL4.74 | Promega | E6931 | |
| ElectroMAX Stbl4 Competent Cells | Invitrogen | 11635-018 | |
| Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells | Invitrogen | 18265-017 | |
| DMEM without Phenol Red | Invitrogen | 31053-028 | |
| Optifect | Invitrogen | 12579017 | |
| Ciprofloxacin | CellGro | 61-277-RF | |
| Tris-Hydrochloride Powder | Sigma | 93287 | |
| Tris-Base Powder | Sigma | 93286 | |
| Triton X-100 Pure Liquid | Fisher | BP151-100 | |
| DTT | Invitrogen | 15508-013 | |
| C–nzyme A | Nanolight | 309 | |
| ATP | Sigma | A6419 | |
| Luciferin | Invitrogen | L2912 | |
| h-CTZ | Nanolight | 301 | |
| PTC124 | SelleckBiochemicals | S6003 | |
References
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