Summary
이 연구는 단일 셀 문화를 생산하기 위해 마우스 구강의 잇몸 조직을 분리하고 처리 할 수있는 효율적인 방법을 설명합니다. 그 결과 세포는 더욱 유동 세포 계측법 분석 및 분자 연구에 사용할 수 있습니다.
Abstract
우리는 정확하게 분리 및 유동 세포 계측법 및 분자 연구를위한 쥐 치은 조직을 처리하는 기술을 개발했습니다. 치은이 치주 질환을 일으킬 수 있습니다 구강 바이오 필름에 대한 숙주 면역 반응에 관여하기 때문에 면역 메커니즘을 연구하는 독특하고 중요한 조직이다. 또한 치조골 조직에 치은의 근접도 염증 상태에서 뼈의 리모델링을 공부 가능하게합니다. 우리의 방법은 우리가 이전에 1을 보여 같은 랑게르한스 세포와 T 조절 세포로도 희귀 한 세포 집단의 분석을 허용 면역 세포의 다량을 얻을 수 있습니다. 치주 질환시 치조골의 손실에 관련된 지역의 면역 반응을 연구하는 고용 쥐 때문에 다양한 면역 실험 도구의 가용성 유리합니다. 그럼에도 불구하고, 그들의 작은 크기와 쥐 잇몸에 상대적으로 불편 접근으로 인해 많은 연구가 생의 검사를 피할 수의 중요한 조직. 이 작품에서 설명하는 방법은 희망 치주 질환시 경구 면역 시스템과 그 역할을 우리 과소을 증가 잇몸 분석을 용이하게 할 수 있습니다.
Introduction
잇몸은 치아의 치경부 부분을 둘러싸고있는 연부 조직과 폐포 과정 (그림 1)을 다룹니다. 치은 더 점막 상피 세포와 결합 조직 (또한 점막하 또는 고유 층라고도 함)로 분리 할 수 있습니다 저작 점막의 유형입니다. 치은 및 인접 치아의 해부학 적 구조는 박테리아가 지속적으로 로컬 면역 체계를 도전 플라크 (바이오 필름)을 상주하고 발전 할 수 있습니다. 치주 질환 2를 칭했다 조건 - 결과적으로 염증 반응은 특정 상황에서 파괴되고 잇몸에 개발하고 있습니다. 기본적으로, 플라크에 의한 치주 병변은 치은염과 치주염으로 나눌 수 있습니다. 치은염은 잇몸에 국한되는 로컬 염증 반응의 가역적 인 상태를 나타냅니다. 치주염은, 다른 한편으로는, 돌이킬 수없는 파괴적인 과정이다하는 부착 장치 (치조골, 치주인대, 백악질과 치은은 3) 파괴된다.
잇몸이 치주 질환 4시 등의 이펙터와 유도 두 사이트를 제공하기 위해 제안되었다. 인간의 연구는 치과 플라크에 대한 응답으로, 면역 효과기 세포와 분자가 동적으로 침투하거나 출발 잇몸 5-7 것을 제안했습니다. 이 활동은 치주 파괴 8,9에 중요한 역할을하는 것으로 나타났다. 인간의 조직 작업이 병적 과정에 대한 귀중한 정보를 제공하는 연구에 의해 생성 된 데이터는 중요한, 윤리적 기술 및 실험 한계를 가지고 반면. 형질 전환 생쥐를 이용한 통해 생체 개입 10 인과 실험을 허용 실험 모델의 개발. 그 결과로, 치주 질환에 관여하는 메커니즘에 대한 우리의 지식은 지난 20 년간 크게 증가했다. 그럼에도 불구하고, 치주 질환의 복잡성으로 인해,이조직의 파괴를 촉진 지역 면역 반응의 특성에 관한 지속적인 논의. 치주 질환시 치은 중앙 면역 세포의 기능에 대한 이해의 부족이있다. 그것은 질병, 잇몸의 표적 조직에서 발생하는 병적 인 염증 이벤트를 공부 때문에 필수적이다.
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Protocol
사전에 준비 :
- PBS + 2 % FCS
- 콜라게나 유형 II와 DNase의 유형 I의 1 MG / ML (샘플 당 1 ML) 2 ㎎ / ml의 PBS + 2 % FCS
- 멸균 수술기구
- 0.5 M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 솔루션
1. 위의 잇몸 절제 기법
- 승인 IACUC 지침을 사용하여 쥐를 안락사.
- 뺨과 날카로운 / 무딘 똑바로 가위로 하악 무스 등 구강의 양쪽을 잘라.
- 하악을 아래로 당깁니다.
- 표준 가위 분의 어금니 뒤에 가상의 선 1mm의 소프트 및 하드 조직을 잘라. 가위 구개 뼈 (그림 2A, 파란색 선)의 평면에 수직 연출합니다.
- 소프트 및 하드 조직에게 앞니 (그림 2A, 파란색 선) 뒤에 2mm를 절개.
- 입의 앞쪽 부분을 아래로 당깁니다. 비강이 단계 이후에 관찰된다.
- 가위를 배치구개에 평행, 비강으로 한 잎을 넣어, 다른 날은 현관에서 절개한다. 후방 절개 (그림 2A, 녹색 선)까지 잘라냅니다. 상악의 양쪽에서이 단계를 반복합니다. 끝에서 상악은 두개골의 나머지 부분 (그림 2B)에서 분리된다.
- , 상악를 제거 중간 봉합 (그림 2, 검은 점선)에 잘라 치조골에 도달 할 때까지 각 헤미 - 상악의 구개 조직을 잘라.
- Adson 집게 (치아 제외)과의 앞쪽에 국경에서 치은 조직 (두 헤미 - 상악) 껍질.
- PBS + 2 % FCS와 함께 접시에 절제 잇몸를 놓습니다.
2. 잇몸 처리
- 1 ML PBS와 함께 조직 배양 접시 (35 × 10 ㎜)에 절개 잇몸을 넣고 + 2 % FCS, 콜라게나 유형 II와 DNase의 유형 I. 1 MG / ML 2 MG / ML
- N ° 15 불임 수술 블레이드와 잘 조직을 말하다.
- TR접시에서 15 ML 원뿔 시험관 조직을 ansfer.
- 1 ML PBS + 2 % FCS와 동일한 테스트 튜브로 전송과 함께 접시에 남아있는 조직 / 세포를 씻으십시오.
- 37 20 분 셰이커 인큐베이터에 품어 ° C, 200 rpm으로 (추천 : 예열 인큐베이터).
- 37 또 다른 10 분 ° C, 200 rpm으로 20 개의 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 0.5 M의 μL와 부화를 추가합니다.
- 12 PBS + 2 % FCS와 ML 4에서 원심 분리기까지 테스트 튜브를 채울 ° C, 8 분 400 XG (추천 : 사전 냉기 원심 분리기).
- 2 ML PBS + 2 % FCS로 뜨는 세포를 resuspend를 제거합니다.
- 70 μm의 셀 스트레이너와 샘플을 필터링을 통해 흐름을 저장합니다.
- 4 ° C, 5 분 320 XG에 원심 분리기.
- 300 μL PBS + 2 % FCS로 뜨는 세포를 resuspend를 제거합니다.
- 세포를 (약 5-10 × 10 5 세포는 단일 상악에서 예상되는) 계산.
3. 세포와 세포 내 항체유동 세포 계측법 분석을위한 염색
그것은 소등와 후드 내부에서 작업 할 것을 권장합니다. 그것은 지속적인 추운 환경에서 세포를 유지뿐만 아니라 필요한 모든 재료하는 것이 중요합니다.
- 100 μL의 총 부피 1 X 10 6 세포 당 선택한 각 항체의 0.2-0.5 μg을 추가하여 세포 분자에 세포를 얼룩.
- 소용돌이 짧게.
- 4 ° C.에 어둠 속에서 15 분 동안 튜브를 품어
- 2 ML PBS + 2 % FCS와 세포를 씻으십시오.
- 4 ° C, 5 분 320 XG에 원심 분리기.
- 추가 뜨는 세포를 resuspend를 대기음, 현명한 드롭, 500 μL 차가운 BD는 Cytoperm / Cytofix 소용돌이로 교반하면서.
- 4 40 분 ° 어둠 속에서 C에 대한 튜브를 품어.
- 소용돌이 짧게.
- 1 ML 차가운 BD 파마로 두 번 세포를 씻으 / 4시 7 분 800 XG에 버퍼와 스핀을 씻으 ° C.
- 300 μL를 제외하고 뜨는을 대기음.
- 에 의해 세포 내에서 세포를 얼룩100 μL의 총 부피 1 X 10 6 세포 당 선택한 각 항체의 1 μg을 추가 할 수 있습니다.
- 소용돌이 짧게.
- 4 ° C.에 어둠 속에서 30 분 알을 품다
- 1 ML 차가운 BD 파마로 두 번 세포를 씻으 / 4시 7 분 800 XG에 버퍼와 스핀을 씻으 ° C.
- 300 μL 차가운 BD 파마 / 워시 버퍼를 추가하여 상층 액과 세포를 resuspend을 대기음.
- 소용돌이 짧게.
- FACS 튜브 필터링을하는 동안 현탁액을 전송합니다.
- 분석까지 어둡고 추운 환경에서 튜브를 유지합니다.
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Representative Results
잇몸 세포 유동 세포 계측법 분석의 예를 제시한다. 2 마우스에서 풀링 된 치은 세포 LSR II 흐름 cytometer에에서 실행 FlowJo 소프트웨어를 사용하여 분석 하였다. 그림 3A는 사이드 분산 형 (SSC) 대 앞으로 분산 형 (FSC) 플롯 순진 생쥐에서 치은 세포의 분포를 보여 주었다. 식별 할 수 게이팅 전략 (I) 림프구 (II) 단핵구 / 돌기 세포 그리고 (iii) 과립구가 표시됩니다. 비교 목적을 위해, 우리는 또한 P.에서 정제 잇몸 세포를 설명 FACS 플롯을 제시 gingivalis는 이십일일 우리가 이전에 (그림 3B) 기술로 실험 치주염의 설정에서 경구 투여 후 쥐를 감염. 순진 생쥐에 비해 다양한 면역 세포 인구의 증가는 쉽게 감염된 생쥐에서 발견 할 수 있습니다. 다음으로, 우리는 조혈 마커 CD45 (그림 4A)를 표현하는 세포 게이트에 의해 처리 된 치은에있는 면역 세포를 식별합니다. 티 대문입니다 세포가 더 T 세포 (그림 4B)를 나타내는 CD3 양성 세포를 분리. 우리는 또한 Ly6G와 CD11b 분자 (그림 4C)의 발현에 따른 치은 호중구을 확인했다. 마지막으로, 랑게르한스 세포, 수지상 세포의 상피 부분 집합, MHC 클래스 II EP-CAM 및 langerin/CD207의 + CD11c + 세포 (쥐 수지상 세포의 마커)와 표현 (세포 내 염색) (그림에 게이팅에 의해 확인되었다 4D).
그림 1. 도식은 치은의 해부학 적 랜드 마크를 표시합니다.
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그림 2. 마우스 구강의 개략도 1.3 단계를 완료 한 후 결과 전면 후면에서 부드러운 조직 :. 턱 근육 (MM), 소프트 구개 (SP), 경구개 (HP), 치은 (G)가. 하드 조직 : 어금니와 앞니. 이 기술의 주요 목표는 세 개의 어금니 (블랙 타원 안으로) 주위의 잇몸 조직을 분리하는 것입니다.
그림 3. 잇몸 백혈구 세포의 분포를 보여주는 대표적인 FACS의 플롯. 가공 치은 샘플은 LSR II 흐름 cytometer에에서 실행 FlowJo 소프트웨어를 사용하여 분석 하였다. 사이드 분산 형 (SSC) 대 (A) 순진 마우스 또는 (B) 염증이 잇몸에서 잇몸 세포의 전방 산란 (FSC) 플롯 압력이다성향의. 의 위치 (I) 림프구 (II) 단핵구 / 돌기 세포 그리고 (iii) 과립구 인구가 표시됩니다.
그림 4. 면역 잇몸 세포의 분석을 보여주는 대표 FACS의 플롯. (A) 면역 세포는 CD45 표현에 따라 확인되었다. CD3의 발현은 T-세포의 하위 집합을 대상으로 CD45 양성 세포와 림프구 인구에 게이트를 사용할 수 다음. (B) 호중구도 Ly6G와 CD11b 표현하는 CD45 + 세포의 능력에 따라 잇몸에서 확인되었다. (C) 수지상 세포는 있었다 단핵구 / 돌기 인구에서 CD45 + 세포에 게이팅에 의해 확인 [그림 3 게이트 (II)], 그리고 MHC 클래스 II와 CD11c 양성 세포합니다.
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Discussion
하나의 마우스에서 얻은 상악 치은 조직은 우리가 이전 1 설명한대로 세포와 세포 내 분자를 표현하는 T 및 B 림프구의 하위 인구뿐만 아니라, 자신의 능력을 분석하기에 충분합니다. 그럼에도 불구하고, 희소 한 세포 집단 (예를 수지상 세포에 대한) 관심이 있으며, 그것은 2-3 생쥐 수영장 조직에 권장됩니다. 참고로, 바람직하는 경우, 그것은 할 수 있습니다 다음, 구개 치은 조직 및 소비세 치은 (단계 1.8-1.9의 변경)에 모두 껍질. 또한 하악 잇몸이뿐만 아니라 수집 될 수 있음을 언급한다 여전히, 그 분리는 더 복잡하고 분석을 방해 할 수있는 다른 조직을 포함 할 수 있습니다.
잇몸에 면역 세포를 연구하는 일반적인 기술은 면역과 면역입니다. 이 기술은 잇몸을 통해 표적 분자 / 세포의 분포의 시각화를 활성화하고 다양한 분야의 심사의는 특정 영역을 연구하기 위해 필요합니다. 특정 세포의 생리적 지역화 치은 처리에 의한 유동 세포 계측법에 의해 결정될 수없는 반면,이 방법은 다른 여러 가지 이점을 제공한다 : (1) 유동 세포 계측법 (2)는 분석 오류가 발생 감소 세포의 큰 숫자를 분석하는 신속하고 간단한 방법입니다 조직의 이질성에서 (3) (4) 그것은 살아 있고 죽은 세포 (6) 사이에 차별이 발생 세포의 기능 분석을 허용 할 수 있습니다 여러 변수의 동시 분석 (5) 수있는 희귀 세포 집단의 분석을 가능하게합니다.
실험 치주 질환시 치은 조직에 유동 세포 계측법 분석을 수행 할 수있는 능력이 과정에 참여 면역 메커니즘을 공개하는 능력을 향상시킵니다. 치은 다음의 구강 병원균에 노출하지 않고 측정보다 더 많은 관련 정보를 제공해야합니다에서 발생하는 세포 변화의 공부 길이 면역 반응의ystemically. 염증이 잇몸에 타고난 및 적응 염증 세포의 표현형과 역학을 분석 할 때이 부분은 특히 중요합니다.
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Disclosures
저자는 공개 아무것도 없어.
Acknowledgments
이 연구는 AW, AHH에 젊은 연구자 (GIF 영)에 대한 독일 이스라엘 재단과 박사 I에 이스라엘 과학 AHH로 재단 (제 11분의 1,418) 및 (제 12분의 1,933)에서 교부금에 의해 지원되었다 . AHH 및 AW에 치과 의학의 히브리어 대학 Hadassah 대학에서 Cabakoff 연구 기금 기금.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase Type II | Worthington Biochemical Corp. | CLS-2 | |
| DNAse I | SIGMA | DN25-1G | |
| EDTA | SIGMA | E6758-100G | |
| Dulbecco's PBS | SIGMA | D8537 | |
| Fetal Bovine Serum | Biological Industries | 04-121-1 | Heat Inactivated |
| Vacuum-Driven Filter | Jet Biofil | FPE-204-500 | |
| 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube | BD Falcon | 352052 | |
| Cell Strainer 70 μm | SPL Lifesciences | 93070 | |
| Tissue Culture Dish 35×10 mm | NUNC | 153066 | |
| BD Cytofix/Cytoperm | BD | 554714 | |
| Anti-mouse CD11c antibody | Biolegend | 117305 | Clone N418 |
| Anti-mouse CD45.2 antibody | Biolegend | 109819 | Clone 104 |
| Anti-mouse CD4 antibody | Biolegend | 100413 | Clone GK1.5 |
| Anti-mouse CD8a antibody | Biolegend | 100733 | Clone 53-6.7 |
| Anti-mouse CD3 antibody | Biolegend | 100214 | Clone 17A2 |
| Anti-mouse CD326 (Ep-CAM) antibody | Biolegend | 118219 | Clone G8.8 |
| Anti-mouse CD207 (Langerin) antibody | Imgenex | DDX0362D | Clone 929F3.01 |
| Anti-mouse I-Ad (MHC-II) antobody | Biolegend | 115010 | Clone 39-10-8 |
| LSR II Flow Cytometer | BD Biosciences | ||
| FlowJo Software v 7.6.5 | Tree Star |
References
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