Genetische Manipulation der Maus entwickeln Hypothalamus durch<em&gt; In utero</em&gt; Elektroporation

Zusammenfassung

Trotz der funktionalen und medizinische Bedeutung des Hypothalamus, In utero Genetische Manipulation seiner Entwicklung hat selten versucht worden. Wir zeigen ein detailliertes Verfahren für In utero Elektroporation in die Maus Hypothalamus und zeigen repräsentative Ergebnisse der vollständigen und teilweisen (regionalen) Hypothalamus Transfektion.

Zusammenfassung

Genetische Modifikation von bestimmten Regionen des sich entwickelnden Gehirn von Säugetieren ist ein sehr mächtiges experimentellen Ansatz. Die Erzeugung neuartiger Mausmutanten ist oft frustrierend langsam. Es wurde gezeigt, dass der Zugang zum Gehirn der Maus zu entwickeln in der Gebärmutter mit hinreichender Post-OP-Überleben möglich ist. Dennoch Ergebnisse mit diesem Verfahren wurden fast ausschließlich für die meisten oberflächlich und leicht zugänglichen Teil des sich entwickelnden Gehirns gemeldet, dh die Rinde. Der Thalamus, ein schmaler und medialen Bereich, hat sich mehr schwer vorbei. Transfektion in tiefere Kerne, insbesondere diejenigen des Hypothalamus, ist vielleicht die größte Herausforderung und daher nur sehr wenige Ergebnisse gemeldet wurden. Hier zeigen wir ein Verfahren, um die gesamte Hypothalamus neuroepithelium oder ein Teil davon (Hypothalamus Regionen) für die Transfektion durch Elektroporation Ziel. Der Schlüssel zu unserem Ansatz sind länger Narkose mal, Injektion in den third Ventrikel und geeignete Art und die Positionierung der Elektroden. Darüber hinaus zeigen wir Ergebnisse von Targeting und anschließende histologische Analyse der meisten vertieften Hypothalamus Kern, die mammillary Körper.

Einleitung

Genetische Manipulation des embryonalen Gehirn der Maus ist eine bevorzugte Ansatz über Entwicklungsregulation lernen. Die Erzeugung von mutierten Maus Linien ist jedoch langsam und teuer. Eine leistungsfähige Methode, um spezifische genetische Veränderungen in sich entwickelnden Neuronen des Gehirns von Säugetieren einzuführen, ist in utero Elektroporation. Im Wesentlichen besteht die Technik der DNA-Transfektion in die embryonalen Gehirn neuroepithelium mittels elektrischer Impulse, dann ermöglicht der Embryo für eine bestimmte Zeit überleben, sammeln das Gehirn und prüft sie auf mögliche neue, informative Phänotypen. Auf diese Weise kann der Experimentato....

Protokoll

1. Herstellung von DNA und Glasmikropipetten zur Injektion

1. Gute Qualität Glasmikropipetten sind unerlässlich, um anfängliche hohe Rate der Fehlgeburten durch den Verlust von Fruchtwasser zu reduzieren. Das Verfahren zur Glasmikropipetten ziehen ist gut ^13,18,25 dokumentiert. Mit 1,2 mm Durchmesser gezogen Kapillaren in einem herkömmlichen Sutter P-97-Gerät mit den Einstellungen P = 500; Wärme = 300; Ziehen = 40; Velocity = 50; Zeit = 50. Den Abzieher mit 3 mm "Trog" Filamente (Sutter Instrument FT330B). Die 2 mm Größe Filamente für uns weniger zufriedenstellende Ergebnisse lieferte. Auf der anderen Seite, hat Abschrägung des Mikropipettenspitzen....

Ergebnisse

Die meisten Hypothalamus Neuronen zwischen E11.5 bis E15.2 geboren, nach der Geburt-dating-Analyse bei der Ratte ²⁶ in die etwas kürzer Mausentwicklung ^27,28 übersetzt. Der Gipfel des Hypothalamus Neurogenese bei E12.5 ^29-31 erreicht. Demgemäß wird zum Transfektion Alter für die vorliegende Studie (E12.5) gewählt wird, kann ein großer Teil der hypothalamischen Neuronen zu einem bestimmten rostro-kaudalen Niveau bezeichnet werden.

Analyse bei E18.5 auf dicken .......

Diskussion

Über der Narkose: Da in utero Elektroporation in den Hypothalamus kann technisch schwierig und erfordern längere Narkose Zeiten bevorzugen wir zu induzieren und Aufrechterhaltung einer Narkose durch Verabreichung einer Mischung aus Sauerstoff und Isofluran. In unserer Erfahrung können Tiere bleiben entsprechend betäubt auf diese Weise für einen Zeitraum von bis zu einer Stunde mindestens, ist die Erholung der Mutter sehr schnell, und Embryo Überleben verbessert. Andere Ansätze zur Anästhesie zur Verfügung. Das .......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
			REAGENTS
Acepromazine	Sanofi GmbH		Anästhetikum
Isofluran	Baxter	HDG9623	Anästhetikum
Ketamin	Pharma GmbH		Anästhetikum
Fast Green	Fluka	44715
Rimadyl	Pfizer		nichtsteroidal entzündungshemmend
Braunoderm	Braun	3887138	Povidon-Jod-Phosphat-Puffer
Kochsalzlösung PBS	Gibco	14190
Temgesic (Buprenorphin)	Essex Pharma		Opioid Analgetikum
Augensalbe	Pan-Ophtal	7136926
Xylazin	Bayer
			EQUIPMENT
Anästhesiegerät Komesaroff Mark-5	Medical Developments Australien	ACN 004 903 682
Kapillarabzieher P-97	Sutter Instrument Co.	P-97
Compresstome	Precisionary Instr.	VF-300	Vibratom-Gerät
Konfokales Mikroskop	Zeiss	LSM700
Kryostat	Leica	CM3050S
Elektroporator	Nepa Gene Co., Ltd.	CUY21EDIT
Elektrode 1	Nepa Gene Co., Ltd.	CUY550-10	Nadelelektrode aus Edelstahl, 10 mm-Spitze, Ø 0,5 mm
Elektrode 2	Nepa Gene Co., Ltd.	CUY700P4L	Abdeckung Runde Platinplatte mit 4 mm Durchmesser
Faseroptische Kaltlichtquelle	Leica	KL2500 LCD&	nbsp;
Glaskapillaren	Harvard Apparatur	GC120T-15	1,2 mm Außendurchmesser x 0,94 mm Innendurchmesser
Glasperlen-Sterilisator	Fine Science Tools	FST250
Heizkissen	Harvard Apparatus	py872-5272
Einspritzvorrichtung	World Precision Instruments	Pneumatische Pico-Pumpe PV820
Nahtfaden beschichtet Vicryl	Ethicon	V4914	Peritonealnaht
Thr. Supramid	Serag Wiessner	TO07171L	Hautnaht