Summary
사구체 여과율 (GFR)의 측정은 신장 기능 평가를위한 황금 표준입니다. 여기서 우리는 두 단계 지수 붕괴 모델 플라즈마 GFR의 계산에 하나의 알약 주입, 형광 이소 티오 시아 네이트의 결정 (FITC) 이눌린을 사용하여 의식 쥐 GFR의 결정을 허용하는 높은 처리량 방법을 설명합니다.
Abstract
사구체 여과율 (GFR)의 측정은 신장 기능 평가의 황금 표준입니다. 현재 연구자들은 내생 바이오 마커 크레아티닌 또는 외생 적 적용 방사성 표지 이눌린 (3 H, 14 C)의 수준을 측정하여 GFR을 결정합니다. 크레아티닌 ~ 50 총 신장 크레아티닌 배설 % 따라서 크레아티닌에 대한 근위 세뇨관 분비 계정을 신뢰할 수 GFR 마커 아니라고 상당한 단점이있다. 수행 된 실험에 따라 청소율이 정맥 하나의 알약 주입 또는 연속 주입 (정맥 또는 삼투 minipump)에 의해 결정될 수있다. 두 방법 모두 각각 혈장 또는 혈장과 소변의 컬렉션을 필요로합니다. 방사성 표지 이눌린의 다른 단점은 동위 원소의 사용, 동물의 시간이 소요되는 수술 준비 및 터미널 실험의 요구 사항을 포함한다. 여기에 우리의 하나의 알약 주입을 사용하는 방법을 설명형광 이소 티오 시아 네이트 - (FITC)로 표시 이눌린 및 희석 혈장의 1-2 μL에서의 형광 측정. 마우스 당 8 혈액 컬렉션으로, 두 구획 모델을 적용함으로써, 특수 작업 흐름 프로토콜을 사용하여 하루 24 생쥐에서 GFR을 측정 할 수 있습니다. 이 메서드는 비 구속하고 깨어 마우스에서 수집되는 모든 혈액 샘플로 간단 isoflurane을 마취가 필요합니다. 또 다른 장점은 몇 개월 치료 (즉,식이 변화, 약물 응용 프로그램과 쌍으로 실험을 수행)의 기간 동안 쥐를 따라 할 수 있다는 것입니다. 우리는 측정 GFR이 기술은 마우스 신장 기능을 공부 다른 연구자에게 유용하고 혈장 크레아티닌과 혈액 요소 질소 등의 신장 기능을 추정 덜 정확한 방법을 대체 할 수 있기를 바랍니다.
Introduction
사구체에서 혈장 ultrafiltrate의 형성 속도는 신장 기능 (사구체 여과율, GFR) 평가의 기초가되었다. GFR을 결정하는 이상적인 마커는 자유롭게 여과 분비되거나 재 흡수 둘과 대사되지 않아야합니다. 이러한 동작은 이눌린에 대한 사실이 발견되었으며, 이눌린 통관 GFR 3의 결정을위한 황금 표준이되었습니다. 크레아티닌 클리어런스가 광범위 인간과 동물의 GFR의 척도로 사용되는 반면, 크레아티닌은 이상적인 GFR 마커의 요구 사항을 충족하지 않습니다. 약 10 - 인간의 크레아티닌 청소율의 40 %는 활성 세뇨관 분비 1, 11의 결과이며, 크레아티닌 신장 분비는 마우스와 쥐 4, 7, 9, 22에서 눈에 띄는입니다. 신기능 장애는 GFR 1, 2의 마커로 그 값을 제한 크레아티닌의 세뇨관 분비를 증가하는 것으로 알려져있다. 우리는 이전에 해당 유기 음이온 수송 이소를 보이고있다3 (OAT3)는 쥐 신장의 크레아티닌 분비 22에 기여한다. 하지만, 이눌린 통관은 일반적으로 방사성 표지 이눌린 (3 H, 14 C)의 사용을 필요로합니다. 이눌린의 방사능 측정은 마취와 의식 모두 생쥐에서 사용하지만, 다수의 안전 규정 및 방사성 동위 원소의 사용으로 인한 엄격한 처리 문제의 단점을 비호 할 수 있습니다. 그 라인을 따라, GFR의 결정에 대한 수술 통관 준비 시간이 소요뿐만 아니라 자연 단자입니다. 1999 년 로렌스 등. 12 마취 생쥐의 단일 네프론 GFR의 마커로 FITC - 이눌린을 소개했다. 5 년 후 치 등. 15 FITC - 이눌린을 사용하여 의식 마우스에서 전체 신장 GFR을 결정했다. 다른 프로토콜은 현재 의식 마취 생쥐에서 GFR을 측정하는 외생 적 마커로 FITC - 이눌린을 사용하고 있습니다. 이 프로토콜은 형광 detecti를 사용하여 방사성 이눌린의 감도를 유지온 방사성 표지 마커 작업의 단점을 우회. FITC - 이눌린 분석은 Nanodrop 분광 3300 fluorospectrometer의 microvolume 기능을 활용하기 위해 다른 사람 7, 8, 우리 22, 23으로 바뀌 었습니다. 이 GFR 측정 당 <100 ㎕의 혈액에 필요한 전체 샘플 볼륨을 줄일 수 있습니다.
방법이 문서에서 제공하는 높은 처리량 프로토콜로, 우리는 하루 최대 24 의식 생쥐에서 측정 GFR의 가능성을 보여줍니다. 이 기술은 쥐 GFR을 공부 다른 연구자에게 도움이 될 수 있고 우리는이 같은 크레아티닌과 혈액 요소 질소 등의 신장 기능 지표와 같은 덜 정확한 방법을 대체 할 수 있기를 바랍니다.
Protocol
1. 솔루션
- 0.85 % 염화나트륨 : 8.5 g의 NaCl / 1리터 DDH 2 O (8.5 g / L).
- 0.5 몰 / L HEPES pH를 7.4 (DDH 2 0 0.5 L의 HEPES의 59.6 g을 용해하고 10 N NaOH를 사용하여 pH를 7.4로 조정).
2. FITC - 이눌린 주입 용액의 조제
- 완전히 용해 될 때까지 90 ° C로 가열하여 0.85 % 염화나트륨 (보통 100 ㎎ / 2 ㎖ 0.85 % 염화나트륨)의 5 % 용액을 준비하고 용해 FITC - 이눌린 무게.
- 용해 FITC - 이눌린 솔루션 노트 몸무게.
- 투석 막 20cm 조각 (분자량 컷 - 오프 : 1,000)를 잘라 막에서 잔류 NaN의 3을 제거하고 그 후 몇 번 플러시 30 분 DDH 2 O에 넣어.
- 투석 막에 FITC - 이눌린을 용해 채우고 폐쇄 제대로 밀봉하십시오.
- 전체 투석 막 무게.
- 1 L 0.85 % 염화나트륨 용액에 투석 막 넣고 RO 24 시간 동안 빛을 보호 천천히 저어OM 온도.
- 다시 전체 투석 막 달아 (물이 삼투 막과 언 바운드 FITC로 이동하거나, FITC - 이눌린에게 <1,000 분자량이 막 밖으로 이동합니다 바인딩 된 것이다 따라서 FITC - 이눌린의 농도가 크게 감소합니다) 새 농도를 계산 .
- 새로운 FITC - 이눌린 농도 (C)는 다음 공식을 사용하여 계산됩니다 : C = N / V, 여기서 n = 초기 FITC - 이눌린 양, V = 새 볼륨 (투석 플러스 초기의 볼륨 전후 투석 튜브의 무게의 차이 FITC - 이눌린 솔루션).
- 0.22 μm의 주사기 필터를 통해 여과 투석 FITC - 이눌린 솔루션을 소독 사용하기 전에.
- FITC - 이눌린 4에 빛 (알루미늄 호일)으로부터 보호 유지 ° C. 투석과 FITC - 이눌린 소독은 최고 2 주까지 사용할 수 있습니다. FITC - 이눌린이 몇 분 동안 90 ° C에서 재 가열하여 용해 할 수있는 참여했다.
참고 : 사용하는 경우투석을 필요로하지 않습니다 FITC-sinistrin 16-18, 투석에 필요한 모든 단계를 건너 뛸 수 있습니다.
3. 주입과 혈액 수집
- 실험을하기 전에 생쥐의 체중 (BW)를보십시오.
- isoflurane을 함께 간단히 마우스를 마취.
- 6 생쥐의 높은 처리량을 그림 3에서 제공하는 프로토콜을 따르십시오.
- (처음에 대한 바늘 G30 ½로 전환 한 후 바늘 G26 ½를 사용하여 100 μL 해밀턴 주사기에서 공기 방울을 제거 바늘에 G30 ½을 사용하여 retroorbital 신경총 24에 투석 FITC - 이눌린 2 G / μL BW를 주입 주사).
- 일단 가위로 쥐의 꼬리 1mm를 잘라 35, 15, 10, 5, 3에서 7 혈액을 수집, 56 NA-헤파린 minicapillaries에서 주사 후 75 분. 차 물개를 가진 혈액 수집 한 후 밀봉 minicapillaries.
- 빛으로부터 보호 샘플을 보관하십시오.
- 밀봉 minicapillaries 내부 hemato을 넣어적중 모세와 5 분 원심 분리기.
- 0.2 ML 튜브에 pipetting하여 다이아몬드 커터 및 전송 전체 플라즈마를 사용하여 minicapillaries 휴식.
- 새로운 0.2 ML 튜브 (샘플 4에서 하룻밤 저장할 수 있습니다 ° C 형광 측정)에서 플라즈마의 2 μL, 18 μL 0.5 몰 / L HEPES (산도 7.4)를 사용하여 1:10 희석합니다.
- 중복의 Nanodrop 분광 3300로 희석 샘플 2 μL를 측정한다. 악기에 대한 설명과 사용법은 여기에 5 설명합니다.
4. 표준의 준비
- 헤파린 코팅 헤마토크릿 모세관에서 동일한 배경 변형 쥐에서 혈액을 수집, 스핀 다운, 0.5 몰 / L HEPES (산도 7.4)에 1:10 희석, 보통 80 μL 플라즈마 + 720 μL HEPES.
- 다음과 같은 표준 희석을 묽은 마우스 플라즈마 FITC - 이눌린 주입 용액을 희석 :
1:10 10 ㎕의 희석 FITC - 이눌린 솔루션 + 90 ㎕의 희석 마우스 플라즈마
1:100 : 10 & 무, L (1시 10분) 솔루션 + 90 ㎕의 희석 마우스 플라즈마
1:1,000 : 10 μL (1:100) 솔루션 + 90 ㎕의 희석 마우스 플라즈마
1:2,000 : 30 μL (1:1) 용액 + 30 ㎕의 희석 마우스 플라즈마
1:10,000 : 10 μL (1시 5분) 솔루션 + 40 ㎕의 희석 마우스 플라즈마
1:20,000 : 20 μL (1:1) 용액 + 20 ㎕의 희석 마우스 플라즈마
1:100,000 : 10 μL (1시 5분) 솔루션 + 40 ㎕의 희석 마우스 플라즈마
표준 농도는 투석에 따라 달라집니다 항상 FITC - 이눌린의 각 준비 다를 수 있습니다. 그것은 새로운 표준 곡선 매회 농도를 입력 할 필요가 있습니다. - 여기에서 15, 20에서 설명하고 대표 결과 섹션에서와 같이 2 단계 지수 감쇠 함수를 사용하여 해당 소프트웨어 (예 : GraphPad 프리즘)와 GFR을 계산하기 위해 데이터를 분석합니다.
Representative Results
GFR은 다음과 같은 공식을 사용하여 계산됩니다 :
GFR = N / (A/K1 + B/K2), 여기서
N = 주입 양 (N = C • V, 여기서 C = FITC - 이눌린 농도, V = 주입 부피)
A = Span1는 제거의 y 절편
제거를위한 상수 K1 = 붕괴
B = Span2, y 절편 분포
배포 K2 = 붕괴 상수
주 : A, K1, B와 K2는 GraphPad 프리즘, 두 단계 지수 붕괴를 분석 할 수있는 모든 소프트웨어에 의해 제공 약어이다를 사용할 수 있지만, 다른 과학 소프트웨어는 다른 약어를 사용할 수 있습니다.
플라즈마 FITC - 이눌린 농도를 기반으로 2 단계 지수 감쇠 곡선 맞춤을 채용하여, 그림 1에 표시된 것과 유사한 곡선을 얻을 수 있어야합니다. 위와 같이 식 (에 의해 GFR을 계산하고, 여기에 설명 <)> 20 한모금은 제 1 형 당뇨병 (그림 2)와 생쥐에서 발견 신장 기능 15 사구체 hyperfiltration 8, 23의 손상을 감지 할 수 있습니다.
그림 1. 의식 생쥐에서 GFR을 측정하기 위해, 단일 복용량 정맥 주사 후 FITC - 이눌린의 플라즈마 동역학이 사용됩니다. GFR 계산을 위해, 두 구획 모델이 사용됩니다. 두 구획 모델에서 초기 급속한 붕괴 단계는 세포 외액에 혈관 구획에서 FITC - 이눌린 재배포를 나타냅니다. FITC - 이눌린 농도 느린 붕괴와 이후 단계는, 주로 혈장에서 조직의 허가를 반영합니다.
그림 2. DetectioN 야생 형 생쥐의 당뇨병 hyperfiltration의. 당뇨병은 (STZ, 5 일 연속 50 ㎎ / ㎏) 스트렙토 조 토신으로 복강 내 응용 프로그램에 의해 유도 된 I를 입력합니다. GFR은 전 (기초)와 오주 당뇨 유도 후 결정되었다. tubuloglomerular 피드백으로 인해, 근위 재 흡수의 주요 증가가 초기 당뇨병 hyperfiltration 21 야생형 생쥐에서 재현 연구 결과가 발생합니다 (N = 10, p <0.01 대 기초 같은 마우스).
그림 3. 6 마우스 세트 GFR 측정. 하나의 알약 주입 방법으로 전체 신장 사구체 여과율을 측정하기위한 흐름도는 8 혈액 샘플은 10, 15, 35, 56 및 75 분 후, 7, 3, 5에서 수집해야합니다 FITC - 이눌린 주입. 숫자는 시점을 나타냅니다. 괄호 안의 숫자는 표본 수를 나타냅니다. 빨간색 세로 줄의 왼쪽 시점 주입을 나타냅니다시간 포인트 (0에서 11, 22, 33, 44, 55 분). 각각의 마우스는 다른 색으로 표시됩니다. 연속 혈액 컬렉션을 얻으려면 화살표를 따르십시오. 회색 상자 옆에 마우스를 주입하기 전에 isoflurane을 마취에 대한 준비를해야 할 때 나타냅니다. 이 프로토콜을 사용하면 다른 마우스에서 2 혈액 컬렉션 사이의 최소 시간은 1 분입니다.
Discussion
본 연구는 두 단계 지수 붕괴 8 혈액 샘플의 형광 단일 알약 주입 및 분석에 의한 의식 쥐 GFR의 결정을위한 방법을 설명합니다. 1 마우스 GFR 측정은 75 분 정도 소요. 특수 흐름 차트를 사용하여, 그것은 130 분의 6 생쥐의 GFR을 측정 할 수 있습니다. 그것은 하루 최대 4 시간이 흐름 차트 프로토콜을 반복하고 24 생쥐에서 GFR을 측정 가능합니다. 그것은 빠르고 조사관 꼬리 정맥 천자에 비해 수행하기위한 쉽게 작은 꼬리 싹둑보다는 꼬리 정맥 천자에서 혈액을 수집 할 수 있도록 우리는이 방법을 수정했습니다. 10 ㎕의 적혈구 모세 혈관 1:10 희석을 사용함으로써, <100 μL에 필요한 혈액의 전체 양을 줄일 수 있습니다. 마지막으로, 형광 희석 시료의 1-2 μL에 형광 측정을 할 수 Nanodrop 분광 3300 fluorospectrometer를 사용하여 측정됩니다. 이 방법은 관심 investigato 줄 것이다라 실제 GFR 값입니다. 대조적으로, 마우스에있는 크레아티닌 측정은 "크레아티닌 블라인드 범위"를 특정하고 민감한 결정에 관한 문제 등 여러 가지 약점을 가지고 있습니다. 신장 기능의 50 %가 19 손실 될 때까지 혈청 크레아티닌이 정상 범위에 남아 있기 때문에 "크레아티닌 블라인드 범위는"GFR을위한 마커로 그 기능을 제한합니다. 유전자 X의 녹아웃 마우스를 가정하는 것은 야생형 마우스에 비해 상당히 낮은 GFR (40 %)이있을 것입니다 : 여러 연구자들은 신장 생리와 병태 생리를 연구하는 그들의 연구에서 유전자 변형 생쥐를 이용하기 때문에,이 같은 문제를 품는다 혈장 크레아티닌을 비교하여 간단한 검사는 이러한 차이를 감지하지 않을 것입니다. GFR 결정의 좋은 정확한 방법에 대한 필요성이 GFR의 차이가 작아 더 중요됩니다.
마우스 상업적 방해 자신의 혈장과 소변에서 비 크레아티닌 chromagens의 높은 농도가사용 가능한 크레아티닌 분석. 결과적으로, 플라즈마 알칼리성 picrate의 제피 반응 과대 크레아티닌 농도를 기반으로하는 분석은 고성능 액체 크로마토 그래피 (HPLC) 결정 6, 13와 비교. 또 다른 한계는 혈청 크레아티닌은 HPLC 결정에 비해 아래에 몇 가지 상업적으로 이용 가능한 분석의 검출 한계입니다. 그러나 효소 반응 조사를 사용하여 마우스 10, 22 플라즈마 크레아티닌를 확인할 수 있었다.
비슷한 범위에서 GFR이 유사한 단일 알약 주입 방법뿐만 아니라 소변 FITC - 이눌린 통관 14을 사용하여 의식 생쥐에서 발견되었다. 자신의 프로토콜과는 대조적으로, 꼬리 싹둑를 사용하여 우리의 프로토콜은 특별한주의가 꼬리 정맥 또는 복재 정맥 천자에 비해 혈관의 무결성을 유지하기 위해 필요하지 않습니다. FITC - 이눌린 기반 소변 / 혈장 클리어런스의 경우는 수술 두 삼투 마일을 이식 할 필요가있다nipumps. 두 펌프는 배경에서 명확하게 구별 충분히 높은 정상 상태 플라즈마 FITC - 이눌린 농도를 달성하기 위해 필요합니다. 이것은 또한 완전하고 초과 소변 수집을위한 신진 대사 케이지의 사용을 필요로합니다. 케이지 그렇지 않으면 세척없이 발생 FITC - 이눌린의 25-37%의 손실을 고려하여 세척해야합니다.
이 FITC - 이눌린 방법을 사용하는 함정이 제한됩니다. 조사자는 다음 사항에 유의해야합니다 (내가) FITC-솔루션의 주입에 사용되는 주사기에 기포가 없는지 보장, (ⅱ) 전체 구후 주사 주입 양이 계산 된 GFR을 결정하기 때문에 달성되어야하며 ( ⅲ) 쥐, 그래서 신장의 농도 능력의 결과로 매우 높은 FITC - 이눌린 농도해야합니다 소변과 혈액 샘플을 오염 75 분 GFR 실험을하는 동안 대부분 소변을 피할 것입니다.
일반 이점 오F이 FITC - 이눌린 방법은 다음과 같습니다 (나)는 (II)는 (III) 분석은 의식 생쥐에서 수행 할 수 있습니다, 같은 마우스에서 측정을 여러 번 반복 할 수있다, 비 방사능 기법이다 ( IV)가 더 소변 수집이 필요하지 않습니다, 그리고 (v) 높은 처리량 옵션을 활용할 수 있습니다. 단일 러스 주입 단점이 가능하고 특별한 소형 장치 (18)를 사용하여 transcutaneously 측정 할 수있는 더 나은 FITC 마커, FITC-sinistrin를 사용하여 극복 할 수 FITC - 이눌린의 투석에 대한 필요성을 포함합니다. GFR을 측정하더라도, 그것은이 방법으로 액체 또는 이온의 분수 배설물을 측정 할 수 없습니다.
함께 찍은,이 방법은 의식 생쥐에서 GFR 측정을위한 높은 처리량 방법의 가능성을 제공합니다. 따라서,이 기술은 쥐의 신장 기능을 결정에 관심이있는 다른 연구자에 대한 관심의 대상이 될 수 있습니다.
Disclosures
저자는 써모 피셔 과학으로 본 출판물의 비용을 충당하기 위해 자금을 받았다.
Acknowledgments
나는이 원고의 중요한 읽기 박사 제시카 도밍 게즈 RIEG 감사합니다. 이 작품은 미국 심장 협회 (과학자 개발 그랜트 10SDG2610034), 신장의 미국 사회의 칼 W. Gottschalk 연구 그랜트, 당뇨병의 국립 연구소와 급성 신장 손상 연구를위한 소화기 및 신장 질환 오브라이언 센터 (에 의해 지원되었다 P30DK079337), 그리고 재향 군인 원 호국.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| FITC-inulin | Sigma-Aldrich | F3272 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H7706 | |
| Isoflurane | Webster Veterinary | 78366551 | |
| Dialysis membrane (MWCO 1000) | Spectrum Laboratories | 132636 | |
| Membrane closure | Spectrum Laboratories | 132736 | |
| 80 μl Hematocrit capillaries | Drummond Scientific | 22362566 | |
| Hematocrit centrifuge | IEC | Micro-MB | |
| 10 μl Na+-Heparin minicaps | Hirschmann | 9000210 | |
| Syringe (100 μl) | Hamilton | 80601 | |
| Fluorospectrometer | Thermo-Fisher Scientific | NanoDrop 3300 | |
| Filter (0.22 μm) | Spectrum Laboratories | 880-26464-UE | |
| Sealant | Châ-seal | 510 | |
| Needles (G26 ½ and G30 ½) | Becton Dickinson | 305111 & 305106 |
References
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