Summary
הדור של רקמת שריר לב מיושר הוא דרישת מפתח להתאמת ההתקדמות בביולוגיה של תאי גזע למטרות שימושיות מבחינה קלינית. להלן נתאר גישת הדפסת microcontact לשליטה המדויקת של צורת תא ותפקודו. שימוש באוכלוסיות מטוהרות מאוד של תאי גזע עובריים מופקים אבות לב, אז אנחנו מייצרים רקמת שריר לב מתפקד איזוטרופי.
Abstract
אי ספיקת לב מתקדמת מהווה אתגר קליני מסופק עיקרי, הנובעת מהאובדן של תאי שריר לב קיימא ו / או תפקודיים באופן מלא. למרות טיפול תרופתי אופטימלי, אי ספיקת לב מהווה גורם מוביל לתמותה ותחלואה בעולם המפותח. אתגר עיקרי בפיתוח תרופה הוא זיהוי של מבחנים סלולריים במדויק לסכם פיזיולוגית שריר לב אנושית בריאה וחולה במבחנה. כמו כן, את האתגרים המרכזיים בביולוגית לב משובים סובבים סביב זיהוי והבידוד של אבות לב מטופל ספציפיים בכמויות רלוונטיות קליני. תאים אלה צריכים אז להרכיב לתוך רקמה פונקציונלית דומות לארכיטקטורת רקמת לב הילידים. הדפסת microcontact מאפשרת יצירה של צורות חלבון micropatterned מדויקות המזכירות ארגון מבני של הלב, ובכך לספק רמזים גיאומטריים לשלוט הידבקות התא מרחבית. בזהאנו מתארים את הגישה שלנו לבידוד של תאי שריר לב המטוהר ביותר מתאי הגזע pluripotent המבדיל במבחנה, הדור של משטחי צמיחת תא micropatterned עם חלבונים תאיים מטריקס, וההרכבה של תאי גזע המופקים מתאי שריר הלב לתוך רקמת שריר הלב איזוטרופי.
Introduction
למרות התקדמות בטיפול רפואי, אי ספיקת לב מתקדמת נשארה גורם מוביל לתמותה ותחלואה בעולם המפותח. התסמונת הקלינית נובעת מאובדן של רקמת שריר לב פונקציונלית ובהמשך חוסר יכולת של לב לא מצליח לענות על הדרישות מטבוליות של אנשים מושפעים. מאז הלב יש יכולת התחדשות מוגבלת, השתלת לב אוטולוגית היא הטיפול היחיד הנוכחי קבל קליני המכוונים במישרין חידוש רקמת לב מתפקד לאיבוד. חסרונות משמעותיים של השתלת לב, כולל מספר מוגבל של לבבות תורמים ואת הצורך בטיפול לדיכוי חיסוני לטווח ארוך, למנוע את השימוש הנרחב של טיפול זה. כתוצאה מכך, טיפול הרפואי היה עמוד התווך של טיפול בחולים עם מחלת לב. אתגר עיקרי בפיתוח תרופה הוא זיהוי של מבחנים סלולריים במדויק לסכם פיזיולוגית שריר לב בריאה וחולה, במבחנה.
ההתכנסות האחרונה של טכנולוגיית הנדסת רקמות וביולוגיה של תאי גזע מעלה אפיקים מבטיחים חדשים להתחדשות לב. יצירת רקמת שריר לב פונקציונלית ממקור מתחדש מטופל ספציפי תהיה התקדמות גדולה בתחום. היכולת זו תאפשר לפיתוח מבחנים סלולריים ספציפיים לפיתוח תרופה למחלות וגילוי והייתי להניח את היסודות לרפואת רגנרטיבית לב. תאי גזע עוברי אנושיים (ES) ומה שחשוב יותר, תאי גזע pluripotent מושרים אדם (IPS) מייצגים מקור פוטנציאלי מתחדש מטופל ספציפי של תאי אב חדרית וחדרית myocytes הבוגר. שילוב של ביולוגיה של תאי גזע והנדסת רקמות אסטרטגיות מטפל בבעיה על ידי יצירת רקמת לב מתפקדת במבחנה שיכול לשמש בפיתוח של מבחנים סלולריים לגילוי סמים או בגישות משובי לב לטיפול באי ספיקת לב מתקדם.
_content "> אתגר מרכזי בהתחדשות לב כבר זיהוי של סוג תא אופטימלי. מגוון רחב של תאים נחקר 1, אך עד היום, למרות שמבשרי קרדיוגני multipotent שונים ממקורות שונים כבר גילו, זיהוי של תא המקור שעונה על דרישות קריטיות כגון מחויבות לגורל התא myogenic, תחזוקה של היכולת להרחיב in vivo או במבחנה והרכבו לרקמת שריר לב פונקציונלית הוכיח להיות בעיה מרכזית 2. כבר תארו מערכת עכברית מהונדסת כפולה בעבר המאפשר בידוד של אוכלוסיות מטוהרות של אבות מחויבים חדרית (CVP) מתאי גזע עוברי במבחנה המבדילה מאוד. אנחנו שנוצרנו עכבר מהונדס כפול רומן שמבטא את חלבון פלואורסצנטי האדום dsRed תחת שליטתו של משפר Isl1 תלוי של הגן וMEF2c החלבון פלואורסצנטי הירוק המשופר בשליטהלב הספציפי Nkx2.5 המשפר. בהתבסס על מערכת זו שני צבעי ניאון כתב, אבות ראשונים ושניים בלב שדה מתאי גזע עוברי מתפתחים שאפשר לבודד באמצעות מיון פלואורסצנטי הופעל תא (FACS) על פי הביטוי של MEF2c וNkx2.5 גנים שלהם. CVP להידמות myocytes לב המבוסס על דפוסי הביטוי של סמני שריר לב ואיכויות מבניות ותפקודיות 3, מה מציע הבטחה גדולה למטרות התחדשות רקמת לב.למרות שיש כבר התקדמות הרבה בתחום הנדסת רקמות, מחק ארכיטקטורת הסלולר מולדת נשאר אתגר מרכזי. שיטות מקובלות להתמודדות עם אתגר זה כוללים זריעת פיגומים ביולוגיים או סינטטיים עם תאים במבחנה. בשל מספר החסרונות של פיגומים, כולל פירוק מהיר, יציבות פיזית ומכאנית מוגבלת וצפיפות הנמוכה של תאי 1,4,5, יש לנו ניסינו להנדס פיגום פחות רקמות. Altתאי לב אף יכולים לשנות microenvironment המקומי שלהם על ידי ההפרשה של חלבונים תאיים מטריקס, יש להם יכולת מוגבלת יותר להתארגן לmyocytes לב בצורת המוט בהיעדר רמזים תאיים. לפיכך, תבנית שמספקת תאי רמזים מרחביים וביולוגיים מתאימים לרקמת שריר לב מרכיבים פונקציונלית נדרשת. הדפסת microcontact מטפלת האתגר הזה על ידי מתן טכניקה פשוטה וזולה לשלוט במדויק צורת תא, ארגון ותפקוד 6-8, כל אלה הם קריטיים עבור הדור של רקמת שריר לב מתפקד מיושרת. היא כוללת שימוש בבולי microtextured polydimethylsiloxane (PDMS) עם גדלי תכונה הנעים במורד עד 2 מיקרומטר 9 שיאפשר התצהיר של חלבונים תאיים מטריקס על גבי מצעי PDMS בדפוסים מדויקים ובכך להשפיע על הידבקות התא מרחבית.
בזאת, אנו מציעים לשלב טכנולוגית bioengineering רקמות עם הגזע cell ביולוגיה ליצור רקמת שריר לב מתפקד איזוטרופי. בהתאם לכך, אנחנו כאן להפגין הגישה שפורסמה לאחרונה את הדברים הבאים: (1) את הדור של משטחי חלבון micropatterned על PDMS מצעים ידי הדפסת microcontact עבור הדור של תבנית לרקמת שריר לב בציר, (2) הבידוד של מטוהר אבות לבביים מאוד מ תאי גזע עוברי הבחנה במבחנה, ו( 3) שילוב של שתי הטכניקות ליצירת רקמת שריר לב מיושר פונקציונלית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הפרוטוקול ליצירת רקמת שריר לב מתפקד מיושרת ניתן לחלק לשלושה חלקים עיקריים. הייצור של אדון micropatterned באמצעות טכניקות ליתוגרפיה רכות אינו נחשב חלק מהפרוטוקול הבא אבל יכול להתבצע על בסיס שיטה הוקמה 6.
1. הדפסת microcontact של פיברונקטין על PDMS מצעים
- מערבב Sylgard 184 אלסטומר (Dow Corning) PDMS ב10:01 בסיס לריפוי יחס סוכן ודגת ההרכבה באמצעות ייבוש כדי לחסל את כל בועות אוויר.
- Cure PDMS נגד אדון מפוברק בעבר עם 20 מיקרומטר רחב ו2 רכסים גבוהים מיקרומטר, מופרד על ידי מרווח מיקרומטר 20 עבור 2 ימים בטמפרטורת חדר או 4 שעות על 65 מעלות צלזיוס להשיג בולי PDMS microtextured.
* אשפרה בייבוש מומלצת מאוד לחסל את כל בועות אוויר.
- ספין המעייל PDMS על גבי תלושי כיסוי זכוכית (למשל22x22 מ"מ) בשעה 5000 סל"ד עבור 2 דקות באמצעות coater ספין התקדמות לייצר דקים ואפילו PDMS מצעים של עובי מיקרומטר 15.
- נקה בולים עם אתנול 70% כדי להסיר אבק וחלקיקי לכלוך. תן להם אוויר יבש.
* חותמות ניתן להשתמש מספר פעמים, לעומת זאת, חידוש בולי PDMS על בסיס קבוע מומלץ עקב שחיקה שטח לאורך זמן.
- בולי מקום במנקה SPI פלזמה-Prep השנייה פלזמה ותהליך לדקות 1 ב275 mTorr לעבד משטחי PDMS הידרופילי.
* טיפול פלזמת חמצן צריך להיות במעקב. פעמי טיפול ארוכות יותר יכולות לגרום לפיצוח של אלסטומר.
- לעקר בולים עם אתנול 70% למשך דקת 1. יבש במהירות עם אוויר דחוס.
יש לבצע * צעדים נוספים בארון בטיחות ביולוגי כדי לשמור על סטריליות.
- כיסוי להחתים משטחים עם Fפתרון ibronectin (50 מיקרוגרם / מ"ל בDDH 2 O). תן לו לספוג לפחות 10 דקות.
- להתנער פתרון פיברונקטין מבולים ויבשים במהירות עם אוויר דחוס.
- ליצור קשר קונפורמי בין הבולים וPDMS מצעים עבור 2 דקות ולחץ בחוזקה.
- יש לשטוף את מצעי micropatterned עם DDH 2 O. אחסן אותם בDDH 2 O למקסימום של 2 שבועות ב 4 ° C, אלא אם כן השתמשתי בתחילה. חנות PDMS בולים בDDH 2 O.
2. תחזוקה של קווים כפולים מהונדסים תאי גזע עובריים
ראשית, להכין את המדיה הבאה לתאי גזע העוברי של עכבר culturing:
פיברובלסטים עכבר עוברי (MEF)-בינוני: ES תא או התמיינות בדרגה הבינונית של שינוי נשר Dulbecco (DMEM), 10% בסרום שור עוברי (FBS), 1% פניצילין-סטרפטומיצין (P / S)
תאי גזע עובריים (ESC)-בינוניים: DMEM, 15% בדרגת התא ES FBS,1% חומצות אמינו לא חיוניות (NEAA), 0.5% P / S, 0.2% לוקמיה פקטור מעכב (LIF), 0.0007% 2-Mercaptoethanol (2-ME)
- צלחות מעייל 6-גם עם 0.1% סטרילי ג'לטין בDDH 2 O ולתת לו 15 דקות לספוג ב 37 ° C.
- הוסף MEFs מaliquot מופשר ל 50 המ"ל PBS בצינור חרוטים וחובצה אותם ב -1,000 סיבובים לדקה למשך 5 דקות. Resuspend MEFs בMEF הבינוני.
- לאחר הספיחה, aspirate ג'לטין העודף ותוספת MEFs לתוך הבארות. אפשר יום 1 MEFs לצרף.
* Aliquot של 10 מ'מספיק MEFs עבור 3 צלחות 6-כן.
- כאשר MEFs צרף, להוסיף תאי גזע עוברי מaliquot מופשר ל 50 המ"ל PBS בצינור חרוטים וחובצה אותם ב -1,000 סיבובים לדקה למשך 5 דקות. תאי גזע עובריים בresuspend הבינוני ESC ולהוסיף אותם לבארות המכילות MEFs. תאי גזע עוברי בתרבית ESC בינוני עד מפגש הוא הגיע.
* ברגע שתאי גזע עוברי הגיעו מפגש, passaging הוא required כדי למנוע צמיחת יתר ולשמור על מושבות תאי גזע עוברי.
- הכן את תאי גזע עוברי לpassaging. Aspirate ESC הבינוני ולשטוף פעם אחת עם סטרילי PBS.
- לשאוב PBS ולהוסיף 500 μl של טריפסין. 3.5 דקות תהליך על 37 ° C.
- פיפטה פתרון טריפסין מעלה ומטה מספר פעמים כדי לשבור את מושבות תאי גזע עוברי, ולנטרל אותו עם 500 μl של ESC-בינוני.
- תאי גזע עוברי Passage לפי היחס הרצוי שלך, 33 μl העברה לדוגמה טובה נוסף עם הכינו MEFs בעבר למעבר 1/30. לשמור על תאי גזע עוברי בESC-בינוני.
* יחס מעבר של 1/30 מאפשר לתאי גזע עוברי, כדי להגיע לנקודת מפגש תוך 3 ימים. תאי גזע עוברי מעבר על פי לוח זמני בידול המבחנה בשלך.
3. בהתמיינות במבחנה של קווים כפולים מהונדסים תאי גזע עובריים ובידוד והזריעה של אבות קרדיולוגיים
ראשית, להכין את followiתקשורת ng דרוש להתמיינות במבחנה של תאי גזע עוברי:
הסתגלות-בינוני: הבינוני של Iscove השינוי של Dulbecco (IMDM), 15% ES FBS תא בכיתה, 1% NEAA, 0.5% P / S, 0.2% LIF, 0.0007% 2-ME
בידול-בינוני: IMDM, 15% FBS התמיינות בדרגה. 1% NEAA, 0.5% P / S, 0.35% מחומצה אסקורבית 0.1M, 0.0007% 2-ME
- התחל בהתמיינות תאי גזע עוברי מבחנה כאשר הגיעו מפגש. 10 מנות תרבות סנטימטר מעייל עם 0.1% סטרילי בג'לטין DDH 2 O ולתת לו 15 דקות לספוג ב 37 ° C.
* היה מודע משך תהליך בידול המבחנה ב. זה לוקח 8 ימים עד שניתן לבודד אבות לב. תכנן את הניסויים שלך בהתאם.
- תאי גזע עוברי קציר כמו קודם. לאחר הספיחה, aspirate ג'לטין העודף ולהוסיף כ 1/3-1/2 של השעית תאי הגזע העוברי לתרבות המוכנהמאכלים המכילים הסתגלות בינונית. תאי תרבות למשך 2 ימים.
* בחר את כמות תאי גזע עוברי, להסתגלות לפי הניסויים שלך.
- קציר מותאם תאי גזע עוברי לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל המכיל PBS באמצעות 1. 5 מ"ל של טריפסין. צנטריפוגה תאי גזע עובריים ניתקו ב1000 סל"ד למשך 5 דקות וresuspend אותם בהתמיינות בינונית.
- הפוך גופי embryoid (EBS) של כ -1,000 תאים לכל טיפת μl 10 ב15 מנות תרבות סנטימטר באמצעות פיפטה רבה ערוצית. הפוך את הצלחות והתרבות EBS כתלוי טיפין במשך 2.5 ימים ב 37 ° C.
- לאחר 2.5 ימים, הברכה EBS של 6-8 סנטימטר 15 מנות תרבות לאחד באמצעות בידול בינוני ותרבותם במשך 3.5 ימים נוספים על 37 ° C.
- לאחר 3.5 ימים, לאסוף EBS בצינור חרוטי 50 מ"ל ולתת להם לשקוע בתחתית לכ 5 דקות. תמצוץ את supernatant ולשטוף עם EBS סטרילי PBS. בואו EBS שוב שוקע לתחתית עבור approximately 5 דקות.
- לנתק EBS על ידי עיבודם עם 2. 5 מ"ל של טריפסין למשך 2 דקות באמבט מים ב 37 ° C רועד צינור ברכות. לאחר מכן יש להוסיף 2. 5 מ"ל של PBS סטרילי לפתרון טריפסין ופיפטה מעלה ומטה עם פיפטה 10 מ"ל סרולוגית כ 8-10 פעמים כדי לשבור אשכולות תא. לנטרל טריפסין עם 10 מ"ל של חיץ FACS המכיל 7.5% FBS תא או ES התמיינות בדרגה ו0.01% DAPI ב PBS.
- צנטריפוגה EBS ניתק ב1000 סל"ד למשך 5 דקות וresuspend כ 1 מ"ל של חיץ FACS. פיפטה מעלה ומטה עם פיפטה 1 מ"ל כ 8-10 פעמים כדי לשבור אשכולות תא.
* הוסף חיץ FACS בהתאם לסכום המשוער של EBS ניתק. תאים מרוכזים מדי גבוה עלולים לסתום במהלך FACS ותאים מרוכזים נמוכים מדי עלולים להאריך את זמן FACS שלא לצורך.
- העברת תאים לצינור סטרילי עגול עם תחתית מסננת תא 35 מיקרומטר להשיגהשעית תא בודדה.
- תאי גזע עוברי באמצעות בדיל מיין Cytometer תזרים FACSAria ולקבל מטוהרי אוכלוסיות של CVP.
* פתחנו אסטרטגית gating רב שלבים לבודד תאים צבעוניים מטוהרים מאוד. בקיצור, אנחנו השער הראשון במשרעת קדימה פיזור (FSC-) ומשרעת פיזור צד (SSC-) (איור 1 א). זה מאפשר לנו להפריד בין תאים שלמים מפסולת תאית. אנחנו מכן שער בFSC-קדימה ופיזור-רוחב (FSC-W) (1B איור). זה מאפשר לנו לבודד התאים singlets מכפילויות ואגרגטים סלולריים אחרים. אנחנו מכן שער בSSC-וצד פיזור-רוחב (SSC-W) (התרשים 1C). זה מגדיל את טוהר singlets הסלולרי. אנחנו מכן שער בDAPI ההכתמה לבודד תאי קיימא (DAPI שלילי) מתאים שאינם בנות קיימא (1D איור). אנחנו מכן שער בPhycoeryhthrin משרעת (PE-) וPE-Cyanine לצבוע 7 משרעת (PE-Cy7-) כדי לקבל אדום חיובי (R אמיתי + - תאים) ולהוציא תאי autofluorescent האדומים שליליים (האיור 1E). + R ו R - תאים אז מגודרים בנפרד על Amplitude fluorescein isothiocyanate (FITC-) וPE-למיין אמיתיים ירוקים חיוביים-(G +) וירוקים אמיתיים שליליים-(G -) תאים בתוך אוכלוסיות אלה (האיור 1F + 1G). התוצאה הוא 4 אוכלוסיות של תאים כדלקמן: R + G + R, + G - ר - ג + ו R - G - (איור 1H).
- Passivate micropatterned מצעים עם Pluronic 1% F-127 בDDH 2 O למשך 10 דקות. לאחר מכן, לשטוף אותם 3x עם PBS סטרילית.
* Pluronic F-127 הם שטח הידבקות תא חוסם את זה. הוא תומך בכליאה של הידבקות תא לאזור micropatterned.
- צרף אטמי PDMS סביב אזור הדוגמתולחץ בחוזקה. ואז, CVP זרע על גבי מצעי פיברונקטין micropatterned.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
FACS-טיהור בתאי גזע עוברי בדיל מבחנה התגלתה ארבעה אוכלוסיות שונות של אבות (איור 1). הנוכחות של פיברונקטין micropatterned אושרה על ידי מיקרוסקופיה immunofluorescence שמוצגת העברה מלאה של קווי פיברונקטין רציפים (איור 2). ציפוי של אבות FACS-מבודדים על micropatterns פיברונקטין הביא יישור של R + G + וחלק מהמחקר - G + אוכלוסיות. למרות Pluronic F-127 כחוסם תומך של הידבקות תא היה בשימוש, R + G - ור - ג - אוכלוסיות שלא כבדו את ארכיטקטורת איזוטרופי של פיברונקטין וגדל אל תוך החלל שבין קווי חלבון סמוכים (איור 3).
איור 1. Represe תרשים הזרימה cytometry ntative של היום 6 בתאי גזע עוברי בדיל מבחנה. () gating על פני פיזור משרעת (FSC-) ומשרעת פיזור צד (SSC-). (ב ') על gating FSC-ומפזר ברוחב קדימה ( FSC-W). (C) gating על SSC-וצד פיזור-רוחב (SSC-W). (ד ') על gating מכתים DAPI. (E) gating לPhycoeryhthrin (PE) וPE-Cyanine צבע 7 (PE- Cy7) (F ו-G) gating לAmplitude fluorescein isothiocyanate (FITC-) וPE-(H) עלילת cytometry זרימה חושפת 4 אוכלוסיות שונות של אבות:.. R + G + R, + G - ר - ג + ור - ג -. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
fig2.jpg "alt =" איור 2 "/>
איור 2. מיקרוסקופיה נציג immunofluorescence של מצעי micropatterned פיברונקטין. סרגל קנה מידה, 80 מיקרומטר.
איור 3. מיקרוסקופיה immunofluorescence נציג עוברי-() ותא המופק ES (ב) אבות FACS-בודדים לאחר 5 ימים נוספים של התרבות בmicropatterns פיברונקטין גרעינים, כחולים,. smMHC, אדום; sarcomeric α-actinin, ירוק. סרגל קנה מידה, 40 מיקרומטר. לשכפל מדומיין et al. (2009).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בפרוטוקול זה, הציג שיטה לבודדות אוכלוסיות מטוהרות של אבות קרדיוגני ולזרעם על מצעי micropatterned פיברונקטין מה מאפשר להם ליישר ולקחת צורת מוט myocyte דמוית לב. ארגון סלולרי רגיל הוא קריטי לתפקוד תקין רקמה 8,10, בפרט לרקמת שריר לב. myocytes הלבבי הוכח לפתח 11,12 השתפרו מכאניים ותכונות אלקטרו 11,13 בעת הקמת מערכים סלולריים אניזוטרופי. מאז אבות לב תרבית על מצעי micropatterned פיברונקטין להתמיין לתאי שריר לב בצורת מוט במבחנה, זה מייצג צעד apivotal בתוך bioengineering רקמת לב.
הדפסת microcontact היא כלי פשוט וזול שיכול לשמש לייצור תבניות 2-ממדיות דמויות רקמת שריר לב במבחנה. עם זאת, דפוסים יעילים ומוצלחים של extracחלבוני המטריצה ellular מסתמכים באופן קריטי על החלבון של בחירה. בעוד מגוון רחב של חלבונים שונים כבר הוחתם בהצלחה על PDMS מצעים, חלבונים מסוימים, כגון סוג קולגן אני, דורש שינוי פני שטח של PDMS מצעים לפני הדפסת microcontact 14. בנוסף, כמות לחץ המופעל על הבול, כמו גם את משך הזמן של הטבעה יכולה גם להשפיע באופן משמעותי את היעילות והאיכות של הדפסת microcontact.
שלב קריטי נוסף בפרוטוקול זה הוא השימוש בשואב פלזמה כדי לעבד את המשטחים של בולים הידרופילי PDMS. זה ידוע שהדפסת microcontact אינה מתרחשת כאשר שני בולים ומצעי PDMS לא לעבור טיפול חמצן פלזמה 15, ומספר קבוצות גילו שכוונון יכולת הרטיבות של PDMS מצעים נדרש כדי לבצע העברה של חלבון 3,6 אפשרית , בן 15. עם זאת, מצא כי הגדלת hydrophilicity שלPDMS להחתים במקום את תוצאות מצע PDMS בmicropatterns האחיד יותר חלבון באיכות גבוהה יותר, כגון קווי חלבון פחות מפריעים או חלקיים.
לפרוטוקול שהוצג, הרוחב של 20 מיקרומטר micropattern נבחר, על פי הדיווח של רוחב התא myocytes לב ילוד Murine 16. עם זאת, הייצור של micropatterns צריך להתבצע באופן התפתחותי 16-20 מינים ולב שלב תלוי במטרה למנוע השפעות מנוגדות על כדאיויות תא בשל שטח מוגבל.
הגילוי והטיהור של CVP ES-derived תא, בעיקר R + G + האוכלוסייה, ייאפשרו מחקרים אמינים בתוך bioengineering רקמת לב. יש לציין, שנצפינו אבותינו תא ES-derived הלב להיות מסוגל להרכיב רקמת שריר לב מתקשר עם השמירה על היישור הסלולרי שלהם. בהתחשב בכך שבנייה תלת ממדים פונקציונלייםרקמה היא מטרה מרכזית בתחום ההנדסה גנטית רקמות, הרקמות שלנו נוצרו דו ממדי איזוטרופי שריר הלב יכולים לשמש ביעילות לגיליונות סלולריים מרובים שכבות, כמו קבוצות אחרות שתוארו קודם לכן לסוגי תאים אחרים 21,22. עם זאת, נכון להיום, מגבלה אחת של מערכת הכתב המהונדסת היא התוצאה של התמיינות במבחנה של תאי גזע עוברי. CVP FACS הזמין, בפרט בחריפות קרדיוגני R + G + האוכלוסייה, כרגע חשבון עבור ממוצע משוערת של 0.5% מכל התאים המובחנים. לפיכך, שיפור בהתמיינות במבחנה של תאי גזע עוברי לCVP יהיה צעד חשוב לקראת יצירת כמויות מספיקות של CVP לבנות רקמת לב איזוטרופי גדולה יותר בהיקף של סיבי שריר לב מיושר longitudinally.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
עבודה זו בוצעה בחלקו במרכז ננו מערכות (CNS), חבר ברשת הלאומית לננוטכנולוגיה תשתיות (NNIN), אשר נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדע בפרס NSF לא. ECS-0335765. מערכת עצבים המרכזיים היא חלק מאוניברסיטת הרווארד.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| L-Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A4544 | Prepare 0.1M solution in ddH2O |
| Desiccator, Vacuum 10 inch | Nova-Tech International, Inc. | 55206 | |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | Life Technologies | D1306 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Thermo Scientific | SH30022.01 | |
| DPBS | Gibco | 14190 | |
| FACSAria II Flow Cytometer | BD Biosciences | ||
| Fetal Bovine Serum ES cell-grade | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
| Fetal Bovine Serum Differentiation-grade | Gemini Bio-Products | 100-500 | |
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma-Aldrich | F4759 | Solubilize to 1 mg/ml in ddH2O |
| Fisherfinest Premium Cover Glass 22x22mm | Fisher Scientific | 12-548-B | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890 | Prepare 0.1% solution in ddH2O |
| Headway Spin Coater | Headway Research, Inc. | PWM32-PS-CB15 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium | Thermo Scientific | SH30228.01 | |
| Leukemia Inhibitory Factor | Self-prepared from LIF-secreting cell lines | Prepare 500x stock solution | |
| MEM Non-Essential Amino Acids | Gibco | 11140-050 | |
| 2-Mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Mouse Embryonic Fibroblasts | Harvested from day 12-15 mouse embryos | ||
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | Prepare 1% solution in ddH2O |
| Round-Bottom Tube with 35 μm cell strainer | BD Biosciences | 352235 | |
| SPI Plasma-Prep II Plasma Cleaner | SPI Supplies | 11005-AB | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| Vacuum Gauge | SPI Supplies | 11019-AB |
References
- Alcon, A., Cagavi Bozkulak, E., Qyang, Y. Regenerating functional heart tissue for myocardial repair. Cell Mol. Life Sci. , (2012).
- Chien, K. R., Domian, I. J., Parker, K. K. Cardiogenesis and the complex biology of regenerative cardiovascular medicine. Science. 322, 1494-1497 (2008).
- Domian, I. J., et al. Generation of functional ventricular heart muscle from mouse ventricular progenitor cells. Science. 326, 426-429 (2009).
- Chan, B. P., Leong, K. W. Scaffolding in tissue engineering: general approaches and tissue-specific considerations. Eur. Spine J. 17, Suppl . 4. 467-479 (2008).
- Eschenhagen, T., Eder, A., Vollert, I., Hansen, A. Physiological aspects of cardiac tissue engineering. Am. J. Physiol Heart Circ Physiol. 303, H133-H143 (2012).
- Feinberg, A. W., et al. Muscular thin films for building actuators and powering devices. Science. 317, 1366-1370 (2007).
- Li, F., Li, B., Wang, Q. M., Wang, J. H. Cell shape regulates collagen type I expression in human tendon fibroblasts. Cell Motil. Cytoskeleton. 65, 332-341 (2008).
- Sarkar, S., Dadhania, M., Rourke, P., Desai, T. A., Wong, J. Y. Vascular tissue engineering: microtextured scaffold templates to control organization of vascular smooth muscle cells and extracellular matrix. Acta Biomater. 1, 93-100 (2005).
- Isenberg, B. C., Wong, J. Y. Building structure into engineered tissues. Materials Today. 9, 54-60 (2006).
- Athanasiou, K. A., Zhu, C., Lanctot, D. R., Agrawal, C. M., Wang, X. Fundamentals of biomechanics in tissue engineering of bone. Tissue Eng. 6, 361-381 (2000).
- Feinberg, A. W., et al. Controlling the contractile strength of engineered cardiac muscle by hierarchal tissue architecture. Biomaterials. 33, 5732-5741 (2012).
- Black, L. D. 3rd, Meyers, J. D., Weinbaum, J. S., Shvelidze, Y. A., Tranquillo, R. T. Cell-induced alignment augments twitch force in fibrin gel-based engineered myocardium via gap junction modification. Tissue Eng. Part A. 15, 3099-3108 (2009).
- Kim, D. H., et al. Nanoscale cues regulate the structure and function of macroscopic cardiac tissue constructs. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 565-570 (2010).
- Evans, N. D., et al. Substrate stiffness affects early differentiation events in embryonic stem cells. Eur. Cell Mater. 18, 1-14 (2009).
- Tan, J. L., Liu, W., Nelson, C. M., Raghavan, S., Chen, C. S. Simple approach to micropattern cells on common culture substrates by tuning substrate wettability. Tissue Eng. 10, 865-872 (2004).
- Leu, M., Ehler, E., Perriard, J. C. Characterisation of postnatal growth of the murine heart. Anat. Embryol. (Berl). 204, 217-224 (2001).
- Li, F., Wang, X., Capasso, J. M., Gerdes, A. M. Rapid transition of cardiac myocytes from hyperplasia to hypertrophy during postnatal development. J. Mol. Cell Cardiol. 28, 1737-1746 (1996).
- Porrello, E. R., et al. Heritable pathologic cardiac hypertrophy in adulthood is preceded by neonatal cardiac growth restriction. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 296, 672-680 (2009).
- Snir, M., et al. Assessment of the ultrastructural and proliferative properties of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 285, H2355-H2363 (2003).
- Ohler, A., et al. Two-photon laser scanning microscopy of the transverse-axial tubule system in ventricular cardiomyocytes from failing and non-failing human hearts. Cardiol. Res. Pract. 2009, 802373 (2009).
- Takahashi, H., Nakayama, M., Shimizu, T., Yamato, M., Okano, T. Anisotropic cell sheets for constructing three-dimensional tissue with well-organized cell orientation. Biomaterials. 32, 8830-8838 (2011).
- Williams, C., Xie, A. W., Yamato, M., Okano, T., Wong, J. Y. Stacking of aligned cell sheets for layer-by-layer control of complex tissue structure. Biomaterials. 32, 5625-5632 (2011).
