Summary
מחקר זה מתאר טכניקה יעילה לבודד ולעבד את רקמות חניכיים מחלל הפה בעכבר על מנת לייצר תרבות מתא בודד. תאי כתוצאה מכך יכולים להיות בשימוש נוסף לניתוח cytometry זרימה ומחקרים מולקולריים.
Abstract
פיתחנו טכניקה לבודד בדיוק ולעבד את רקמת חניכיים עכברית עבור cytometry הזרימה ומחקרים מולקולריים. החניכיים היא רקמה ייחודית וחשובה ללמוד מנגנוני חיסון משום שהוא מעורב בתגובה החיסונית נגד מארח biofilm פה שעלול לגרום למחל חניכיים. יתר על כן, קרבתה של החניכיים לרקמת עצם מכתשיים מאפשרת גם לימוד שיפוץ עצם בתנאים דלקתיים. השיטה שלנו מניבה כמות גדולה של תאי מערכת חיסון, המאפשרת ניתוח של אוכלוסיות תאים נדירות אפילו כגון תאים לנגרהנס ותאי T רגולטוריים כפי שהוכחנו בעבר 1. עכברים המעסיקים ללמוד תגובות חיסוניות מקומיות מעורבות באיבוד עצם מכתשיים במחל חניכיים הוא יתרון בגלל הזמינות של כלים אימונולוגיים וניסיוני שונים. עם זאת, בשל גודלם הקטן והגישה נוחה יחסית לחניכיים העכבריות, מחקרים רבים נמנעו מבחינה של thiרקמה קריטית של. השיטה המתוארת בעבודה זו יכולה להקל על ניתוח חניכיים, אשר תהיה בתקווה להגדיל ממעיט על מערכת החיסון האוראלית ותפקידה במחל חניכיים.
Introduction
חניכיים היא רקמות רכות המקיפות את החלק הצווארי של השיניים ומכסה את תהליך מכתשיים (איור 1). החניכיים היא סוג של רירית לעיסה שניתן להפריד עוד יותר לתוך אפיתל הרירי ורקמת חיבור (הידוע גם בsubmucosa או propria lamina). המבנה האנטומי של החניכיים ושיניים סמוכות מאפשר לחיידקים לחיות ולפתח פלאק (biofilm) שכל הזמן מאתגר את המערכת החיסונית המקומית. כתוצאה מכך, מתפתחת תגובה דלקתית בחניכיים, אשר בנסיבות מסוימות הופכת להיות הרסני - מצב שמכונה מחלות חניכיים 2. בעיקרון, ניתן לחלק את פתולוגיות חניכיים המושרה פלאק לדלקת חניכיים וחניכיים. דלקת חניכיים מייצגת מצב הפיך של תגובה דלקתית המקומית שמוגבלת לחניכיים. חניכיים, ומצד שני, היא תהליך הרסני בלתי הפיך שבו מנגנון הקובץ המצורף (עצם מכתשיים, חניכייםרצועה, cementum וחניכיים) הוא נהרס 3.
החניכיים הוצעה לשרת אתרים גם מפעיל ואינדוקטיבי כמו במחל חניכיים 4. מחקרים בבני אדם הראו כי בתגובה לרובד שיניים, תאי מפעיל חיסוניים ומולקולות דינמי הסתננו או היציאה החניכיים 5-7. פעילות זו הוצגה לשחק תפקיד מרכזי בהרס חניכיים 8,9. אילו נתונים שנוצרו על ידי אותם מחקרים סיפק מידע בעל ערך רב לגבי התהליך הפתולוגי הזה, עבודה עם רקמות אדם בעל מגבלות אתיות, טכנית וניסיון גדולים. הפיתוח של מודלים ניסויים אפשרו experimentations סיבה ותוצאה באמצעות העסקת עכברים הטרנסגניים וin vivo התערבויות 10. כתוצאה מכך, הידע שלנו על המנגנונים המעורבים במחלת חניכיים גדל במידה ניכרת במהלך שני העשורים האחרונים. למרות זאת, בשל המורכבות של מחלות חניכיים, ישדיון מתמשך לגבי אופי התגובה חיסונית מקומית להקל הרס רקמות. יש גם חוסר בהבנה שלנו על התפקוד של תאי מערכת חיסון מרכזיים בחניכיים במהלך מחלות חניכיים. זה חיוני ובכך ללמוד אירועים פתולוגיים דלקתיים המתרחשים ברקמת היעד של המחלה, החניכיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
להכין מראש:
- PBS + 2% FCS
- PBS + 2% FCS עם 2 מ"ג / מ"ל של collagenase סוג II ומ"ג / 1 מ"ל של DNAse סוג I (1 מ"ל לדגימה)
- מכשירי ניתוח מעוקרים
- פתרון 0.5 M EDTA
1. טכניקת כריתת חניכיים עליונה
- להרדים עכברים באמצעות הדרכת IACUC אושר.
- חותכים את שני הצדדים של חלל הפה, כולל את הלחיים והלסת התחתון Ramus עם מספריים ישרים חדים / קהים.
- משוך כלפי מטה את הלסת התחתונה.
- חותכים את הרקמות הרכות וקשות במ"מ 1 קו דמיוני מאחורי טוחנות שלישים עם מספריים רגילים. לכוון את המספריים בניצב למישור של עצם החך (איור 2 א, קווים כחולים).
- לחתוך את הרקמות הרכות וקשות 2 מ"מ מאחורי החותכות (איור 2 א, קווים כחולים).
- משוך כלפי מטה את החלק הקדמי של הפה. חלל האף ניתן לצפות לאחר שלב זה.
- מניחים את המספרייםבמקביל לחיך, לשים להב אחד לתוך חלל האף, להב השני צריך לחתוך בפרוזדור. לחתוך עד החתך האחורי (איור 2 א, קווים ירוקים). חזור על פעולה זו משני צידי הלסת העליונה. בסוף הלסת העליונה מנותקת משאר הגולגולת (איור 2).
- הסר את הלסת העליונה, לחתוך אותו באמצע התפר (איור 2, קו מקווקו שחור) ולחתוך את רקמת החך של כל אחד, חמי לסת עליונה עד שמגיע לעצם מכתשיים.
- מקלפים את רקמות חניכיים (הן חמי-maxillae) מהגבול הקדמי שלהם עם Adson מלקחיים (ללא שיניים).
- הנח את החניכיים נכרתה בצלחת עם PBS + 2% FCS.
2. חניכיים עיבוד
- שים חניכיים נכרתה בצלחת תרבית רקמה (35 x 10 מ"מ) עם 1 מיליליטר PBS + 2% FCS, 2 מ"ג / מ"ל של collagenase סוג II ומ"ג / 1 מ"ל של DNAse סוג I.
- ברר היטב את הרקמה עם ° להב כירורגי סטרילי 15 N.
- Transfer הרקמה מהצלחת למבחנת חרוטי 15 מ"ל.
- לשטוף את תאי רקמה / שנותרו על הצלחת עם 1 מיליליטר PBS + 2% FCS והעברה לאותה מבחנה.
- דגירה באינקובטור שייקר עבור 20 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, 200 סל"ד (המלצה: מחמם את החממה).
- הוסף 20 μl של EDTA 0.5 M ו דגירה במשך עוד 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, 200 סל"ד.
- מלא את המבחנה עד 12 מ"ל עם PBS + 2% FCS ו צנטריפוגות ב 4 ° C, XG 400 במשך 8 דקות (המלצה: לפני צינת צנטריפוגות).
- הסרת תאי supernatant ו resuspend עם 2 מ"ל PBS + 2% FCS.
- לסנן את המדגם עם 70 מיקרומטר תא מסננת ולשמור לזרום.
- צנטריפוגות ב 4 ° C, 320 XG במשך 5 דקות.
- הסרת תאי supernatant ו resuspend עם + 2% PBS μl 300 FCS.
- ספירת התאים (x 10 5 תאים כ 5-10 צפויים מלסת עליונה יחידה).
3. נוגדן תאי ו תאיצביעה לניתוח cytometry זרימה
מומלץ לעבוד בתוך מכסה המנוע, עם אורות כבויים. זה קריטי כדי לשמור על התאים בסביבה קרה מתמיד, כמו גם את כל החומרים דרושים.
- כתם תאים כנגד מולקולות תאית על ידי הוספת 0.2-0.5 מיקרוגרם של כל נוגדן שנבחר לכל 1 x 10 6 תאים בנפח כולל של 100 μl.
- בקצרה מערבולת.
- דגירה הצינורות במשך 15 דקות בחושך ב 4 ° C.
- שטוף תאים עם 2 מ"ל PBS + 2% FCS.
- צנטריפוגות ב 4 ° C, 320 XG במשך 5 דקות.
- לשאוב תאי supernatant ו resuspend ידי הוספה, טיפה חכמה, 500 BD הקר μl Cytoperm / Cytofix תוך vortexing.
- דגירה הצינורות עבור 40 דקות ב 4 ° C בחושך.
- בקצרה מערבולת.
- לשטוף את התאים פעמיים עם פר 1 מ"ל קר BD / לשטוף מאגר ספין על XG 800 במשך 7 דקות ב 4 ° C.
- לשאוב supernatant למעט 300 μl.
- כתם תאי intracellularly ידיהוספת 1 מיקרוגרם של כל נוגדן שנבחר לכל 1 x 10 6 תאים בנפח כולל של 100 μl.
- בקצרה מערבולת.
- דגירה במשך 30 דקות בחושך ב 4 ° C.
- לשטוף את התאים פעמיים עם פר 1 מ"ל קר BD / לשטוף מאגר ספין על XG 800 במשך 7 דקות ב 4 ° C.
- לשאוב תאי supernatant ו resuspend ידי הוספת 300 הצפת פרם / לשטוף BD קר μl.
- בקצרה מערבולת.
- מעבירים את ההשעיה תוך סינון לצינורות FACS.
- שמור את הצינורות בסביבה חשוכה וקרה עד לניתוח.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
דוגמאות לניתוח cytometry זרימה בתאי חניכיים מוצגות. תאי חניכיים אספו מ2 עכברים לרוץ בcytometer הזרימה השנייה LSR ונותחו באמצעות תוכנת FlowJo. איור 3 א הפגין חלוקת תאי חניכיים מעכברים נאיביים בפיזור צד (SSC) לעומת פיזור עלילה קדימה (FSC). אסטרטגית gating לזהות (i) לימפוציטים (II) / מונוציטים ותאים דנדריטיים (iii) גרנולוציטים מצויינים. לשם השוואה, אנו מציגים גם עלילת FACS ממחישה תאי חניכיים מטוהרים מפ gingivalis נגוע עכברים 21 ימים לאחר gavage האוראלי בהגדרה של חניכיים ניסיוניות כפי שתארנו בעבר (איור 3). ניתן לאתר גידול באוכלוסיות תאי החיסון השונים בקלות בעכברים הנגועים בהשוואה לעכברים נאיביים. בשלב הבא, אנחנו מזהים את התאים חיסוניים בחניכיים מעובדות על ידי gating על תאים המבטאים את סמן hematopoietic CD45 (איור 4 א). T תאי hese עוד יותר הפרדה לתאים CD3 חיוביים המייצגים את תאי T (איור 4). זיהו גם נויטרופילים חניכיים על פי ביטוי של המולקולות וLy6G CD11b (איור 4C). לבסוף, נגרהנס תאי אפיתל, קבוצת משנה של תאים דנדריטים (DCS), זוהו על ידי gating על MHC כיתה השני + + תאי CD11c (סמן של DCs העכברי) וביטוי של EP-CAM וlangerin/CD207 (מכתים תאי) (איור 4D).
איור 1. תרשים סכמטי המציג את ציוני הדרך אנטומיים של החניכיים.
oad/50388/50388fig2.jpg "/>
איור 2. מבט סכמטי של חלל פה וכתוצאה עכבר לאחר שסיים את השלב 1.3 רקמות רכות מהחלק האחורי לחזית:. שריר הפה (MM), חיך רך (SP), חיך קשה (HP), חניכיים (G). רקמות קשות: טוחנות וחותכות. המטרה העיקרית של שיטה זו היא לבודד את רקמת החניכיים המקיפה את שלוש טוחנות (בתוך האליפסה השחורה).
איור 3. חלקות נציג FACS הוכחת הפצה סלולרית של לויקוציטים חניכיים. דגימות חניכיימיים מעובדים היו לרוץ על cytometer הזרימה השנייה LSR ונותחו באמצעות תוכנת FlowJo. פיזור בצד (SSC) לעומת פיזור קדימה (FSC) מגרשים של תאי החניכיים מ (A) עכברים נאיביים או (ב) חניכיים מודלקות הם נוכחותented. מיקומו של (i) לימפוציטים (ii) מונוציטים / תאים דנדריטים (iii) אוכלוסיות גרנולוציטים מצויינים.
איור 4. חלקות נציג FACS הוכחת ניתוח חניכיים של תאים חיסוניים. () תאים חיסוניים זוהו על פי CD45 ביטוי. בעקבות gating על אוכלוסיית תאים לימפוציטים וCD45 חיוביים, ביטוי של CD3 אפשר מיקוד תא T-משנה. (ב ') נויטרופילים זוהו בחניכיים על פי יכולת של CD45 + תאים להביע גם Ly6G וCD11b. (ג) היו תאים דנדריטים זוהה על ידי gating על CD45 + תאים מאוכלוסיית מונוציטים / הדנדריטים [איור 3, שער (השני)], ולאחר מכן על MHC כיתה השנייה ותאים חיוביים CD11c.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
רקמות חניכיימיים לסת עליונות המתקבלות מעכבר אחת מספיקות לניתוח תת אוכלוסיות של לימפוציטים מסוג B וT, כמו גם היכולת שלהם להביע את המולקולות תאיות ו תאית כפי שתארנו בעבר 1. יחד עם זאת, אם אוכלוסיות תאים נדירות הן בעלי העניין (לדוגמא DCs), מומלץ לרקמות בריכת מ 2-3 עכברים. שים לב, אם עדיף, אפשר לקלף שתי רקמות החיך וחניכיים ולאחר מכן לבלו החניכיים (שינוי של צעד 1.8-1.9). זה צריך להיות גם ציינו שיכולות להיות שנאסף mandibular חניכיים, כמו גם, עדיין, הבידוד שלו הוא מורכב יותר ועשוי לכלול רקמות אחרות שעלולים להפריע לניתוח.
טכניקות נפוצות ללימוד תאים חיסוניים בחניכיים הן אימונוהיסטוכימיה וimmunofluorescence. טכניקות אלו מאפשרות הדמיה של ההפצה של מולקולה / תא היעד דרך החניכיים, והקרנה של שדה רבים נדרש כדי ללמוד תחום מסוים. בעוד שהלוקליזציה הפיזיולוגית של תאים מסוימים לא יכולה להיקבע על ידי cytometry הזרימה בשל עיבוד חניכיים, גישה זו מספקת מספר יתרונות אחרים: (1) cytometry הזרימה הוא שיטה מהירה ופשוטה לניתוח מספר גדול של תאים (2) שהוא מפחית טעויות ניתוח מקורן מההטרוגניות רקמה (3) הוא מאפשר ניתוח של אוכלוסיות תאים נדירות (4) שהוא מאפשר ניתוח בו זמנית של משתנים שונים (5) הוא מאפשר אפליה בין תאי חיים ומתים (6) הוא מאפשר ניתוח פונקציונלי של תאי כתוצאה מכך.
היכולת לבצע ניתוח cytometry זרימה ברקמות חניכיים במהלך מחלת חניכיים ניסויית משפרת את היכולת שלנו לחשוף את המנגנונים החיסוני מעורבים בתהליך זה. לימודים האורך של שינויים תאיים המתרחש בחשיפה הבאה החניכיים לפתוגנים אוראליים אמורים לספק מידע רלוונטי יותר ולא מדידת s תגובות חיסוניותystemically. היבט זה הוא בעל חשיבות מיוחדת בעת ניתוח את הפנוטיפ וקינטיקה של תאים דלקתיים מולד אדפטיבית בחניכיים מודלקות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יש מחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי מענקים מהקרן הלאומית למדע (מס '1418-1411) לאהה ו( מס' 1933/12) לAW, הקרן גרמנית לחוקרים צעירים (GIF הצעיר) לאהה, ואני ד"ר . קרן תרומות מחקר Cabakoff בבית הספר לרפואת שיניים לאהה וAW-אוניברסיטת הדסה עברית.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase Type II | Worthington Biochemical Corp. | CLS-2 | |
| DNAse I | SIGMA | DN25-1G | |
| EDTA | SIGMA | E6758-100G | |
| Dulbecco's PBS | SIGMA | D8537 | |
| Fetal Bovine Serum | Biological Industries | 04-121-1 | Heat Inactivated |
| Vacuum-Driven Filter | Jet Biofil | FPE-204-500 | |
| 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube | BD Falcon | 352052 | |
| Cell Strainer 70 μm | SPL Lifesciences | 93070 | |
| Tissue Culture Dish 35×10 mm | NUNC | 153066 | |
| BD Cytofix/Cytoperm | BD | 554714 | |
| Anti-mouse CD11c antibody | Biolegend | 117305 | Clone N418 |
| Anti-mouse CD45.2 antibody | Biolegend | 109819 | Clone 104 |
| Anti-mouse CD4 antibody | Biolegend | 100413 | Clone GK1.5 |
| Anti-mouse CD8a antibody | Biolegend | 100733 | Clone 53-6.7 |
| Anti-mouse CD3 antibody | Biolegend | 100214 | Clone 17A2 |
| Anti-mouse CD326 (Ep-CAM) antibody | Biolegend | 118219 | Clone G8.8 |
| Anti-mouse CD207 (Langerin) antibody | Imgenex | DDX0362D | Clone 929F3.01 |
| Anti-mouse I-Ad (MHC-II) antobody | Biolegend | 115010 | Clone 39-10-8 |
| LSR II Flow Cytometer | BD Biosciences | ||
| FlowJo Software v 7.6.5 | Tree Star |
References
- Arizon, M., et al. Langerhans cells down-regulate inflammation-driven alveolar bone loss. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 7043-7048 (2012).
- Listgarten, M. A.
- Kinane, D. F. Causation and pathogenesis of periodontal disease. Periodontol. 25, 8-20 (2000).
- Jotwani, R., et al. Mature dendritic cells infiltrate the T cell-rich region of oral mucosa in chronic periodontitis: in situ, in vivo, and in vitro studies. J. Immunol. 167, 4693-4700 (2001).
- Graves, D. T., et al. Interleukin-1 and tumor necrosis factor antagonists inhibit the progression of inflammatory cell infiltration toward alveolar bone in experimental periodontitis. J. Periodontol. 69, 1419-1425 (1998).
- Kabashima, H., Yoneda, M., Nagata, K., Hirofuji, T., Maeda, K. The presence of chemokine (MCP-1, MIP-1alpha, MIP-1beta, IP-10, RANTES)-positive cells and chemokine receptor (CCR5, CXCR3)-positive cells in inflamed human gingival tissues. Cytokine. 20, 70-77 (2002).
- Moughal, N. A., Adonogianaki, E., Kinane, D. F. Langerhans cell dynamics in human gingiva during experimentally induced inflammation. J. Biol. Buccale. 20, 163-167 (1992).
- Cochran, D. L. Inflammation and bone loss in periodontal disease. J. Periodontol. 79, 1569-1576 (2008).
- Taubman, M. A., Valverde, P., Han, X., Kawai, T. Immune response: the key to bone resorption in periodontal disease. J. Periodontol. 76, 2033-2041 (2005).
- Graves, D. T., Kang, J., Andriankaja, O., Wada, K., Rossa, C. Animal models to study host-bacteria interactions involved in periodontitis. Front Oral Biol. 15, 117-132 (2012).
