Summary
Studien beskriver en effektiv teknikk for å isolere og behandle gingivale vev fra mus munnhulen for å produsere en enkelt-cellekultur. De resulterende celler kan videre brukes for strømningscytometri-analyse og molekylære studier.
Abstract
Vi har utviklet en teknikk for å nettopp isolere og behandle murine gingival vev for flowcytometri og molekylære studier. Gingiva er et unikt og viktig vev for å studere immun-mekanismer fordi det er involvert i vertens immunrespons mot oral biofilm som kan forårsake periodontale sykdommer. Videre muliggjør nærhet av gingiva til kjevebenet vev også studere bein ombygging i henhold inflammatoriske tilstander. Vår metode gir store mengder immunceller som gjør at analyse av selv sjeldne celle populasjoner som Langerhans celler og T-regulatoriske celler som vi viste tidligere en. Anvender mus til å studere lokal immunrespons som er involvert i alveolar bentap i løpet av periodontale sykdommer er fordelaktig på grunn av tilgjengeligheten av ulike immunologiske og eksperimentelle verktøy. Ikke desto mindre, på grunn av deres lille størrelse og den relativt upraktisk adgang til det murine gingiva, unngås mange studier undersøkelse av this kritisk vev. Metoden som beskrives i dette arbeidet kan rette gingival analyse, som forhåpentligvis vil øke vår understating på den orale immunsystemet og dets rolle i løpet av periodontale sykdommer.
Introduction
Gingiva er det myke vevet rundt den cervikale parti av tennene og dekker den alveolar-prosessen (Figur 1). Gingiva er en type masticatory slimhinnene som kan separeres ytterligere i mukosalt epitel og bindevev (også kjent som submucosa eller lamina propria). Den anatomiske oppbygging av gingiva og nabotenner tillater bakterier å oppholde seg og utvikle plakk (biofilm) som stadig utfordrer det lokale immunsystem. Som et resultat utvikles inflammatorisk reaksjon i gingiva, hvilke i visse tilfeller blir destruktivt - en tilstand som betegnes periodontale sykdommer 2. I utgangspunktet kan plakk-induserte periodontale patologier deles inn gingivitt og periodontitt. Gingivitt representerer en reversibel tilstand av lokal betennelsesreaksjon som er begrenset til gingiva. Periodontitt, på den annen side, er en irreversibel destruktive prosess hvor festeanordningen (kjevebenet, periodontalligament, cementum og gingiva) er ødelagt tre.
Gingiva ble foreslått å tjene både som effektor og induktiv områder under periodontale sykdommer fire. Humane studier har antydet at i respons til dental plakk, immun effektorceller og molekyler dynamisk infiltrert eller avreise gingiva 5-7. Denne aktiviteten ble vist seg å spille en viktig rolle i periodontal ødeleggelse 8,9. Mens data generert av disse studiene gitt verdifull informasjon om dette patologisk prosess, som arbeider med menneskelig vev har store etiske, tekniske og eksperimentelle begrensninger. Utvikling av eksperimentelle modeller tillatt årsak-virkning eksperimenter via ansette transgene mus og in vivo intervensjoner 10. Som et resultat av økt vår kunnskap om mekanismene som er involvert i periodontal sykdom betraktelig i løpet av de siste to tiårene. Ikke desto mindre, på grunn av kompleksiteten av periodontale sykdommer, er deten pågående debatt om innholdet i den lokale immunresponsen tilrettelegge vev ødeleggelse. Det er også en mangel i vår forståelse av funksjonen av sentral immunceller i gingiva i løpet av periodontale sykdommer. Det er således viktig å studere patologiske inflammatoriske hendelser i målvevet av sykdommen, gingiva.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Forberede seg på forhånd:
- PBS + 2% FCS
- PBS + 2% FCS med 2 mg / ml Collagenase type II og 1 mg / ml DNAse type I (1 ml per prøve)
- Sterilisert kirurgiske instrumenter
- 0,5 M EDTA-oppløsning
En. Øvre Gingival Excision Technique
- Avlive mus ved hjelp av godkjent IACUC veiledning.
- Skjær begge sider av munnhulen inkludert kinnene og kjeven ramus med en skarp / butt rette saks.
- Trekk ned kjeven.
- Skjær den myke og harde vev i en tenkt linje 1 mm bak tredjedeler jekslene med standard saks. Direkte saksen vinkelrett på planet av den palatinal ben (figur 2A, blå linjer).
- Incise de myke og harde vev 2 mm bak fortennene (figur 2A, blå linjer).
- Trekk ned fremre delen av munnen. Den nasale hulrom er observerbar etter dette trinnet.
- Plasser saksparallell til ganen, sette en kniv inn i nesehulen, bør den andre blad incise på vestibylen. Skjær til bakre snitt (Figur 2A, grønne linjer). Gjenta dette på begge sider av overkjeve. Ved slutten overkjeve er løsrevet fra resten av skallen (figur 2B).
- Ta av maxilla, skjær den i midten sutur (figur 2, svart stiplet linje) og trim palatal vev av hver hemi-maxilla inntil nå kjevebenet.
- Skrell gingival vev (både hemi-maxillae) fra fremre grensen til Adson tang (uten tenner).
- Plasser utskåret gingiva i en plate med PBS + 2% FCS.
2. Gingival Processing
- Sett utskåret gingiva i en vevskultur tallerken (35 x 10 mm) med 1 ml PBS + 2% FCS, 2 mg / ml Collagenase type II og 1 mg / ml DNAse type I.
- Finhakk godt vevet med en N ° 15 steril kirurgisk blad.
- Transfer vevet fra tallerkenen til et 15 ml konisk reagensrør.
- Vask vev / celler som var tilbake på platen med 1 ml PBS + 2% FCS og overføring til det samme prøverør.
- Inkuber i en rister i inkubator i 20 min ved 37 ° C, 200 rpm (anbefaling: forvarme inkubator).
- Tilsett 20 ul 0,5 M EDTA og inkuberes i ytterligere 10 min ved 37 ° C, 200 rpm.
- Fylle testrøret opp til 12 ml med PBS + 2% FCS og sentrifuge ved 4 ° C, 400 x g i 8 min (anbefaling: pre-chill sentrifuge).
- Fjern supernatanten og resuspender celler med 2 ml PBS + 2% FCS.
- Filtrer prøven med et 70 mikrometer celle-sil og lagre strømme gjennom.
- Sentrifuger ved 4 ° C, 320 xg i 5 min.
- Fjern supernatanten og resuspender cellene med 300 mL PBS + 2% FCS.
- Tell cellene (ca. 5-10 x 10 5 celler er forventet fra en enkelt overkjeve).
3. Ekstracellulær og intracellulær antistoffFarging for flowcytometrisystemer Analysis
Det anbefales å arbeide inne i en hette, med lysene av. Det er kritisk å holde cellene i kontinuerlig kaldt miljø, så vel som alle de materialer som trengs.
- Beis cellene mot ekstracellulære molekyler ved å tilsette 0,2-0,5 ug av hver valgte antistoff per 1 x 10 6 celler i et totalt volum på 100 ul.
- Vortex kort.
- Inkuber rørene i 15 minutter i mørke ved 4 ° C.
- Vask cellene med 2 ml PBS + 2% FCS.
- Sentrifuger ved 4 ° C, 320 xg i 5 min.
- Aspirer supernatanten og resuspender celler ved å legge til, slippe klok, 500 mL kald BD Cytoperm / Cytofix mens virvling.
- Inkuber rørene i 40 min ved 4 ° C i mørke.
- Vortex kort.
- Vask cellene to ganger med 1 ml kald BD Perm / vaskebuffer sentrifugering ved 800 x g i 7 minutter ved 4 ° C.
- Aspirer supernatanten med unntak av 300 ul.
- Stain celler intracellulært avtilsetning av 1 ug av hver valgte antistoff per 1 x 10 6 celler i et totalt volum på 100 ul.
- Vortex kort.
- Inkuber i 30 min i mørke ved 4 ° C.
- Vask cellene to ganger med 1 ml kald BD Perm / vaskebuffer sentrifugering ved 800 x g i 7 minutter ved 4 ° C.
- Aspirer supernatanten og resuspender celler ved å legge til 300 mL kald BD Perm / Wash Buffer.
- Vortex kort.
- Overfør suspensjonen mens filtrering for å FACS rør.
- Hold av prøverørene til et mørkt og kaldt miljø inntil analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Eksempler på flowcytometri analyse på gingival celler blir presentert. Gingival celler sammenslåtte fra to mus ble kjørt i en LSR II flowcytometer og analysert ved hjelp FlowJo programvare. Figur 3A viste fordelingen av gingival celler fra naive mus i en side scatter (SSC) versus fremover scatter (FSC) plot. Gating strategi for å identifisere (I) lymfocytter (ii) monocytter / dendrittiske celler og (iii) granulocytter er indikert. Til sammenligning formål, har vi også presentere en FACS plott illustrerer gingival celler renset fra P. gingivalis smittet mus 21 dager etter oral sonde i en setting av eksperimentell periodontitt som vi tidligere har beskrevet (Figur 3B). En økning i de forskjellige immun-celle populasjoner kan lett oppdages i den infiserte mus i forhold til ubehandlede mus. Deretter identifiserer vi immunceller i bearbeidet gingiva ved gating på celler som uttrykker blodkreft markør CD45 (Figur 4A). T hese cellene ytterligere segregert i CD3-positive celler som representerer T-celler (figur 4B). Vi identifiserte også gingival nøytrofile ifølge uttrykk for Ly6G og CD11b molekyler (Figur 4C). Til slutt ble Langerhans celler, en epitelial undergruppe av dendrittiske celler (DCS), identifisert av gating på MHC klasse II + CD11c + celler (en markør for murine DCS) og uttrykk av Ep-CAM og langerin/CD207 (intracellulær farging) (figur 4D).
Figur 1. Skjematisk diagram som viser anatomiske landemerker i tannkjøtt.
oad/50388/50388fig2.jpg "/>
Figur 2. Skjematisk visning av mus munnhulen resulterer etter fullført trinn 1,3 Myke vev fra baksiden til forsiden:. Tyggemuskler (MM), bløte gane (SP), harde gane (HP), gingiva (G). Hard vev: jeksler og fortenner. Hovedmålet med denne teknikken er å isolere gingival vev som omgir de tre jeksler (inne i sort oval).
Figur 3. Representative FACS plott som viser mobilnettet distribusjon av gingival leukocytter. Behandlet gingival prøver ble kjørt på LSR II flowcytometer og analysert ved hjelp FlowJo programvare. Side scatter (SSC) versus forward scatter (FSC) plott av gingival celler fra (A) naive mus eller (B) betent gingiva er presented. Plasseringen av (i) lymfocytter (ii) monocytter / dendrittiske celler og (iii) granulocytter populasjoner er indikert.
Figur 4. Representative FACS plott som viser analyse av immun gingival celler. (A) Immune celler ble identifisert i henhold til CD45 uttrykk. Etter gating på CD45-positive celler og lymfocytter befolkningen, aktivert uttrykk for CD3 rettet mot T-celle undergruppe. (B) Nøytrofiler ble identifisert i gingiva etter evne av CD45 +-celler til å uttrykke også Ly6G og CD11b. (C) dendrittiske cellene var identifisert av gating på CD45 + celler fra monocytter / dendrittiske befolkningen [Figur 3, gate (ii)], og deretter på MHC klasse II og CD11c positive celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Maxilla gingivale vev oppnådd fra en enkelt mus er tilstrekkelig for å analysere sub-populasjoner av T-og B-lymfocytter, så vel som deres evne til å uttrykke ekstracellulære og intracellulære molekyler som vi tidligere beskrevet en. Likevel, hvis sjeldne celle populasjoner er av interesse (for eksempel DCS), anbefales det å samle vev 2-3 mus. Til opplysning, hvis ønskelig, er det mulig å skrelle både palatale og gingivalt vev og deretter å skjære gingiva (en modifikasjon av trinn 1.8 til 1.9). Det bør også nevnes at underkjevens gingiva kan samles i tillegg, likevel er dens isolasjon mer komplisert, og kan omfatte andre vev som kan forstyrre analysen.
Vanlige teknikker for å studere immunceller i gingiva er immunhistokjemi og immunfluorescens. Disse teknikkene gjør visualisering av fordelingen av en målmolekyl / celle gjennom gingiva, og screening av mange felts er nødvendig for å studere et bestemt område. Mens de fysiologiske lokalisering av visse celler ikke kan bestemmes ved flowcytometri på grunn av gingival behandling, gir denne metode flere andre fordeler: (1) flowcytometri er en hurtig og enkel metode for å analysere et stort antall celler (2) det reduserer analyse av feil oppstått fra vev heterogenitet (3) det muliggjør analyse av sjeldne cellepopulasjoner (4) det tillater samtidig analyse av ulike variablene (5) det tillater diskriminering mellom levende og døde celler (6) den tillater funksjonell analyse av de resulterende celler.
Evnen til å utføre flowcytometri analyse på gingival vev under eksperimentell periodontal sykdom forbedrer vår evne til å avdekke de immunologiske mekanismene som er involvert i denne prosessen. Langsgående studere av celleforandringer som oppstår i gingiva etter eksponering for oral patogener bør gi mer relevant informasjon i stedet for å måle immunresponser systemically. Dette aspektet er spesielt viktig når du analyserer fenotype og kinetikk av medfødte og ervervede betennelsesceller i betent gingiva.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noe å avsløre.
Acknowledgments
Denne forskningen ble støttet med tilskudd fra Israel Science Foundation (nr. 1418/11) til AHH og (nr. 1933/12) til AW, den tyske israelske stiftelsen for unge forskere (GIF Young) til AHH, og Dr. I . Cabakoff Forskning Endowment Fund ved Hebrew University-Hadassah School of Dental Medicine til AHH og AW.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase Type II | Worthington Biochemical Corp. | CLS-2 | |
| DNAse I | SIGMA | DN25-1G | |
| EDTA | SIGMA | E6758-100G | |
| Dulbecco's PBS | SIGMA | D8537 | |
| Fetal Bovine Serum | Biological Industries | 04-121-1 | Heat Inactivated |
| Vacuum-Driven Filter | Jet Biofil | FPE-204-500 | |
| 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube | BD Falcon | 352052 | |
| Cell Strainer 70 μm | SPL Lifesciences | 93070 | |
| Tissue Culture Dish 35×10 mm | NUNC | 153066 | |
| BD Cytofix/Cytoperm | BD | 554714 | |
| Anti-mouse CD11c antibody | Biolegend | 117305 | Clone N418 |
| Anti-mouse CD45.2 antibody | Biolegend | 109819 | Clone 104 |
| Anti-mouse CD4 antibody | Biolegend | 100413 | Clone GK1.5 |
| Anti-mouse CD8a antibody | Biolegend | 100733 | Clone 53-6.7 |
| Anti-mouse CD3 antibody | Biolegend | 100214 | Clone 17A2 |
| Anti-mouse CD326 (Ep-CAM) antibody | Biolegend | 118219 | Clone G8.8 |
| Anti-mouse CD207 (Langerin) antibody | Imgenex | DDX0362D | Clone 929F3.01 |
| Anti-mouse I-Ad (MHC-II) antobody | Biolegend | 115010 | Clone 39-10-8 |
| LSR II Flow Cytometer | BD Biosciences | ||
| FlowJo Software v 7.6.5 | Tree Star |
References
- Arizon, M., et al. Langerhans cells down-regulate inflammation-driven alveolar bone loss. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 7043-7048 (2012).
- Listgarten, M. A.
- Kinane, D. F. Causation and pathogenesis of periodontal disease. Periodontol. 25, 8-20 (2000).
- Jotwani, R., et al. Mature dendritic cells infiltrate the T cell-rich region of oral mucosa in chronic periodontitis: in situ, in vivo, and in vitro studies. J. Immunol. 167, 4693-4700 (2001).
- Graves, D. T., et al. Interleukin-1 and tumor necrosis factor antagonists inhibit the progression of inflammatory cell infiltration toward alveolar bone in experimental periodontitis. J. Periodontol. 69, 1419-1425 (1998).
- Kabashima, H., Yoneda, M., Nagata, K., Hirofuji, T., Maeda, K. The presence of chemokine (MCP-1, MIP-1alpha, MIP-1beta, IP-10, RANTES)-positive cells and chemokine receptor (CCR5, CXCR3)-positive cells in inflamed human gingival tissues. Cytokine. 20, 70-77 (2002).
- Moughal, N. A., Adonogianaki, E., Kinane, D. F. Langerhans cell dynamics in human gingiva during experimentally induced inflammation. J. Biol. Buccale. 20, 163-167 (1992).
- Cochran, D. L. Inflammation and bone loss in periodontal disease. J. Periodontol. 79, 1569-1576 (2008).
- Taubman, M. A., Valverde, P., Han, X., Kawai, T. Immune response: the key to bone resorption in periodontal disease. J. Periodontol. 76, 2033-2041 (2005).
- Graves, D. T., Kang, J., Andriankaja, O., Wada, K., Rossa, C. Animal models to study host-bacteria interactions involved in periodontitis. Front Oral Biol. 15, 117-132 (2012).
