Summary
Bu çalışma, bir tek hücre kültürü üretmek için fare ağız boşluğundan gingival dokular izole etmek ve işlemek için etkili bir yöntem açıklanır. Ortaya çıkan hücreler bir başka akış sitometri analizi ve klinik çalışmalar için kullanılabilir.
Abstract
Biz tam olarak izole ve akım sitometri ve moleküler çalışmalar için fare dişeti doku işlemek için bir teknik geliştirdik. Dişeti bu periodontal hastalıklara neden olabilir sözlü biyofilm karşı konağın immün yanıtı yer olduğu için bağışıklık mekanizmaları incelemek için eşsiz ve önemli bir dokudur. Ayrıca, alveoler kemik dokusu için dişetinin yakın da enflamatuvar durumlarda kemik yeniden eğitim sağlayan. Bizim yöntemi daha önce 1 gösterdiği gibi Langerhans hücreleri ve T düzenleyici hücreleri gibi daha nadir hücre popülasyonlarının analizi sağlayan bağışıklık hücrelerinin büyük miktarda verir. Periodontal hastalıklar sırasında alveol kemik kaybı dahil yerel immün yanıtları incelemek için istihdam fareler nedeniyle çeşitli immünolojik ve deneysel araçların durumu avantajlıdır. Bununla birlikte, kendi küçük boyutu ve fare dişeti için nispeten uygunsuz erişim nedeniyle, birçok çalışma thi incelenmesi kaçınılmalıdırs kritik doku. Bu çalışmada açıklanan yöntemi umarım periodontal hastalıklar sırasında sözlü bağışıklık sistemi ve rolünü bizim understating artacak dişeti analizi, kolaylaştırabilir.
Introduction
Gingiva diş serviks kısmı çevreleyen yumuşak doku ve alveol (Şekil 1) kapsar. Dişeti daha mukozal epitel ve bağ dokusu (aynı zamanda submukozaya ya da lamina propria olarak da bilinir) ayrılabilir çiğneme mukoza türüdür. Dişeti ve komşu dişlerin anatomik yapısı bakteriler sürekli yerel bağışıklık sistemi meydan plak (biyofilm) ikamet ve geliştirmek için olanak sağlar. Periodontal hastalıkların 2 olarak adlandırılan bir durum - Sonuç olarak, enflamatuar yanıt, bazı durumlarda zararlı olur dişeti, gelişir. Temel olarak, plak indüklenen Periodontal patolojilerin gingivitis ve periodontitis ayrılabilir. Dişeti iltihabı dişeti ile sınırlı yerel inflamatuar yanıt bir geri durumu temsil eder. Periodontitis, diğer taraftan, geri dönüşü olmayan bir yıkıcı bir süreç olduğu bağlanma cihaz (alveol kemiği, periodontalbağ, sement ve diş eti) 3 yok edilir.
Dişeti periodontal hastalıklar 4 sırasında olduğu gibi efektör ve endüktif her iki site hizmet etmek için önerilmiştir. İnsan çalışmalar dental plak yanıt olarak, immün efektör hücreleri ve molekülleri dinamik sızmış veya kalkış dişeti 5-7 olduğunu ileri sürmüşlerdir. Bu aktivite, periodontal yıkım 8,9 önemli bir rol oynadığı gösterilmiştir. Insan dokuları ile çalışan, bu patolojik sürecin ilgili değerli bilgiler sağlanan çalışmalar tarafından oluşturulan veri büyük, etik, teknik ve deneysel sınırlamalar sahip ise. Transgenik fareler istihdam yoluyla ve in vivo müdahaleler 10 neden-sonuç deneylerine izin deneysel modellerin geliştirilmesi. Sonuç olarak, periodontal hastalık ile ilgili mekanizmalar bilgimizi son yirmi yılda önemli ölçüde artmıştır. Buna rağmen, periodontal hastalıkların karmaşıklığı nedeniyle, oradadoku yıkımı kolaylaştıran yerel immün yanıt niteliği ile ilgili devam eden bir tartışma. Periodontal hastalıklar sırasında dişeti merkezi bağışıklık hücrelerinin işlevini anlayışımızda eksikliği vardır. Bu hastalık, gingivanın hedef dokuda oluşan patolojik inflamatuar etkinliklerini inceleme amaçlı olarak bu nedenle çok önemlidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Önceden hazırlayın:
- PBS +% 2 FCS
- Kollajenaz tip II ve DNAz Tip I, 1 mg / ml (örnek başına 1 mi) içinde 2 mg / ml 'si ile PBS +% 2 FCS
- Steril cerrahi aletler
- 0.5 M EDTA
1. Üst Dişeti Eksizyon Tekniği
- Onaylı IACUC rehberlik kullanarak fareler Euthanize.
- Yanaklar ve keskin / künt düz makas ile mandibula ramus dahil olmak üzere ağız boşluğunun her iki kesin.
- Çene aşağı çekin.
- Standart makas ile üçte azı dişleri arkasında hayali bir çizgi 1 mm yumuşak ve sert doku kesin. Makas damak kemiği (Şekil 2A, mavi çizgiler) düzlemine dik yönlendirin.
- Yumuşak ve sert doku kesici (Şekil 2A, mavi çizgiler) arkasında 2 mm insizyon.
- Ağız ön kısmını aşağı çekin. Burun boşluğu bu aşamadan sonra gözlemlenmiştir.
- Makas yerleştirindamak paralel, burun boşluğu içine bir bıçak koymak, diğer bıçak antre de insizyon gerekir. Posterior insizyon (Şekil 2A, yeşil hat) kadar kesin. Maksilla her iki tarafında bu adımı yineleyin. Sonunda maksilla kafatasının geri kalanı (Şekil 2B) ayrılır.
- , Maksilla çıkarın orta sütür (Şekil 2, siyah kesikli çizgi) olarak kesilmiş ve alveol kemiğinin ulaşana kadar her hemi-maksilla damak dokusu kırpın.
- Adson forseps (dişler olmadan) ile ön sınırından dişeti dokuları (iki hemi-üst çene) Peel.
- PBS +% 2 FCS ile bir tabak içinde çıkarıldı dişeti yerleştirin.
2. Dişeti İşleme
- 1 ml PBS ile bir doku kültürü kabı (35 x 10 mm) eksize dişeti koyun +% 2 FCS, kollajenaz tip II ve DNAz Tip I'in 1 mg / ml, 2 mg / ml '
- N ° 15 steril cerrahi bıçak ile de doku kıyma.
- Trplakadan 15 ml konik bir tüp için doku ansfer.
- 1 ml PBS +% 2 FCS ve aynı test tüpüne transfer ile plaka üzerinde kalan doku / hücre yıkayın.
- 37 az 20 dakika bir çalkalayıcı inkübatör inkübe ° C, 200 rpm (öneri: ön ısıtma inkübatör).
- 37 başka bir 10 dakika ° C, 200 rpm'de 20 EDTA, 0.5 M ul ve inkübe ekleyin.
- 12 PBS +% 2 FCS ile ml ve 4 santrifüj kadar test tüpüne doldurun ° C, 8 dakika boyunca 400 x g (öneri: ön soğuk santrifüj).
- 2 ml PBS +% 2 FCS ile süpernatant ve tekrar süspansiyon hücreleri çıkarın.
- 70 mikron hücre-süzgeç ile örnek filtre ve akışı kaydedin.
- 4 ° C, 5 dakika boyunca 320 x g'de santrifüjleyin.
- 300 ul PBS +% 2 FCS ile süpernatant ve tekrar süspansiyon hücreleri çıkarın.
- Hücreleri (yaklaşık 5-10 x 10 5 hücreleri, tek maksilla beklenen) sayın.
3. Hücre dışı ve Hücre içi AntikorSitometrisi Analiz Boyama
Bu ışıklar kapalı, bir başlık içinde çalışmak tavsiye edilir. Bu, sürekli olarak soğuk bir ortamda hücreler tutmak, hem de gerekli olan tüm malzemeleri için çok önemlidir.
- 100 ul toplam hacim içinde 1 x 10 6 hücre başına her seçilmiş bir antikorun 0.2-0.5 ug eklenmesi ile hücre-dışı moleküllere karşı hücre Leke.
- Vortex kısaca.
- 4 ° C de karanlıkta 15 dakika süreyle inkübe edin
- 2 ml PBS +% 2 FCS ile hücreleri yıkayın.
- 4 ° C, 5 dakika boyunca 320 x g'de santrifüjleyin.
- Ekleyerek süpernatant ve tekrar süspansiyon hücreleri aspire, bilge bırak, 500 ul soğuk BD Cytoperm / Cytofix vorteks ise.
- 4 ° C'de 40 dakika karanlıkta C inkübe edin.
- Vortex kısaca.
- 1 ml soğuk BD Perm hücreler iki kez yıkayın / 4, 7 dakika boyunca 800 xg'de Tampon ve sıkma yıkayın ° C
- 300 ul dışında süpernatant aspire.
- Tarafından hücre içinde hücre Leke100 ul toplam hacim içinde 1 x 10 6 hücre başına her seçilmiş bir antikorun 1 ug eklenmesi.
- Vortex kısaca.
- 4 ° C de karanlıkta 30 dakika boyunca inkübe
- 1 ml soğuk BD Perm hücreler iki kez yıkayın / 4, 7 dakika boyunca 800 xg'de Tampon ve sıkma yıkayın ° C
- 300 ul soğuk BD Perm / Yıkama Tamponu ekleyerek süpernatant ve tekrar süspansiyon hücreleri aspire.
- Vortex kısaca.
- FACS tüpler için filtreleme süre süspansiyonu aktarın.
- Analizi kadar karanlık ve soğuk bir ortamda tüpler tutun.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dişeti hücreleri üzerinde akım sitometri analizi örnekleri sunulmaktadır. 2 farelerin toplanmış Dişeti hücreleri bir LSR II akış sitometresinde çalıştırın ve FlowJo yazılımı kullanılarak analiz edildi. Şekil 3A bir yan dağılım (SSC) karşı ileri dağılım (FSC) arsa içinde naif farelerden alınan dişeti hücrelerinin dağılımı göstermiştir. Tespit etmek Ayırıcı stratejisi, (i) lenfositler (ii) monositler / dendritik hücreler ve (iii) granülosit belirtilir. Karşılaştırma amaçla, biz de P. arınmış diş eti hücreleri gösteren bir FACS arsa mevcut gingivalis 21 gün daha önce (Şekil 3B) açıklandığı gibi deneysel periodontitis bir ortamda ağızdan sonda sonra fareler enfekte. Naif farelere kıyasla, çeşitli immün hücre popülasyonunda bir artış kolayca enfekte edilen farelerde teşhis edilebilir. Sonra, hematopoetik işaretleyici CD45 (Şekil 4A) ifade eden hücreler üzerinde geçiş ile işlenmiş dişetlerinde bağışıklık hücreleri tanımlar. T Hese hücrelerinin daha fazla T-hücreleri (Şekil 4B) 'i temsil CD3 pozitif hücreleri içine ayrı. Ayrıca Ly6G ve CD11b'nin molekülleri (Şekil 4C) ifade göre dişeti nötrofil tespit edilmiştir. Son olarak, Langerhans hücreleri, dendritik hücreler (DC) bir epitel alt kümesi, MHC sınıf II Ep-CAM ve langerin/CD207 bir + CD11c + hücreleri (fare DC'ler bir belirteç) ve ifade (hücre içi boyama) (Şekil üzerinde yolluk tarafından tespit edilmiştir 4D).
Şekil 1. Şematik dişetinin anatomik gösteren.
oad/50388/50388fig2.jpg "/>
Şekil 2. Fare ağız boşluğu şematik görünümü adım 1.3 tamamladıktan sonra çıkan ön arkasından yumuşak dokular:. Masseter kas (MM), yumuşak damak (SP), sert damak (HP), dişeti (G). Sert doku: azı dişi ve kesici dişler. Bu tekniğin temel amacı üç azı dişleri (siyah oval içinde) çevreleyen dişeti dokusu izole etmektir.
Şekil 3,. Dişeti lökositlerin hücresel dağılımı gösteren Temsilcisi FACS araziler. İşlenmiş dişeti örnekleri LSR II akış sitometresi üzerinde çalışan ve FlowJo yazılımı kullanılarak analiz edildi. Yan dağılım (SSC) karşı (A) naif fare ya da (B) iltihaplı dişeti gelen dişeti hücrelerin ileri dağılım (FSC) araziler pres olanented. Yeri (i) lenfositler (II) monositler / dendritik hücreler ve (iii) granülosit popülasyonları belirtilir.
Şekil 4. Bağışıklık dişeti hücrelerin analizi gösteren Temsilcisi FACS araziler. (A) Bağışıklık hücreleri CD45 ifade göre belirlenmiştir. CD3 ifadesi T hücre alt hedef, CD45-pozitif hücreleri ve lenfositler nüfusu üzerinde geçiş sağlandıktan sonra sağladı. (B) 'Nötrofiller Ly6G ve CD11b'nin ifade CD45 + hücreleri yeteneğine göre Gingiva tespit edilmiştir. (C) dendritik hücreler vardı monosit / dendritik popülasyonundan CD45 + hücreler üzerinde geçiş tarafından tespit [Şekil 3, kapı (II)] ve daha sonra MHC sınıf II ve CD11c pozitif hücreleri üzerinde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tek bir fareden elde edilen üst çeneye gingival dokular, daha önce tarif edildiği gibi 1 hücre dışı ve hücre içi molekülleri ifade etmek için T ve B lenfositlerinin alt gruplar, hem de bunların özelliği analiz etmek için yeterlidir. Bununla birlikte, eğer nadir hücre popülasyonlarının (örneğin DC için) ilgilendiren, 2-3 fareler havuzu dokulara önerilir. Unutmayın ki, tercih, bu mümkündür sonra damak ve diş eti dokuları ve tüketim diş eti (adım 1.8-1.9 bir değişiklik) her iki kabuğu. Ayrıca çene diş eti de toplanabilir belirtilmelidir, hala, onun yalıtım daha karmaşıktır ve analiz engel olabilecek diğer dokular içerebilir.
Dişeti bağışıklık hücreleri incelemek için yaygın teknikler immünohistokimyasal ve immünofloresan vardır. Bu teknikler, dişeti ile hedef molekül / hücre dağılımının görselleştirme sağlamak ve çok sayıda alanın taranmasıs belirli bir alanda çalışma gereklidir. Bazı hücrelerin fizyolojik lokalizasyonu dişeti işlem nedeniyle akış sitometrisi ile tespit edilemez ise, bu yaklaşım, diğer pek çok avantajları sağlar: (1) akış sitometrisi (2) bu analiz hataları köken azaltır hücrelerinin çok sayıda analiz etmek için hızlı ve basit bir yöntemdir doku heterojen (3) o (4) bu canlı ve ölü hücreleri (6) arasındaki ayrım bu çıkan hücrelerin fonksiyonel analiz izin verir çeşitli değişkenler aynı anda analizi (5) sağlar nadir hücre popülasyonlarının analizi sağlar.
Deneysel periodontal hastalık sırasında diş eti dokusu üzerinde akım sitometri analizi yeteneği bu süreçte yer alan immünolojik mekanizmaların ortaya çıkarmak için yeteneğimizi artırır. Dişeti aşağıdaki sözlü patojenlere maruz kalma yerine ölçüm daha ilgili bilgileri vermelidir meydana hücresel değişikliklerin eğitim Boyuna immün yanıtları systemically. Iltihaplı dişeti içinde doğal ve kazanılmış inflamatuar hücrelerin fenotipi ve kinetik analiz Bu açıdan özel bir önem taşımaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Bu araştırma AW, AHH genç araştırmacılar (GIF Young) için Alman İsrail Vakfı ve Dr ben İsrail Bilim AHH için Vakfı (No 1418/11) ve (No 1933/12) hibe tarafından desteklenmiştir . AHH ve AW için Diş Hekimliği İbrani Üniversitesi-Hadassah Okulu'nda Cabakoff Araştırma Vakfı Fonu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase Type II | Worthington Biochemical Corp. | CLS-2 | |
| DNAse I | SIGMA | DN25-1G | |
| EDTA | SIGMA | E6758-100G | |
| Dulbecco's PBS | SIGMA | D8537 | |
| Fetal Bovine Serum | Biological Industries | 04-121-1 | Heat Inactivated |
| Vacuum-Driven Filter | Jet Biofil | FPE-204-500 | |
| 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube | BD Falcon | 352052 | |
| Cell Strainer 70 μm | SPL Lifesciences | 93070 | |
| Tissue Culture Dish 35×10 mm | NUNC | 153066 | |
| BD Cytofix/Cytoperm | BD | 554714 | |
| Anti-mouse CD11c antibody | Biolegend | 117305 | Clone N418 |
| Anti-mouse CD45.2 antibody | Biolegend | 109819 | Clone 104 |
| Anti-mouse CD4 antibody | Biolegend | 100413 | Clone GK1.5 |
| Anti-mouse CD8a antibody | Biolegend | 100733 | Clone 53-6.7 |
| Anti-mouse CD3 antibody | Biolegend | 100214 | Clone 17A2 |
| Anti-mouse CD326 (Ep-CAM) antibody | Biolegend | 118219 | Clone G8.8 |
| Anti-mouse CD207 (Langerin) antibody | Imgenex | DDX0362D | Clone 929F3.01 |
| Anti-mouse I-Ad (MHC-II) antobody | Biolegend | 115010 | Clone 39-10-8 |
| LSR II Flow Cytometer | BD Biosciences | ||
| FlowJo Software v 7.6.5 | Tree Star |
References
- Arizon, M., et al. Langerhans cells down-regulate inflammation-driven alveolar bone loss. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 7043-7048 (2012).
- Listgarten, M. A.
- Kinane, D. F. Causation and pathogenesis of periodontal disease. Periodontol. 25, 8-20 (2000).
- Jotwani, R., et al. Mature dendritic cells infiltrate the T cell-rich region of oral mucosa in chronic periodontitis: in situ, in vivo, and in vitro studies. J. Immunol. 167, 4693-4700 (2001).
- Graves, D. T., et al. Interleukin-1 and tumor necrosis factor antagonists inhibit the progression of inflammatory cell infiltration toward alveolar bone in experimental periodontitis. J. Periodontol. 69, 1419-1425 (1998).
- Kabashima, H., Yoneda, M., Nagata, K., Hirofuji, T., Maeda, K. The presence of chemokine (MCP-1, MIP-1alpha, MIP-1beta, IP-10, RANTES)-positive cells and chemokine receptor (CCR5, CXCR3)-positive cells in inflamed human gingival tissues. Cytokine. 20, 70-77 (2002).
- Moughal, N. A., Adonogianaki, E., Kinane, D. F. Langerhans cell dynamics in human gingiva during experimentally induced inflammation. J. Biol. Buccale. 20, 163-167 (1992).
- Cochran, D. L. Inflammation and bone loss in periodontal disease. J. Periodontol. 79, 1569-1576 (2008).
- Taubman, M. A., Valverde, P., Han, X., Kawai, T. Immune response: the key to bone resorption in periodontal disease. J. Periodontol. 76, 2033-2041 (2005).
- Graves, D. T., Kang, J., Andriankaja, O., Wada, K., Rossa, C. Animal models to study host-bacteria interactions involved in periodontitis. Front Oral Biol. 15, 117-132 (2012).
