Summary
Denna studie beskriver en effektiv teknik för att isolera och behandla gingival vävnad från mus munhålan för att producera en enda cellkultur. De resulterande cellerna kan vidare användas för flödescytometrianalys och molekylära studier.
Abstract
Vi har utvecklat en teknik för att exakt isolera och bearbeta murina tandköttsvävnad för flödescytometri och molekylära studier. Tandköttet är en unik och viktig vävnad att studera immunmekanismer eftersom det är inblandat i värdens immunsvar mot oral biofilm som kan orsaka parodontala sjukdomar. Vidare möjliggör närhet av tandköttet till alveolär benvävnad studerar också benremodelleringen enligt inflammatoriska tillstånd. Vår metod ger stora mängder av immunceller som tillåter analys av även sällsynta cellpopulationer såsom Langerhans celler och T reglerande celler som vi visat tidigare 1. Anställa möss för att studera lokala immunsvar involverade i alveolarbenförlust under parodontala sjukdomar är fördelaktig på grund av tillgängligheten av olika immunologiska och experimentella verktyg. Ändå, på grund av sin ringa storlek och den relativt obekvämt tillgång till den murina gingiva, undvek många studier undersökning av This kritiska vävnad. Den metod som beskrivs i detta arbete skulle kunna underlätta gingival analys, vilket förhoppningsvis kommer att öka vår underskatta den muntliga immunförsvaret och dess roll under parodontala sjukdomar.
Introduction
Gingiva är den mjuka vävnaden som omger cervikala delen av tänderna och täcker den alveolära processen (figur 1). Tandköttet är en typ av tugg slemhinna som kan separeras ytterligare i mukosal epitel och bindväv (även känd som submukosa eller lamina propria). Den anatomiska strukturen av tandköttet och angränsande tänder gör att bakterier att bosätta sig och utveckla plack (biofilm) som ständigt utmanar det lokala immunförsvaret. Som ett resultat utvecklar inflammatoriska reaktionen i gingiva, vilket under vissa omständigheter blir destruktiv - ett tillstånd som kallas parodontala sjukdomar 2. I grund och botten, kan plack-inducerade parodontala sjukdomar delas in gingivit och parodontit. Gingivit representerar en reversibel tillstånd av lokala inflammatoriska responsen som är begränsad till gingiva. Periodontit, å andra sidan, är en irreversibel destruktiv process där fästanordningen (alveolärt ben, periodontalligament, cementum och tandkött) är förstörd 3.
Gingiva föreslogs att tjäna både som effektorceller och induktiva platser under parodontala sjukdomar 4. Mänskliga studier har föreslagit att som svar på dental plack, immuneffektorceller och molekyler dynamiskt infiltreras eller avgång tandköttet 5-7. Denna aktivitet visat sig spela en viktig roll i parodontal destruktion 8,9. De data som genereras av dessa studier som värdefull information om denna patologiska process, som arbetar med mänskliga vävnader besitter stora etiska, tekniska och experimentella begränsningar. Utvecklingen av experimentella modeller tillåtna orsak-verkan experimenterande via anställa transgena möss och in vivo interventioner 10. Som ett resultat, ökat vår kunskap om de mekanismer som är involverade i tandlossning avsevärt under de senaste två decennierna. Trots detta, på grund av komplexiteten av parodontala sjukdomar, finns deten pågående debatt om karaktären av det lokala immunförsvaret underlättar vävnadsdestruktion. Det finns också en brist i vår förståelse för funktionen av centrala immunceller i tandköttet under parodontala sjukdomar. Det är därför viktigt att studera patologiska inflammatoriska händelser som inträffar i målvävnaden av sjukdomen, tandköttet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Förbered i förväg:
- PBS + 2% FCS
- PBS + 2% FCS med 2 mg / ml kollagenas typ II och 1 mg / ml DNAse typ I (1 ml per prov)
- Steriliserade kirurgiska instrument
- 0,5 M EDTA-lösning
Ett. Övre Gingival excision Technique
- Euthanize möss med godkända IACUC vägledning.
- Skär båda sidorna av munhålan inklusive kinderna och underkäken ramusen med en vass / trubbig raka sax.
- Dra ned underkäken.
- Skär de mjuka och hårda vävnader i en tänkt linje 1 mm bakom tredjedelar kindtänderna med vanliga sax. Direkt saxen vinkelräta mot planet för palatal ben (Figur 2A, blå linjer).
- Incise de mjuka och hårda vävnader 2 mm bakom framtänderna (Figur 2A, blå linjer).
- Dra ner den främre delen av munnen. Den nasala hålrummet är observerbar efter detta steg.
- Placera saxenparallellt med gommen, sätta ett blad i näshålan, bör det andra bladet incisionsfilm vid vestibulen. Skär tills bakre snitt (figur 2A, gröna linjer). Upprepa detta steg på båda sidor av överkäken. Vid slutet överkäken lösgörs från resten av skallen (Figur 2B).
- Ta överkäken, skär den i mitten suturen (Figur 2, svart streckad linje) och trimma palatala vävnad av varje hemi-överkäke tills du når den alveolära benet.
- Skala gingival vävnad (både hemi-maxillae) från deras främre kant med Adson pincett (utan tänder).
- Placera utskurna gingivan i en platta med PBS + 2% FCS.
2. Gingival Processing
- Sätt den utskurna gingivan i en vävnadsodlingsskål (35 x 10 mm) med 1 ml PBS + 2% FCS, 2 mg / ml kollagenas typ II och 1 mg / ml DNAse Typ I.
- Mal väl vävnaden med en N ° 15 sterilt kirurgiskt blad.
- Transfer vävnaden från plattan till ett 15 ml koniskt provrör.
- Tvätta vävnaden / cellerna som återstår på plattan med 1 ml PBS + 2% FCS och överföring till samma provrör.
- Inkubera i en shaker inkubator i 20 minuter vid 37 ° C, 200 rpm (rekommendation: förvärma inkubator).
- Tillsätt 20 | il EDTA 0,5 M och inkubera under ytterligare 10 min vid 37 ° C, 200 rpm.
- Fyll provrör upp till 12 ml med PBS + 2% FCS och centrifugera vid 4 ° C, 400 x g under 8 min (rekommendation: pre-chill centrifugen).
- Avlägsna supernatanten och återsuspendera celler med 2 ml PBS + 2% FCS.
- Filtrera provet med en 70 | am cell-sil och spara flöde genom.
- Centrifugera vid 4 ° C, 320 x g under 5 min.
- Avlägsna supernatanten och återsuspendera cellerna med 300 l PBS + 2% FCS.
- Räkna celler (ca 5-10 x 10 5 celler förväntas från en enda överkäke).
Tre. Extracellulära och intracellulära AntikroppFärgning för flödescytometrianalys
Det rekommenderas att arbeta inuti en huv, med ljuset släckt. Det är viktigt att hålla cellerna i ständig kall miljö, liksom alla de material som behövs.
- Stain celler mot extracellulära molekyler genom att tillsätta 0,2 till 0,5 ^ g av varje utvald antikropp per 1 x 10 6 celler i en total volym av 100 | il.
- Vortex kort.
- Inkubera rören i 15 min i mörker vid 4 ° C.
- Tvätta cellerna med 2 ml PBS + 2% FCS.
- Centrifugera vid 4 ° C, 320 x g under 5 min.
- Aspirera supernatanten och återsuspendera cellerna genom att tillsätta, droppvis, 500 pl kall BD Cytoperm / Cytofix under virvling.
- Inkubera rören i 40 minuter vid 4 ° C i mörker.
- Vortex kort.
- Tvätta cellerna två gånger med 1 ml kall BD Perm / tvättbuffert och centrifugera vid 800 xg under 7 min vid 4 ° C.
- Aspirera supernatanten med undantag för 300 ^.
- Stain celler intracellulärt genomtillsätta 1 ^ g av varje utvald antikropp per 1 x 10 6 celler i en total volym av 100 | il.
- Vortex kort.
- Inkubera i 30 minuter i mörker vid 4 ° C.
- Tvätta cellerna två gånger med 1 ml kall BD Perm / tvättbuffert och centrifugera vid 800 xg under 7 min vid 4 ° C.
- Aspirera supernatanten och återsuspendera cellerna genom att tillsätta 300 ul kall BD Perm / tvättbuffert.
- Vortex kort.
- Överför suspensionen medan filtrering till FACS rör.
- Förvara rören i en mörk och kall miljö tills analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Exempel på flödescytometrianalys på gingivala celler presenteras. Gingival celler poolade från 2 möss kördes i en LSR II flödescytometer och analyseras med hjälp FlowJo programvara. Figur 3A visar fördelningen av gingival celler från naiva möss i en sidospridning (SSC) relativt framåtspridning (FSC) tomt. Gating strategi för att identifiera (i) lymfocyter (ii) monocyter / dendritiska celler samt (iii) granulocyter är indikerad. För jämförelse ändamål, presenterar vi också en FACS plot som illustrerar gingival celler renade från P. gingivalis infekterade möss 21 dagar efter oral sondmatning i en miljö av experimentell parodontit som vi tidigare beskrivits (Figur 3B). En ökning av de olika immuna cellpopulationer kan lätt detekteras i de infekterade mössen jämfört med naiva möss. Därefter identifierar vi immunceller i den bearbetade gingivan genom grindning på celler som uttrycker den hematopoietiska markör CD45 (fig 4A). T essa celler ytterligare segregerade i CD3-positiva celler representerar T-celler (Figur 4B). Vi identifierade också gingival neutrofiler enligt uttryck av Ly6G och molekyler CD11b (Figur 4C). Slutligen Langerhans celler, en epitelial delmängd av dendritiska celler (DC), identifieras genom slussning på MHC klass II + CD11c + celler (en markör för murina DC) och uttryck av Ep-CAM och langerin/CD207 (intracellulär färgning) (Figur 4D).
Figur 1. Schematiskt diagram som visar de anatomiska landmärken i tandkött.
oad/50388/50388fig2.jpg "/>
Figur 2. Schematisk bild av musen munhålan uppstått efter steg 1,3 mjukdelar från baksidan till framsidan:. Tuggmuskel (MM), mjuka gommen (SP), hårda gommen (HP), tandköttet (G). Hård vävnad: molarer och framtänder. Det huvudsakliga målet med denna teknik är att isolera tandköttsvävnad som omger de tre kindtänderna (innanför svart oval).
Figur 3. Representativa FACS tomter påvisar cellulär fördelning av gingival leukocyter. Bearbetade gingival prover kördes på LSR II flödescytometern och analyseras med hjälp FlowJo programvara. Sidospridning (SSC) relativt framåtspridning (FSC) tomter av de gingival celler från (A) naiva möss eller (B) inflammerat tandkött är presterade. Placeringen av (i) lymfocyter (ii) monocyter / dendritiska celler samt (iii) granulocyter populationer är indikerad.
Figur 4. Representativa FACS tomter visar analys av immuna gingival celler. (A) Immunceller identifierades enligt CD45 uttryck. Efter slussning på CD45-positiva celler och lymfocyter befolkningen, möjliggjorde uttryck av CD3 inriktning T-cell delmängd. (B) Neutrofiler identifierades i tandköttet efter förmåga av CD45 +-celler att uttrycka även Ly6G och CD11b. (C) dendritceller identifieras genom slussning på CD45 + celler från monocyter / dendritiska befolkningen [Figur 3, grind (ii)], och sedan på MHC klass II och CD11c positiva celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Överkäke gingival vävnaderna från en enda mus är tillräckliga för att analysera undergrupper av T-och B-lymfocyter, liksom deras förmåga att uttrycka extracellulära och intracellulära molekyler som vi tidigare beskrivits 1. Men om sällsynta cellpopulationer är av intresse (t.ex. DC), rekommenderas att slå vävnader 2-3 möss. Notera, om föredraget, är det möjligt att skala både palatala och gingival vävnad och sedan till punktskattepliktiga tandköttet (en modifiering av steg 1,8-1,9). Det bör också nämnas att mandibular gingiva kan samlas liksom, fortfarande, är dess isolering mer komplicerad och kan innefatta andra vävnader som kan störa analysen.
Vanliga tekniker för att studera immunceller i gingiva är immunohistokemi och immunofluorescens. Dessa tekniker möjliggör visualisering av distributionen av en målmolekyl / cellen genom gingiva, och screening av ett stort antal fälts krävs för att studera ett visst område. Den fysiologiska lokalisering av vissa celler inte kan bestämmas genom flödescytometri på grund av gingival bearbetning, ger denna metod flera andra fördelar: (1) flödescytometri är en snabb och enkel metod för att analysera ett stort antal celler (2) det minskar analys fel härrör från vävnad heterogenitet (3) det möjliggör analys av sällsynta cellpopulationer (4) Den möjliggör samtidig analys av olika variabler (5) det tillåter diskriminering mellan levande och döda celler (6) det tillåter funktionell analys av de resulterande cellerna.
Förmågan att utföra flödescytometrianalys på gingival vävnad under experimentell parodontit ökar vår förmåga att avslöja de immunologiska mekanismer som är involverade i denna process. Longitudinell studera cellulära förändringar som sker i tandköttet efter exponering för orala patogener bör ge mer relevant information snarare än att mäta immunsvar systemically. Denna aspekt är av särskild betydelse när man analyserar fenotyp och kinetik av medfödda och adaptiva inflammatoriska celler i inflammerad gingiva.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Denna forskning har finansierats med bidrag från Israel Science Foundation (nr 1418-1411) till AHH och (nr 1933-1912) till AW, den tyska israeliska stiftelsen för unga forskare (GIF Young) till AHH, och Dr I . Cabakoff Research Donationsfond vid Hebrew University-Hadassah School of Dental Medicine till AHH och AW.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase Type II | Worthington Biochemical Corp. | CLS-2 | |
| DNAse I | SIGMA | DN25-1G | |
| EDTA | SIGMA | E6758-100G | |
| Dulbecco's PBS | SIGMA | D8537 | |
| Fetal Bovine Serum | Biological Industries | 04-121-1 | Heat Inactivated |
| Vacuum-Driven Filter | Jet Biofil | FPE-204-500 | |
| 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube | BD Falcon | 352052 | |
| Cell Strainer 70 μm | SPL Lifesciences | 93070 | |
| Tissue Culture Dish 35×10 mm | NUNC | 153066 | |
| BD Cytofix/Cytoperm | BD | 554714 | |
| Anti-mouse CD11c antibody | Biolegend | 117305 | Clone N418 |
| Anti-mouse CD45.2 antibody | Biolegend | 109819 | Clone 104 |
| Anti-mouse CD4 antibody | Biolegend | 100413 | Clone GK1.5 |
| Anti-mouse CD8a antibody | Biolegend | 100733 | Clone 53-6.7 |
| Anti-mouse CD3 antibody | Biolegend | 100214 | Clone 17A2 |
| Anti-mouse CD326 (Ep-CAM) antibody | Biolegend | 118219 | Clone G8.8 |
| Anti-mouse CD207 (Langerin) antibody | Imgenex | DDX0362D | Clone 929F3.01 |
| Anti-mouse I-Ad (MHC-II) antobody | Biolegend | 115010 | Clone 39-10-8 |
| LSR II Flow Cytometer | BD Biosciences | ||
| FlowJo Software v 7.6.5 | Tree Star |
References
- Arizon, M., et al. Langerhans cells down-regulate inflammation-driven alveolar bone loss. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 7043-7048 (2012).
- Listgarten, M. A.
- Kinane, D. F. Causation and pathogenesis of periodontal disease. Periodontol. 25, 8-20 (2000).
- Jotwani, R., et al. Mature dendritic cells infiltrate the T cell-rich region of oral mucosa in chronic periodontitis: in situ, in vivo, and in vitro studies. J. Immunol. 167, 4693-4700 (2001).
- Graves, D. T., et al. Interleukin-1 and tumor necrosis factor antagonists inhibit the progression of inflammatory cell infiltration toward alveolar bone in experimental periodontitis. J. Periodontol. 69, 1419-1425 (1998).
- Kabashima, H., Yoneda, M., Nagata, K., Hirofuji, T., Maeda, K. The presence of chemokine (MCP-1, MIP-1alpha, MIP-1beta, IP-10, RANTES)-positive cells and chemokine receptor (CCR5, CXCR3)-positive cells in inflamed human gingival tissues. Cytokine. 20, 70-77 (2002).
- Moughal, N. A., Adonogianaki, E., Kinane, D. F. Langerhans cell dynamics in human gingiva during experimentally induced inflammation. J. Biol. Buccale. 20, 163-167 (1992).
- Cochran, D. L. Inflammation and bone loss in periodontal disease. J. Periodontol. 79, 1569-1576 (2008).
- Taubman, M. A., Valverde, P., Han, X., Kawai, T. Immune response: the key to bone resorption in periodontal disease. J. Periodontol. 76, 2033-2041 (2005).
- Graves, D. T., Kang, J., Andriankaja, O., Wada, K., Rossa, C. Animal models to study host-bacteria interactions involved in periodontitis. Front Oral Biol. 15, 117-132 (2012).
