Summary
Diese Studie beschreibt ein effizientes Verfahren zur Isolation und Behandlung Gingiva von der Maus Mundhöhle, um eine Einzelzellen-Kultur zu erzeugen. Die resultierenden Zellen können weiter für die Durchflusszytometrie und molekulare Studien eingesetzt werden.
Abstract
Wir haben eine Technik entwickelt, um genau zu isolieren und zu verarbeiten Maus Zahnfleisch für die Durchflusszytometrie und molekularbiologische Studien entwickelt. Das Zahnfleisch ist eine einzigartige und wichtige Gewebe Immunmechanismen zu studieren, weil es in Immunantwort gegen orale Biofilme, die Parodontalerkrankungen führen könnten beteiligt ist. Darüber hinaus ermöglicht die Nähe des Zahnfleisches zu Alveolarknochen Gewebe auch das Studium Knochenumbau unter entzündlichen Bedingungen. Unsere Methode liefert große Mengen von Immunzellen, die Analyse selbst seltenen Zellpopulationen wie Langerhans-Zellen und regulatorischen T-Zellen ermöglicht, wie wir bereits gezeigt, 1. Verwendung Mäusen zu lokalen Immunreaktionen in Alveolarknochenschwund bei Parodontopathien beteiligt studieren ist aufgrund der Verfügbarkeit von verschiedenen immunologischen und experimentelle Werkzeuge vorteilhaft. Allerdings lassen sich aufgrund ihrer geringen Größe und der relativ unbequem Zugang zum murinen Zahnfleisch, vermieden viele Studien Prüfung von this kritischen Gewebe. Das Verfahren in dieser Arbeit beschriebenen erleichtern könnte gingivalen Analyse, die hoffentlich unsere Unterbewertung auf die orale Immunsystem und seine Rolle während der Parodontalerkrankungen wird zunehmen.
Introduction
Gingiva ist das weiche Gewebe um den zervikalen Teil der Zähne und deckt den Alveolarfortsatz (Abbildung 1). Das Zahnfleisch ist eine Art von Kau-Mukosa, die weiter in Schleimhaut-Epithel und Bindegewebe (auch als Submukosa oder Lamina propria bekannt) getrennt werden können. Die anatomische Struktur des Zahnfleisches und der angrenzenden Zähne ermöglicht es Bakterien, leben und entwickeln Plaque (Biofilm), die ständig herausfordert die lokale Immunsystem. Als ein Ergebnis entwickelt Entzündungsreaktion in der Gingiva, die unter Umständen gesundheitsschädlich wird - ein Zustand bezeichnet Parodontopathien 2. Grundsätzlich kann Plaque-induzierte parodontalen Erkrankungen in Gingivitis und Parodontitis unterteilt werden. Gingivitis eine reversible Zustand der lokalen Entzündungsreaktion, die das Zahnfleisch beschränkt ist. Periodontitis, auf der anderen Seite, ist eine irreversible zerstörende Verfahren, bei dem die Befestigungsvorrichtung (Alveolarknochen periodontalenLig. Zement und Zahnfleisch) ist 3 zerstört.
Das Zahnfleisch wurde vorgeschlagen, sowohl als Effektor und induktive Websites während Parodontalerkrankungen 4 dienen. Menschliche Studien haben vorgeschlagen, dass als Reaktion auf Zahnbelag, Immuneffektorzellen und Moleküle dynamisch infiltriert oder Abreise das Zahnfleisch 5-7. Diese Aktivität wurde gezeigt, dass eine wichtige Rolle bei der parodontalen Zerstörung 8,9 spielen. Während Daten von diesen Studien lieferten wertvolle Informationen über diesen pathologischen Prozess, die Arbeit mit menschlichen Geweben erzeugt besitzen erhebliche ethische, technische und experimentelle Einschränkungen. Die Entwicklung von experimentellen Modellen erlaubt Ursache-Wirkungs-Experimente über den Einsatz transgener Mäuse und in vivo Interventionen 10. Dadurch erhöht unser Wissen über die Mechanismen in Parodontitis beteiligt sich während der letzten zwei Jahrzehnte. Trotzdem aufgrund der Komplexität der periodontalen Krankheiten bestehteine Debatte über die Art der lokalen Immunantwort Erleichterung Gewebezerstörung. Es ist auch ein Mangel in unserem Verständnis von der Funktion des zentralen Immunzellen in das Zahnfleisch während Parodontalerkrankungen. Es ist somit wesentlich, pathologische entzündliche Ereignisse in das Zielgewebe von der Krankheit, der Gingiva zu studieren.
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Protocol
Bereiten Sie im Voraus:
- PBS + 2% FCS
- PBS + 2% FCS mit 2 mg / ml Kollagenase Typ II und 1 mg / ml DNAse Typ I (1 ml pro Probe)
- Sterilisiert chirurgische Instrumente
- 0,5 M EDTA-Lösung
1. Obere Gingival Exzision Technik
- Euthanize Mäusen mit zugelassenen IACUC Führung.
- Schneiden Sie beide Seiten der Mundhöhle, einschließlich der Wangen und des Unterkiefers Ramus mit einem spitz / stumpf gerade Schere.
- Ziehen Sie den Unterkiefer.
- Schneiden Sie die weichen und harten Gewebe in einer gedachten Linie 1 mm hinter den Backenzähnen Drittel mit Standard-Schere. Richten Sie die Schere senkrecht zur Ebene des palatinalen Knochen (2A, blaue Linien).
- Inzision der weichen und harten Gewebe 2 mm hinter den Schneidezähnen (2A, blaue Linien).
- Ziehen Sie den vorderen Teil des Mundes. Die Nasenhöhle ist nach diesem Schritt beobachtet werden.
- Legen Sie die Schereparallel zum Gaumen, legte ein Messer in die Nasenhöhle, sollte die andere Klinge in der Vorhalle einzuschneiden. Schneiden bis zum hinteren Einschnitt (2A, grüne Linien). Wiederholen Sie diesen Schritt auf beiden Seiten des Oberkiefers. Am Ende der Oberkiefer ist vom Rest des Schädels (2B) löst.
- Entfernen Sie den Oberkiefer, schneiden Sie es in der Mitte Naht (Abbildung 2, schwarz gestrichelte Linie) und schneiden Sie die palatinale Gewebe jedes Hemi-Oberkiefer bis zum Erreichen der Alveolarknochen.
- Schälen Sie die gingivalen Gewebe (sowohl Hemi-Oberkiefer) von ihren vorderen Rand mit Adson Pinzette (ohne Zähne).
- Legen Sie das ausgeschnittene Zahnfleisch in einem Teller mit PBS + 2% FCS.
2. Gingival Verarbeitung
- Setzen Sie den ausgeschnittenen Zahnfleisch in einem Gewebe Kulturschale (35 x 10 mm) mit 1 ml PBS + 2% FCS, 2 mg / ml Collagenase Typ II und 1 mg / ml DNAse Typ I.
- Mince gut das Gewebe mit einem N ° 15 sterile Klinge.
- Transfer das Gewebe von der Platte auf einem 15 ml konischen Röhrchen.
- Waschen Sie die Gewebe / Zellen noch auf der Platte mit 1 ml PBS + 2% FCS und Transfer zum gleichen Reagenzglas.
- Inkubation in einem Schüttler Inkubator für 20 min bei 37 ° C, 200 rpm (Empfehlung: Heizen Sie den Inkubator).
- In 20 ul 0,5 M EDTA und Inkubation für weitere 10 min bei 37 ° C, 200 UpM.
- Füllen Sie das Teströhrchen bis zu 12 ml mit PBS + 2% FCS und Zentrifuge bei 4 ° C, 400 xg für 8 min (Empfehlung: pre-chill die Zentrifuge).
- Überstand entfernen und resuspendieren Zellen mit 2 ml PBS + 2% FCS.
- Filtern Sie die Probe mit einer 70 um Zell-Sieb und sparen Strom durch.
- Zentrifuge bei 4 ° C, 320 xg für 5 min.
- Überstand entfernen und resuspendieren Zellen mit 300 ul PBS + 2% FCS.
- Zählen Sie die Zellen (ca. 5-10 x 10 5 Zellen sind aus einem Oberkiefer erwartet).
3. Extrazelluläre und intrazelluläre AntikörperFärbung für die Durchflusszytometrie-Analyse
Es wird empfohlen, in einer Haube arbeiten, mit Lichter aus. Es ist wichtig, um die Zellen in kalter Umgebung konstant zu halten, sowie alle benötigten Materialien.
- Stain-Zellen gegen extrazelluläre Moleküle durch Zugabe von 0,2-0,5 ug jedes ausgewählte Antikörper pro 1 x 10 6 Zellen in einem Gesamtvolumen von 100 ul.
- Vortex kurz.
- Die Röhrchen für 15 min im Dunkeln bei 4 ° C.
- Waschen der Zellen mit 2 ml PBS + 2% FCS.
- Zentrifuge bei 4 ° C, 320 xg für 5 min.
- Saugen Sie den Überstand und resuspendieren Zellen durch Zugabe tropfenweise, 500 ul kalten BD Cytoperm / Cytofix unter Vortexen.
- Die Röhrchen für 40 min bei 4 ° C im Dunkeln.
- Vortex kurz.
- Waschen Sie die Zellen zweimal mit 1 ml kaltem BD Perm / Wash Buffer und Spin bei 800 xg für 7 min bei 4 ° C.
- Saugen Sie den Überstand bis auf 300 ul.
- Stain Zellen intrazellulär durchZugabe von 1 ug jedes ausgewählte Antikörper pro 1 x 10 6 Zellen in einem Gesamtvolumen von 100 ul.
- Vortex kurz.
- Inkubieren für 30 min im Dunkeln bei 4 ° C.
- Waschen Sie die Zellen zweimal mit 1 ml kaltem BD Perm / Wash Buffer und Spin bei 800 xg für 7 min bei 4 ° C.
- Saugen Sie den Überstand und resuspendieren Zellen durch Zugabe von 300 ul kalten BD Perm / Wash Buffer.
- Vortex kurz.
- Übertragen Sie die Suspension während filtern FACS-Röhrchen.
- Halten Sie die Rohre in einer dunklen und kalten Umgebung bis zur Analyse.
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Representative Results
Beispiele für Durchflusszytometrie-Analyse auf Gingivazellen vorgestellt. Gingival Zellen aus 2 Mäuse wurden vereinigt in einem LSR II Durchflusszytometer laufen und unter Verwendung FlowJo Software. 3A demonstriert die Verteilung der gingivalen Zellen aus naiven Mäusen in einer Seitwärts-Streulicht (SSC) gegen forward scatter (FSC) Grundstück. Gating Strategie zur Identifizierung (i) Lymphozyten (ii) Monozyten / dendritische Zellen und (iii) Granulozyten angegeben. Zum Vergleich dazu präsentieren wir auch eine FACS graphische Darstellung Gingivazellen von P. gereinigt gingivalis infizierten Mäusen 21 Tage nach orale Gabe in einer Einstellung von experimentellen Parodontitis, wie wir zuvor beschrieben (Abbildung 3B). Ein Anstieg in den verschiedenen Immunzellpopulationen leicht in den infizierten Mäusen nachgewiesen werden, dass naive Mäuse verglichen. Weiter identifizieren wir Immunzellen im verarbeiteten Gingiva Gating Zellen des hämatopoetischen CD45 (4A). T iese Zellen weiter in CD3-positiven Zellen, die T-Zellen (4B) getrennt. Auch gingivalen Neutrophilen nach Expression des Ly6G und CD11b-Moleküle (4C) identifiziert. Schließlich wurden die Langerhans-Zellen, eine Epithelzelle Teilmenge von dendritischen Zellen (DCs), durch Gating auf MHC Klasse II + CD11c + Zellen (ein Marker für murine DCs) und die Expression von Ep-CAM und langerin/CD207 (intrazelluläre Färbung) (Abbildung identifiziert 4D).
Abbildung 1. Schematische Darstellung der anatomischen Landmarken des Zahnfleisches.
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Abbildung 2. Schematische Darstellung der Maus Mundhöhle was nach Abschluss von Schritt 1.3 Weichteile von hinten nach vorne:. M. masseter (MM), des weichen Gaumens (SP), harten Gaumen (HP), Gingiva (G). Hartgewebe: Backenzähne und Schneidezähne. Das Hauptziel dieser Technik ist es, die Gingiva, die die drei Backenzähne (innerhalb der schwarz oval) umgibt isolieren.
Abbildung 3. Repräsentative FACS Plots zeigen zelluläre Verteilung des Zahnfleisches Leukozyten. Verarbeitete gingivale Proben wurden auf dem LSR II Durchflusszytometer laufen und unter Verwendung FlowJo Software. Side Scatter (SSC) gegen forward scatter (FSC) Plots der gingivalen Zellen aus (A) naiven Mäusen oder (B) entzündete Zahnfleisch sind prestierte. Die Lage (i) Lymphozyten (ii) Monozyten / dendritische Zellen und (iii) Granulozyten Populationen gezeigt.
Abbildung 4. Repräsentative FACS Plots demonstrieren Analyse von Immun Gingivazellen. (A) Immunzellen wurden nach CD45-Expression identifiziert. Nach Gating auf CD45-positive Zellen und Lymphozyten Bevölkerung Ausdruck CD3 freigegeben Targeting T-Zell-Untergruppe. (B) Neutrophile wurden in das Zahnfleisch nach Fähigkeit von CD45 +-Zellen identifiziert, auch auszudrücken Ly6G und CD11b. (C) Dendritische Zellen waren identifiziert durch Gating auf CD45 +-Zellen aus der Monozyten / dendritischen Bevölkerung [Abbildung 3, Tor (ii)] und anschließend auf MHC Klasse II und CD11c positive Zellen.
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Discussion
Oberkiefer Zahnfleischgeweben aus einem einzigen Mausklick erhalten sind ausreichend für die Analyse von Sub-Populationen von T-und B-Lymphozyten, sowie ihre Fähigkeit, extra-und intrazellulären Molekülen auszudrücken, wie wir zuvor beschrieben 1. Dennoch, wenn seltenen Zellpopulationen von Interesse sind (z. B. DCs), wird es in Pool Geweben 2-3 Mäuse empfohlen. Zu beachten ist, wenn bevorzugt, ist es möglich, sowohl den Gaumen schälen und Zahnfleischgeweben und dann der Verbrauchsteuer das Zahnfleisch (eine Modifikation des Schrittes 1,8-1,9). Es sollte auch erwähnt werden, dass Unterkiefers Zahnfleisch als auch gesammelt werden können, noch ist ihre Trennung komplizierter und können andere Gewebe, die die Analyse stören könnten gehören.
Allgemeine Techniken zur Immunzellen im Gingiva studieren Immunhistochemie und Immunfluoreszenz. Diese Techniken ermöglichen die Visualisierung der Verteilung eines Zielmoleküls / Zelle durch das Zahnfleisch, und das Screening einer Vielzahl von Felds ist erforderlich, um einen bestimmten Bereich zu untersuchen. Während die physiologischen Lokalisation bestimmter Zellen können nicht mittels Durchflusszytometrie durch gingivale Verarbeitung bestimmt werden, bietet dieser Ansatz einige andere Vorteile: (1) Durchflusszytometrie ist eine schnelle und einfache Methode, um eine große Zahl von Zellen zu analysieren (2) es reduziert Analyse Fehler entstehen aus Gewebe Heterogenität (3) es ermöglicht die Analyse von seltenen Zellpopulationen (4) es simultane Analyse verschiedener Variablen (5) ermöglicht es erlaubt Unterscheidung zwischen lebenden und toten Zellen (6) es funktionelle Analyse der resultierenden Zellen ermöglicht.
Die Fähigkeit, Durchflusszytometrie-Analyse auf Zahnfleischgeweben während experimentellen Parodontitis führen verbessert unsere Fähigkeit, die immunologischen Mechanismen in diesem Prozess beteiligt zu offenbaren. Longitudinal Studium der zellulären Veränderungen, die in der Gingiva nach Exposition gegenüber oralen Krankheitserreger sollte mehr relevante Informationen liefern, anstatt Messung erfolgt Immunantworten systemically. Dieser Aspekt ist von besonderer Bedeutung bei der Analyse des Phänotyps und der Kinetik der angeborenen und erworbenen Entzündungszellen in entzündete Zahnfleisch.
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Disclosures
Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Diese Forschung wurde unterstützt durch Zuschüsse aus der Israel Science Foundation (Nr. 1418/11) an und AHH (Nr. 1933-1912) zu AW, der Deutsch-Israelischen Stiftung für junge Forscher (GIF Young) zu AHH, und die Dr. I unterstützt . Cabakoff Forschung Endowment Fund an der Hebrew University-Hadassah School of Dental Medicine, um AHH und AW.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase Type II | Worthington Biochemical Corp. | CLS-2 | |
| DNAse I | SIGMA | DN25-1G | |
| EDTA | SIGMA | E6758-100G | |
| Dulbecco's PBS | SIGMA | D8537 | |
| Fetal Bovine Serum | Biological Industries | 04-121-1 | Heat Inactivated |
| Vacuum-Driven Filter | Jet Biofil | FPE-204-500 | |
| 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube | BD Falcon | 352052 | |
| Cell Strainer 70 μm | SPL Lifesciences | 93070 | |
| Tissue Culture Dish 35×10 mm | NUNC | 153066 | |
| BD Cytofix/Cytoperm | BD | 554714 | |
| Anti-mouse CD11c antibody | Biolegend | 117305 | Clone N418 |
| Anti-mouse CD45.2 antibody | Biolegend | 109819 | Clone 104 |
| Anti-mouse CD4 antibody | Biolegend | 100413 | Clone GK1.5 |
| Anti-mouse CD8a antibody | Biolegend | 100733 | Clone 53-6.7 |
| Anti-mouse CD3 antibody | Biolegend | 100214 | Clone 17A2 |
| Anti-mouse CD326 (Ep-CAM) antibody | Biolegend | 118219 | Clone G8.8 |
| Anti-mouse CD207 (Langerin) antibody | Imgenex | DDX0362D | Clone 929F3.01 |
| Anti-mouse I-Ad (MHC-II) antobody | Biolegend | 115010 | Clone 39-10-8 |
| LSR II Flow Cytometer | BD Biosciences | ||
| FlowJo Software v 7.6.5 | Tree Star |
References
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