In het huidige protocol, demonstreren we een zeer efficiënte en kosteneffectieve kleinschalige eiwitreiniging methode, die de zuivering van recombinante eiwitten mogelijk maakt door de unieke combinatie van een splitsbaar GST-tag en een kleine His-tag.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
GST-Zijn zuivering: een twee-staps Affiniteitszuivering Protocol Meegevende Full-length gezuiverde eiwitten
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Toets assays Enzymology de biochemische karakterisatie van eiwitten in vitro noodzakelijk hoge concentraties van het gezuiverde eiwit van belang. Eiwitzuivering protocollen te efficiency, eenvoud en kosteneffectiviteit 1 combineren. Hier beschrijven we de GST-His Werkwijze nieuw kleinschalig affiniteit zuiveringssysteem voor recombinante proteïnen, op basis van een N-terminale Glutathion Sepharose tag (GST) 2,3 en een C-terminaal tag 10xHis 4, die beide gefuseerd het eiwit van belang. De laatste construct wordt gebruikt om baculovirussen genereren voor infectie van Sf9-geïnfecteerde cellen voor eiwitexpressie 5. GST is een vrij lange tag (29 kDa) die dient om de zuivering efficiëntie te garanderen. Toch kan het fysiologische eigenschappen van het eiwit te beïnvloeden. Daarom is het vervolgens afgesplitst het eiwit met het enzym PreScission 6. Om maximale zuiverheid te verzekeren en de gesplitste GST te verwijderen, wevoegde een tweede affiniteitszuiveringsfase gebaseerd op de relatief kleine His-tag. Belangrijk is onze techniek waarbij twee verschillende labels aan weerszijden van de twee uiteinden van het eiwit, dat een efficiënt middel om gedegradeerde eiwitten te verwijderen en bijgevolg verrijkt full-length eiwitten. De hier gepresenteerde methode heeft een dure instrumentale setup, zoals FPLC niet nodig. Daarnaast hebben we opgenomen MgCl2 en ATP wast om heat shock protein onzuiverheden en nucleasebehandeling afschaffen verontreinigende nucleïnezuren te verwijderen. Samengevat, de combinatie van twee verschillende labels weerszijden van de N-en C-terminale en de mogelijkheid om splitsen van een van de labels, garandeert het herstel van een sterk gezuiverd en full-length eiwit van belang.
Inleiding
De zuivering van recombinante eiwitten is cruciaal om fundamentele vragen in de biochemie aan te pakken. Gebruikelijke manieren eiwitzuivering zoals ionenuitwisselingschromatografie en gelfiltratie afhankelijk fysische eigenschappen van het doeleiwit zoals de iso-elektrische punt en heffingen of grootte, respectievelijk. Deze proteïne kenmerken gedeeld door een verscheidenheid van eiwitten, die aanzienlijk de kans verontreinigende proteïnen in gebruikelijke eiwitzuivering strategieën toe. Dit probleem kan worden omzeild door het gebruik van meerdere kolommen zuivering, hetgeen tijdrovend. Tegelijkertijd, deze chromatografie methoden vereisen dure experimentele opstel....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Productie van Recombinant Baculovirus
Baculovirussen worden gegenereerd met de Bac-to-Bac Baculovirus Expression System van Invitrogen voornamelijk volgens protocol van de fabrikant met slechts geringe wijzigingen:
- Een gewijzigde pFastBac 1 vector (Gibco, leven) werd opgericht met de GST en His-labels (figuur 2). De multikloneringsplaats (MCS) van een PET-52b (+) vector (Novagen), met daarin een 10xHis-tag, werd ingebracht in de MCS van een pFastBac 1 vector om pFastBac 1-Strep-10xHis genereren. De pET-52b (+) MCS sequentie werd met PCR geamplificeerd tussen de Xbal en Blpl restrictieplaatsen, het toevoegen ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Teneinde de doelmatigheid van de GST-His zuiveringsprotocol illustreren we gezuiverd Rec14 een S. pombe eiwit van 32,9 kDa. De Rec14 cDNA werd gekloneerd in onze gemodificeerde pFastBac 1 vector waardoor de toevoeging van GST-en His-tag aan de N-en C-termini, respectievelijk (figuur 1A). Recombinant baculovirus werden vervolgens bereid en gebruikt om SF9 geïnfecteerde cellen te infecteren voor eiwitexpressie. De oplosbare cellysaten werden geïncubeerd met GST-parels en gebonden eiwitten werden .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De GST-His zuiveringsprotocol hier gepresenteerde geschikt voor de zuivering van een breed gebied van afmetingen van recombinant eiwit: We succesvol gezuiverd Li RAD51 (41kDa), piBRCA2 (120kDa), PALB2 (130kDa), en een instabiele hoog molecuulgewicht eiwit Leishmania infantum: Li BRCA2 (125kDa) 6,9. Bovendien, de eiwitten gezuiverd met dit protocol waren biochemisch actief 6. Het succes van deze werkwijze hangt uitsluitend af van de expressie, oplosbaarheid en stabiliteit van het g.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Dankbetuigingen
Wij danken Anne-Marie Dion-Cote voor beraadslagingen die leiden tot de ontwikkeling van de methode. JK en RB zijn FQNRT doctorale geleerden, M.-MG is een Vanier CIHR geleerde, en J.-YM is een FRSQ senior onderzoeker. Dit werk werd ondersteund door fondsen van de Natural Sciences and Engineering Research Council om JY. M.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| REAGENTS | |||
| E.Coli DH10Bac (competent) | Invitrogen | ||
| Bac-to-Bac Baculovirus Expression System | Invitrogen | ||
| Maxi Prep Kit | Qiagen | 12163 | Solution I en II |
| Ultra Pure Bluo-Gal | Gibco (Life) | 15519028 | |
| IPTG | Gibco (Life) | 15529019 | |
| Sf9 infected cells | ATCC | CRL-1711 | |
| PreScission enzyme | GE Healthcare | 27084301 | |
| Grace's infected medium supplemented | Gibco (Life) | 11605-094 | |
| Fetal Bovine Serum characterized | Hyclone | SH30396.03 | |
| P/S (Penicillin-Streptomycin) | Gibco (Life) | 15070-063 | |
| Glutathione Sepharose resin | GE bioscience | 17075605 | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | 11873580001 | |
| Talon resin | Clontech | 635504 | |
| Imidazole | BioShop | 288324 | |
| Gentamicin | Gibco (Life) | 15710064 | |
| Polyclonal GST-antibody | Production in house | ||
| Monoclonal 6X-His-antibody | Clontech | 631212 | |
| EQUIPMENT | |||
| Dounce homogenizer (tight) | Wheaton | 357546 | |
| Sonicator (Fisher dismembrator) | Fisher | Model 150 | |
| Dialysis bag (50 mm) | Fisher Scientific | 2115217 |
Referenties
- Lichty, J. J., Malecki, J. L., Agnew, H. D., Michelson-Horowitz, D. J., Tan, S. Comparison of affinity tags for protein purification. Protein Expr. Purif. 41, 98-105 (2005).
- Thain, A., Gaston, K., Jenkins, O., Clarke, A. R. A method for the separation of GST fusion proteins from co-p....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
