Summary
Cette étude décrit une technique efficace pour isoler et traiter des tissus gingivaux de la cavité buccale de la souris afin de produire une culture unicellulaire. Les cellules obtenues peuvent en outre être utilisés pour l'analyse par cytométrie en flux et des études moléculaires.
Abstract
Nous avons développé une technique pour isoler et traiter le tissu gingival murin pour la cytométrie en flux et des études moléculaires précisément. La gencive est un tissu unique et important d'étudier les mécanismes immunitaires, car il est impliqué dans la réponse immunitaire de l'hôte contre le biofilm oral qui pourrait provoquer des maladies parodontales. En outre, la proximité de la gencive au tissu osseux alvéolaire permet également l'étude du remodelage osseux dans des conditions inflammatoires. Notre méthode donne grande quantité de cellules immunitaires qui permet d'analyser même les populations de cellules rares telles que les cellules de Langerhans et des cellules T régulatrices comme nous l'avons démontré précédemment 1. Souris emploient pour étudier les réponses immunitaires locales impliquées dans la perte osseuse alvéolaire au cours des maladies parodontales est avantageux en raison de la disponibilité de divers outils immunologiques et expérimentale. Néanmoins, en raison de leur petite taille et l'accès relativement gênant pour la gencive murin, de nombreuses études éviter examen de this tissus critique. La méthode décrite dans ce travail pourrait faciliter l'analyse gingival, qui nous l'espérons augmenter notre sous-estimer sur le système immunitaire par voie orale et son rôle au cours de maladies parodontales.
Introduction
Gencive est le tissu mou qui entoure la partie du col de la dent, et couvre le processus alvéolaire (figure 1). La gencive est un type de muqueuse masticatoire qui peuvent être divisées en épithélium de la muqueuse et des tissus conjonctifs (aussi connu comme sous-muqueuse ou de la lamina propria). La structure anatomique de la gencive et des dents adjacentes permet aux bactéries de résider et de développer la plaque (biofilm) qui défie constamment le système immunitaire local. En conséquence, la réponse inflammatoire se développe dans la gencive, qui dans certaines circonstances devient destructive - un état appelé maladies parodontales 2. Fondamentalement, les pathologies parodontales plaque induits peuvent être divisés en gingivite et la parodontite. La gingivite représente un état réversible de la réponse inflammatoire locale qui se limite à la gencive. La parodontite, d'autre part, est un processus de destruction irréversible dans lequel le dispositif de fixation (os alvéolaire, parodontaleligament, cément et la gencive) est détruit 3.
La gencive a été proposé pour servir à la fois comme des sites effecteurs et inductive pendant les maladies parodontales 4. Les études humaines ont suggéré que, en réponse à la plaque dentaire, des cellules et des molécules effectrices de l'immunité infiltrés ou au départ de la gencive 5-7 dynamiquement. Cette activité a été montré à jouer un rôle majeur dans la destruction parodontale 8,9. Alors que les données générées par ces études ont fourni des informations précieuses sur ce processus pathologique, en collaboration avec les tissus humains possèdent principales limites éthiques, techniques et expérimentaux. Le développement de modèles expérimentaux ont permis expérimentations de cause à effet via employant des souris transgéniques et des interventions in vivo 10. En conséquence, nos connaissances sur les mécanismes impliqués dans la maladie parodontale a considérablement augmenté au cours des deux dernières décennies. Même si, en raison de la complexité des maladies parodontales, il estun débat sur la nature de la réponse immunitaire locale faciliter la destruction des tissus. Il ya aussi un manque dans notre compréhension de la fonction des cellules immunitaires centrales dans la gencive au cours de maladies parodontales. Il est donc essentiel d'étudier les événements inflammatoires pathologiques qui se produisent dans le tissu cible de la maladie, de la gencive.
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Protocol
Préparez à l'avance:
- PBS + 2% SVF
- PBS + 2% SVF à 2 mg / ml de collagénase de type II et 1 mg / ml de DNAse type I (1 ml par échantillon)
- Instruments chirurgicaux stérilisés
- Une solution d'EDTA 0,5 M.
1. Upper Technique Excision gingivale
- Euthanasier les souris utilisant un guidage IACUC approuvé.
- Couper les deux côtés de la cavité buccale, y compris les joues et la branche mandibule avec une nette / mousses ciseaux droits.
- Déroulez la mandibule.
- Couper les tissus mous et durs dans une ligne imaginaire 1 mm derrière les molaires tiers avec des ciseaux standards. Diriger les ciseaux perpendiculaires au plan de l'os palatin (Figure 2A, lignes bleues).
- Inciser les tissus mous et durs 2 mm derrière les incisives (figure 2A, lignes bleues).
- Déroulez la partie antérieure de la bouche. La cavité nasale est observable après cette étape.
- Placez les ciseauxparallèlement au palais, placez une lame dans la cavité nasale, l'autre lame doit inciser au vestibule. Couper jusqu'à ce que l'incision postérieure (Figure 2A, lignes vertes). Répétez cette étape sur les deux côtés du maxillaire. A la fin du maxillaire est détaché du reste du crâne (figure 2B).
- Retirez le maxillaire, le couper en la suture du milieu (Figure 2, noir pointillé) et couper le tissu palatin de chaque hémi-maxillaire jusqu'à l'os alvéolaire.
- Peler les tissus gingivaux (deux hémi-maxillaires) de leur bord antérieur avec Adson forceps (sans dents).
- Placez la gencive excisée dans une plaque avec du PBS + 2% FCS.
2. Gingivale traitement
- Mettez la gencive excisée dans une boîte de culture tissulaire (35 x 10 mm) avec 1 ml de PBS + 2% FCS, 2 mg / ml de collagénase de type II et 1 mg / ml de DNAse type I.
- Hachez bien le tissu avec un n ° 15 lame chirurgicale stérile N.
- Transfer le tissu de la plaque d'un tube à essai de 15 ml conique.
- Laver les tissus / cellules restantes sur le plateau avec 1 ml de PBS + 2% FCS et le transfert à la même éprouvette.
- Incuber dans un incubateur à agitation pendant 20 min à 37 ° C, 200 rpm (recommandation: préchauffer l'incubateur).
- Ajouter 20 ul d'EDTA 0,5 M et incuber pendant 10 min à 37 ° C, 200 rpm.
- Remplir le tube à essai jusqu'à 12 ml avec du PBS + 2% FCS et centrifuger à 4 ° C, 400 g pendant 8 min (recommandation: pré-refroidissement de la centrifugeuse).
- Éliminer les cellules surnageant et remettre avec 2 ml de PBS + 2% FCS.
- Filtrer l'échantillon avec un 70 um cellule-filtre et sauver traversent.
- Centrifugeuse à 4 ° C, 320 g pendant 5 min.
- Éliminer les cellules surnageant et remettre avec 300 pi de PBS + 2% FCS.
- Compter les cellules (10 cellules environ 5-10 x 5 sont attendus à partir d'un seul maxillaire).
3. Anticorps extracellulaires et intracellulairesColoration pour analyse par cytométrie en flux
Il est recommandé de travailler sous une hotte, avec lumières éteintes. Il est essentiel de maintenir les cellules dans un environnement froid constante, ainsi que tout le matériel nécessaire.
- Colorer les cellules contre les molécules extracellulaires en ajoutant 0,2-0,5 pg de chaque anticorps sélectionné par 1 x 10 6 cellules dans un volume total de 100 pl.
- Vortex brièvement.
- Incuber les tubes pendant 15 minutes dans l'obscurité à 4 ° C.
- Laver les cellules avec 2 ml de PBS + 2% FCS.
- Centrifugeuse à 4 ° C, 320 g pendant 5 min.
- Aspirer cellules surnageant et remettre en ajoutant goutte à goutte, 500 pl BD froid Cytoperm / Cytofix tout vortex.
- Incuber les tubes pendant 40 min à 4 ° C dans l'obscurité.
- Vortex brièvement.
- Laver les cellules deux fois avec 1 ml froid BD Perm / Wash Buffer et centrifuger à 800 g pendant 7 min à 4 ° C.
- Aspirer le surnageant à l'exception de 300 pi.
- Colorer les cellules intracellulaire parajoutant 1 pg de chaque anticorps sélectionné par 1 x 10 6 cellules dans un volume total de 100 pl.
- Vortex brièvement.
- Incuber pendant 30 minutes dans l'obscurité à 4 ° C.
- Laver les cellules deux fois avec 1 ml froid BD Perm / Wash Buffer et centrifuger à 800 g pendant 7 min à 4 ° C.
- Aspirer cellules surnageant et remettre en ajoutant 300 ul BD Perm / Wash Buffer froid.
- Vortex brièvement.
- Transférer la suspension tout en filtrant les tubes FACS.
- Gardez les tubes dans un environnement sombre et froide jusqu'à l'analyse.
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Representative Results
Exemples d'analyse de cytométrie en flux sur des cellules gingivales sont présentés. Cellules gingivales groupées de 2 souris ont été exécutés dans un cytomètre de flux LSR II et analysées avec le logiciel FlowJo. Figure 3A démontré la distribution des cellules gingivales de souris naïves dans une diffusion latérale (SSC) par rapport dispersion vers l'avant (FSC) intrigue. stratégie d'ouverture de porte à identifier (i) les lymphocytes (ii) les monocytes / cellules dendritiques et (iii) granulocytes est indiqué. Aux fins de comparaison, nous présentons également un terrain FACS illustrant cellules gingivales purifiés de P. gingivalis infecté des souris 21 jours après gavage oral dans un cadre de parodontite expérimentale que nous avons décrit précédemment (figure 3B). Une augmentation dans les différentes populations de cellules immunitaires peut être facilement détecté chez les souris infectées par rapport aux souris naïves. Ensuite, nous identifions les cellules immunitaires dans la gencive traitées par gating sur les cellules exprimant le marqueur CD45 hématopoïétique (figure 4A). T cellules es encore divisés en cellules CD3-positifs représentant les cellules T (figure 4B). Nous avons également identifié des neutrophiles gingivaux selon l'expression de l'Ly6G et molécules CD11b (figure 4C). Enfin, les cellules de Langerhans, un sous-ensemble épithéliale des cellules dendritiques (CD), ont été identifiés par gating sur le CMH de classe II + CD11c + cellules (un marqueur des CD murines) et l'expression de Ep-CAM et langerin/CD207 (coloration intracellulaire) (Figure 4D).
Figure 1. Schéma montrant les points de repère anatomiques de la gencive.
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Figure 2. Vue schématique de la cavité buccale de souris résultant après l'étape 1.3 remplissant les tissus mous de l'arrière vers l'avant:. Masseter (MM), le palais mou (SP), palais dur (HP), gencive (G). Tissus durs: molaires et des incisives. L'objectif principal de cette technique est d'isoler le tissu gingival qui entoure les trois molaires (à l'intérieur de l'ovale noir).
Figure 3. Représentant parcelles FACS démontrant distribution cellulaire des leucocytes gingivale. Des échantillons gingivales transformés ont été effectués sur le cytomètre en flux LSR II et analysées avec le logiciel FlowJo. diffusion latérale (SSC) par rapport dispersion des parcelles avant (FSC) des cellules gingivales de (A) souris naïves ou (B) gencives enflammées sont presdonné. L'emplacement: (i) les lymphocytes (ii) les monocytes / cellules dendritiques et (iii) les populations de granulocytes est indiqué.
Figure 4. Représentant parcelles FACS démontrant analyse des cellules gingivales immunes. (A) Les cellules immunitaires ont été identifiés en fonction de CD45 expression. Après déclenchement sur les cellules CD45-positives et la population de lymphocytes, l'expression de CD3 permis à cibler des cellules T sous-ensemble. (B) Les neutrophiles ont été identifiés dans la gencive fonction de la capacité des cellules CD45 + à exprimer aussi Ly6G et CD11b. (C) Les cellules dendritiques sont identifié par déclenchement sur les cellules CD45 + à partir de la population de monocytes / dendritique [figure 3, la porte (ii)], puis le CMH de classe II et des cellules positives CD11c.
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Discussion
Maxillaire tissus gingivaux obtenus à partir d'un simple clic de souris suffisent pour analyser les sous-populations de lymphocytes T et B, ainsi que leur capacité à exprimer des molécules extracellulaires et intracellulaires comme nous l'avons décrit précédemment 1. Néanmoins, si les populations de cellules rares sont d'un intérêt (par exemple PED), il est recommandé pour les tissus de la piscine 2-3 souris. Fait à noter, si préférable, il est possible de peler les deux tissus palatines et gingivales, puis à exciser la gencive (une modification de l'étape 1,8-1,9). Il convient également de mentionner que mandibulaire gencive peuvent être collectées aussi bien, et encore, son isolement est plus compliqué et peut inclure d'autres tissus qui pourraient interférer avec l'analyse.
Techniques communes pour étudier les cellules immunitaires dans la gencive sont immunohistochimie et immunofluorescence. Ces techniques permettent la visualisation de la distribution d'une molécule cible / cellule à travers la gencive, et le dépistage de nombreux champss est nécessaire afin d'étudier un certain domaine. Alors que la localisation physiologique de certaines cellules ne peut être déterminée par cytométrie de flux en raison du traitement gingival, cette approche présente plusieurs autres avantages: (1) la cytométrie en flux est une méthode rapide et simple pour analyser de grandes quantités de cellules (2) il réduit les erreurs d'analyse proviennent de l'hétérogénéité des tissus (3) elle permet l'analyse des populations de cellules rares (4), il permet l'analyse simultanée de diverses variables (5), il permet la discrimination entre les cellules vivantes et mortes (6), il permet l'analyse fonctionnelle des cellules qui en résultent.
La capacité à effectuer des analyses de cytométrie de flux sur les tissus gingivaux pendant la maladie parodontale expérimentale renforce notre capacité à révéler les mécanismes immunologiques impliqués dans ce processus. Étude longitudinale sur les changements cellulaires qui se produit dans l'exposition suivante gencive à des agents pathogènes par voie orale devrait fournir des informations plus pertinentes plutôt que de mesurer les réponses immunitaires systemically. Cet aspect revêt une importance particulière lors de l'analyse du phénotype et la cinétique des cellules inflammatoires innées et adaptatives dans la gencive enflammée.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Cette recherche a été financée par des subventions de la Fondation Israël sciences (n ° 1418-1411) à AHH et (n ° 1933-1912) à AW, la Fondation israélienne allemand pour les jeunes chercheurs (GIF Young) à AHH, et le Dr. I . Fonds Cabakoff recherche dotation à l'École de médecine dentaire à AHH et AW Hebrew University-Hadassah.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase Type II | Worthington Biochemical Corp. | CLS-2 | |
| DNAse I | SIGMA | DN25-1G | |
| EDTA | SIGMA | E6758-100G | |
| Dulbecco's PBS | SIGMA | D8537 | |
| Fetal Bovine Serum | Biological Industries | 04-121-1 | Heat Inactivated |
| Vacuum-Driven Filter | Jet Biofil | FPE-204-500 | |
| 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube | BD Falcon | 352052 | |
| Cell Strainer 70 μm | SPL Lifesciences | 93070 | |
| Tissue Culture Dish 35×10 mm | NUNC | 153066 | |
| BD Cytofix/Cytoperm | BD | 554714 | |
| Anti-mouse CD11c antibody | Biolegend | 117305 | Clone N418 |
| Anti-mouse CD45.2 antibody | Biolegend | 109819 | Clone 104 |
| Anti-mouse CD4 antibody | Biolegend | 100413 | Clone GK1.5 |
| Anti-mouse CD8a antibody | Biolegend | 100733 | Clone 53-6.7 |
| Anti-mouse CD3 antibody | Biolegend | 100214 | Clone 17A2 |
| Anti-mouse CD326 (Ep-CAM) antibody | Biolegend | 118219 | Clone G8.8 |
| Anti-mouse CD207 (Langerin) antibody | Imgenex | DDX0362D | Clone 929F3.01 |
| Anti-mouse I-Ad (MHC-II) antobody | Biolegend | 115010 | Clone 39-10-8 |
| LSR II Flow Cytometer | BD Biosciences | ||
| FlowJo Software v 7.6.5 | Tree Star |
References
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