Abstract
אימונוהיסטוכימיה (IHC) מספק מאוד להדמית חלבון מסוימת, אמינה ואטרקטיבית. אחוזי הצלחה ופרשנות של תיוג ססגוני מבוסס IHC הוא מאתגר, במיוחד כאשר נעשו שימוש להערכת גומלין בין חלבוני היעד בתוך הרקמה עם תכולת שומן גבוהה, כגון מערכת העצבים המרכזית (CNS).
הפרוטוקול שלנו מייצג עידון של טכניקת immunolabeling תקן המותאמת במיוחד עבור זיהוי של שני חלבונים המבניים מסיסים בחולדה CNS ובלוטות לימפה היקפיות (LN) מושפעות neuroinflammation. עם זאת, עם או בלי שינויים נוספים, הפרוטוקול שלנו יכול לשמש סבירה לגילוי מטרות חלבון נלווים אחרות, אפילו באיברים ומינים אחרים מאשר כאן מוצגים.
Introduction
למרות ניצול של תפוקה גבוהה מתקדמת וניתוחים שבוצעו על methylome, transcriptome או אפילו ברמה proteome, immunostaining נותר תקן הזהב לגילוי חלבון ישירות במדגם רקמות, תרבית תאים או למרוח התא. מדגים את דפוס לוקליזציה / הפצה, אימונוהיסטוכימיה (IHC) עשויה להעריך יחסי יחסי גומלין הטופוגרפי של חלבוני היעד, ואף מצביעה פעילויות הביולוגיות שלהם. לכן, IHC מנוצל נרחב למטרות קליניות ומחקר, למשל, לאבחון, טיפול הערכות, חקר מנגנוני מחלה, שינויים פונקציונליים phenotypical במודלים של בעלי חיים, וכו '
שעיקרן היסטולוגיה, פתולוגיה, ביוכימיה ואימונולוגיה, IHC התקדמה באופן משמעותי מאז שנת 1941, כאשר fluorescently שכותרתו נוגדנים שימשו בפעם הראשונה לזהות אנטיגנים דלקת ריאות בתוך הרקמה הנגוע 1. Visualization של מוצרים ורכיבים הסלולר על ידי IHC מבוסס על הכריכה של נוגדנים (ABS) כדי אנטיגן הספציפי שלהם (Ag). חוץ מזה באמצעות נוגדנים מתויג fluorophore, תגובות חיסוניות יכול גם להיות דמיינו באמצעות אנזימים כמו phosphatase peroxidase 2,3 או אלקליין 4. יתר על כן, נוגדנים זהב-tagged קולואידים 5 משמשים לאיתור אינטראקציה אנטיגן-נוגדן ספציפי על ידי שני אור במיקרוסקופ אלקטרונים, בעוד תוויות רדיואקטיביים הם דמיינו ידי autoradiography.
Immunoreaction Ag-Ab ניתן לאתר באמצעות שיטות ישירות ועקיפות. השיטה הישירה היא למעשה לקל ולפשוט יותר, כפי שהיא עושה שימוש שכותרתו ישירות העיקרי Abs 6. עם זאת, בשל חוסר משמעותי של רגישות, שיטות עקיפות הם העדיפו את אלה הישירים. שני שלבי נהלי זיהוי עקיפים דורשים ללא תווית Abs העיקרי, כמו הראשון, ומסומן Abs משני המכוון נגד Abs העיקרי, כמו השכבה השנייה 7.הגברה האות יכולה להיות מושגת על ידי מעורבים נוספים, Ab שלישוני מצמידים אנזים (השיטה העקיפה שלושה שלבים) הנקשרת Ab משנית. בדרך כלל שיטות זיהוי עקיף בהם נעשה שימוש הם ביוטין avidin ו peroxidase-antiperoxidase (PAP). לחלופין, phosphatase phosphatase-antialkaline אלקליין (APAAP) מורכב יכול לשמש במקום שיטת PAP. יש לציין, phosphatase אלקליין (AP) שיטות להיראות אפילו יותר רגיש מאשר שיטות אימונו-4. שיטת avidin ביוטין המורכבת (ABC) משתמשת Ab משני biotinylated בשילוב עם-avidin ביוטין המסווג המורכב (LAB), או שכותרתו ביוטין-streptavidin מורכב (לוח). רגישות זיהוי ניתן להגדיל עוד יותר על ידי מעורבים avidin שכותרתו עם phosphatase peroxidase או אלקליין 8. שיטות זיהוי אחרות לשימוש הן תיוג פולימריים, הגברת טירמין ו חיסוני מתגלגל מעגל 9. יש לציין, שיטות זיהוי שונות ניתן לשלב לגילוי Ag מרובה באותו הרקמותמדגם, אשר דווח לראשונה בשנת 1978 4. immunostaining הכפול סימולטני המוצג כאן בוצע קבוע פורמלין, עכברוש-מוטבע פרפין CNS ו LN סעיפי רקמות באמצעות נוגדנים משני peroxidase הנכנס ו AP מצומדות, בהתאמה. האותות היו דמיינו באמצעות 3,3'-diaminobencidine (DAB) אַב צֶבַע ואת הכחול המהיר (FB) APAAP מורכבת, בהתאמה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הצהרה אתית
מחקר נוכחי מתבצע על פי הנחיות מן המועצה הארצית השבדית עבור בחיות מעבדה ואת הנחיית מועצת הקהילה האירופית (86/609 / EEC) תחת ההיתרים האתיים N338 / 09, N15 / 10 ו N65 / 10, אשר אושרו על ידי ועדת האתיקה בעלי חיים בצפון שטוקהולם.
1. רקמות הכנה
- זלוף & קיבעון
- להרדים את החיה עם isoflurane לבצע זלוף transcardial דרך החדר השמאלי. ליזום את השטיפה של כלי דם עם בופר פוספט (PBS) כדי להסיר את רכיבי דם, ואחריו paraformaldehyde 4% ב 0.1 M PBS (PFA).
- לקבע מוחות גזור, מיתרי השדרה ורקמות LN היקפי ידי טבילה לתוך PFA. לאחר 24 שעות ב 4 ° C, להעביר את הרקמה מן PFA לתוך PBS ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס עד לעיבוד נוסף. לחלופין כדי PBS מסחרי, לפזר 9 גרם NaCl ב 250 מ"ל ה- S &# 246; rensen חיץ להוסיף 750 מ"ל מים deionized (DH 2 O); להכין חיץ M סורנסן 0.2 (pH 7.4) לפזר 13.8 גרם לאא 2 PO 4 x 1H 2 O ו 71.2 גרם Na 2 HPO 4 x 2H 2 O ב 2.5 L DH 2 O.
- התייבשות & הטבעה
- חותכים את הרקמה לתוך כ חלקים 5 מ"מ עובי באמצעות סכין גילוח.
- ליזום תהליך התקשות רקמות (התייבשות) באמצעות מעבד הסתננות אבק VIP רקמות-Tek (הליך סטנדרטי מבוסס על השקיעה לתוך ריכוזי עולה של אתנול, ואחריו פרפין קסילן ולבסוף (טבלה 1).
- הנח את הרקמה בתוך תבנית ושופך את פרפין הנוזלי סביב המדגם כדי ליצור "בלוק פרפין". אחסון לטווח ארוך דורש בטמפרטורת החדר (RT). עם זאת, לפני חתך, היא מומלצת להתקרר אבני, למשל, לילה (o / n) בשעה 4 מעלות צלזיוס.
2. חתך
- מניחים את גוש פרפין לתוך מחזיק קבוע המזחלת microtome, אשר יכול לנוע קדימה ואחורה על פני הסכין. התאם את הזווית האופטימלית בין הגוש וסכין microtome (זה תלוי בגיאומטרית סכין, אלא גם על מהירות החיתוך וטכניקה).
- חותכים 3 - 5 מיקרומטר עבה בחיתוכים מהגוש פרפין.
- העבר רק סעיף לחתוך לתוך מיכל מים ולעגן אותה ובהמשך מהמים לשקופית זכוכית.
- לחץ על הסעיף הרכוב בזהירות נגד מגבת נייר כדי להסיר שאריות מים ובועות אוויר פוטנציאליות. מסחרי מראש צופה שקופיות זכוכית דבקות הם מומלצות.
- ניקוי רכוב שקופיות במשך כמה שעות בתנור על 50 - 60 מעלות צלזיוס.
3. Deparaffinization (Rehydration & חסימת אנדוגני Peroxidase)
- לטבול את השקופיות 2x לתוך קסילן (תחליף קסילן לחילופיןXEM-200), בכל פעם 15 - 20 '.
- לשטוף באתנול 99%.
- כדי לחסום את פעילות peroxidase אנדוגני, דגירת הסעיפים 30 'בתמיסת מתנול המכילה מי חמצן 0.25% מימן.
- המשך התייבשות באמצעות אתנול עם הגדלת תכולת מים (99%, 70%, ובסופו של דבר במים מזוקקים.
- מנקודה זו עד ההרכבה של תלושים לכסות חלקים צריכים להישמר לחה.
4. אחזור Antigen
- להשתמש ספינת מזון להרתחת השקופיות פתרון אחזור אנטיגן (במקרה זה EDTA pH 8.5 חיץ) עבור 60 '(פתרון למלאי EDTA מכיל 1.21 גרם טריס ו EDTA 0.37 גרם מומס ב 50 מ"ל DH 2 O; להכין את העבודה פתרון לדלל פתרון 2.5mL EDTA המניות 47.5 מ"ל dH 2 O).
- לצנן את השקופיות על RT עבור כ. hr 1 ולאחר מכן לשטוף 3 - 5x עם טריס שנאגרו מלוחים (TBS, השתמש לחילופין PBS) המורכב 0.05 מ 'טריס ו 0.15 M NaCl; wi pH 7.5 מותאםה HCl. לחלופין להשתמש TBS מסחרי.
5. חסימת אתרי הקישור הנוקבת
- כדי למנוע תגובות רקע נוקבות, דגירת מדורי RT במשך 30 'בפתרון החסימה המכיל סרום עובר עגל 10% (FCS) ו -90% חיץ DAKO.
6. זוגי immunolabeling: דגירה סימולטני עם Abs הראשי
- לדלל הכמות הנדרשת של נוגדנים ראשוניים בפתרון חסימת דגירה o / n ב 4 מעלות צלזיוס. עבור immunostaining כפול לשלב α-eotaxin (Ccl11; 1: 300) עם α-Cd68 (ED1; 1: 1,000) או α-Iba1 (Aif1, 1: 1,000) או α-Cd8α (שור-8; 1: 200) .
- יש לשטוף את השקופיות 3-5x עם TBS חיץ (להשתמש לחילופין 10x מדולל חיץ DAKO).
- לדלל כמות הנדרשת של נוגדנים משני (אנטי-עז biotinylated ו AP מצומדות ועכבר אנטי, הוא 1: 200) בתמיסת חסימת דגירת 1 hr על RT.
- יש לשטוף את השקופיות 3 - 5x עם TBS חיץ (לנודואר לחילופין 10x מדולל חיץ DAKO).
- דגירה השקופיות עם מורכבות peroxidase-חזרת avidin (HRP) מדולל הפתרון חוסם עבור שעה 1 על RT.
- יש לשטוף את השקופיות 3 - 5x עם TBS חיץ (להשתמש לחילופין 10x חיץ בדילול DAKO).
ויזואליזציה 7.
- ויזואליזציה של נוגדנים משני AP שכותרתו כבול
- הכן 0.1 M Tris-HCl חיץ ידי המסת טריס 12.1 גרם 1 L DH 2 O ו להתאים את pH באמצעות HCl. השתמש חיץ טריס-HCl אותו להכין 1 M פתרון levamisole. כן טרי 4% פתרון Nano 2 ב DH 2 O.
- כדי לקבל 50 מ"ל של המצע כחול (FB) מהיר (נפח נדרש אחד קובט זכוכית רגילה) לפזר 6.25 מ"ג Naphtol-AS-MX-פוספט ב 312.5 μl DMF בצינור זכוכית ומערבבים לתוך 50 מ"ל של טרום התחמם (37 מעלות צלזיוס) חיץ טריס-HCl. כדי לפזר 12.5 מ"ג FB RR מלח 312.5 μl 2 N HCl להוסיף 312.5 μl של בעבר prepaאדום 4% פתרון Nano 2 ומערבבים את התערובת לתוך אותו 50 מ"ל של חיץ מראש חימם Tris-HCl. לנער קל עד שהנוזלים הצהובים מתבהרים ולבסוף להוסיף 77 μl של פתרון בעבר הכין 1 M Levamisole. תסנין המתקבל תערובת ויוצקים על גבי שקופיות להציב קובט זכוכית.
- ליזום את הדגירה על 37 מעלות צלזיוס ולשלוט בפיתוח תהליך תחת מיקרוסקופ אור כ. כל 15 - 30 דקות. אם פונה מטושטש, להחליף את פתרון FB בתערובת טרייה.
- יש לשטוף את השקופיות 3 - 5x עם TBS חיץ ולהעביר לאחר מכן למאגר PBS.
- ויזואליזציה של נוגדנים משני biotinylated כבול
- הכן DAB / H 2 O 2 לפתח פתרון על ידי דילול 1 מ"ל פתרון המניות DAB (25 מ"ג DAB לכל 1 מ"ל PBS) ב 49 מ"ל PBS. להוסיף 16.5 μl H 2 O 2 ו תסנין לפני לשפוך על הסעיפים.
- המרה של DAB אַב צֶבַע לתוך המצח מזרזפיגמנט n יכול להיות מיידי. לשלוט בתהליך הפיתוח תחת מיקרוסקופ האור (אפילו כמה דגירה כבר שנייה עשויים להעלות רקע גבוה ומסווה את האות המסוימת).
- עוצמת המשקע פיגמנט חום ניתן לשפר לחילופין על ידי הדגרה הפתרון המורכב בגפרת-נחושת 2% ו -0.9% NaCl עבור 5 '.
- יש לשטוף את השקופיות 3 - 5x עם PBS ולבסוף עם DH 2 O, להשתמש לחילופין מי ברז.
- הר שקופיות עם תלושי לכסות ישירות מהמים באמצעות הרכבה בינונית GelTol מימית. הימנע מיצירת בועות אוויר.
- אפשר ייבוש מלא של הרכבה בינונית, למשל, o / n ב 4 ° C.. חנות יבשה שקופיות על RT.
| 1. | % אתנול | 20 ' | 40 ° C |
| 2. | % אתנול | 60 &# 39; | 40 ° C |
| 3. | % אתנול | 90 ' | 40 ° C |
| 4. | % אתנול | 60 ' | 40 ° C |
| 5. | % אתנול | 90 ' | 40 ° C |
| 6. | % אתנול | 60 ' | 40 ° C |
| 7. | % אתנול | 90 ' | 40 ° C |
| 8. | % אתנול | 120 ' | 40 ° C |
| 9. | Xylol | 30 ' | 40 ° C |
| 10. | Xylol | 60 ' | 40 ° C |
| 11. | פָּרָפִין | 60 ' | 60 ° C |
| 12. | פָּרָפִין | 60 ' | 60 ° C |
| 13. | פָּרָפִין | 60 ' | 60 ° C |
| 14. | פָּרָפִין | 120 ' | 60 ° C |
עיבוד רקמות בטבלה 1. על ידי מעבד הסתננות אבק VIP רקמות-Tek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
immunostainings הזוגי (שיתוף stainings) בוצע קבוע פורמלין, עכברוש-מוטבע פרפין סעיפי CNS ו LN. 3-5 מיקרומטר פרוסות עבות רקמות נחתכו באמצעות מזחלת microtome, רכוב ובהמשך על גבי שקופיות זכוכית דבקות מראש מצופה ומטופל כפי שתואר לעיל 10,11,12. בקצרה, לאחר deparaffinizing, התייבשות רקמות איון peroxidase אנדוגני, סעיפים היו נתונים בתהליך יחזור אנטיגן, ואחריו צעד חסימה לחסל אתרי קישור נוקבים. שיתוף stainings בוצעו, לפי הצירופים הבאים: i) Ccl11 / איבא-1, ii) Ccl11 / ED1 ו- III) Ccl11 / CD8. את שרירי הבטן העיקריות המשמשת עבור כל שיתוף מכתים הועלו בשני מינים שונים (עזה ועכבר, בהתאמה), מה שאפשר הדגירה של שני אלה. Ccl11 היה דמיין ידי מוצר תגובת peroxidase החום, בעוד תייבאו-1, ED1 ו CD8, היו דמיינו ידי אות AP הכחול.
יפ-together.within-page = "1"> תוצאות המוצגות כאן כבר תוארו בפירוט רב יותר והן בהקשר רחב יותר במחקר האחרון שלנו לגבי תפקידיו של chemokine Ccl11 ב טרשת נפוצה (MS)-כמו neuroinflammation 10. לדברי IHC ניתוחי ביצע בחולדה CNS, Ccl11 נכח pericarya, דנדריטים אקסונים של נוירונים ממוקם קרניים הגחון של החומר האפור בחוט השדרה (איור 1 א 'וב'). יתר על כן, תאים Ccl11 + פלזמה יחיד היה ניתן להבחין בהן באותה קטעי רקמה (איור 1 א), וכן יחיד Ccl11 + / ED1 + מקרופאגים microglia תושב המוח נצפו באתר דלקת (מידע לא מוצג; ED1 הוא סמן של חלבון ליזוזומלית ב מקרופאגים מופעל microglia 13). יש לציין, chemokine Ccl11 לא נמצאה שיתוף לוקליזציה עם איבא-1 + מקרופאגים microglia תושב המוח (1A; איבא-1 הוא סמן לאיתור מיונן Ca 2+ -bindi ng חלבון 14).
IHC מבוסס חלבון מיקוד שבוצע LN העכברוש ההיקפי הציג חלבון Ccl11 שיתוף לוקליזציה עם ED1 (איור 2 ב). עם זאת, אין לימפוציטים Ccl11 מפריש CD8 + T היה ניתן להבחין בן באותה קטעי רקמה (איור 2 א; CD8 + תאים התגלו באמצעות אנטי Cd8α, סמן תאי T ציטוטוקסיים בעיקר אשר נקלטים על ידי כיתת MHC אני מולקולות 15). פרט להשמטת Abs העיקרי במהלך o / n דגירת הפתרון החוסם, סעיפי שליטה טופלו כמתואר בפרוטוקול. אין אותות זיהוי של חלבוני היעד (כפי שהוצגו 1A הדמוי, B ו- 2A, B) נצפו בסעיפים המלאים CNS ו LN (איור 1 ג ו 2C, בהתאמה).
s / ftp_upload / 50,425 / 50425fig1.jpg "/>
איור 1. A, B: זוגי Immunostaining ב LN עכברוש. נוגדנים ראשוניים מכוונת נגד chemokine Ccl11 בשילוב עם או α-CD8 (א) או ED1 (B). אין שיתוף לוקליזציה בתוך אותו תא נצפתה Ccl11 + (חום) CD8 + תאים (כחול) B:. אות זיהוי Ccl11 (חום) שיתוף לוקליזציה עם סמן חלבון ליזוזומלית מקרופאגים (ED1, כחול). C: בקרה שלילית; פרט מראה תאי תושב ללא תווית ב- LN הפריפריה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. A, B: זוגי Immunostaining בחולדה Sקורד Pinal. צופר הגחון של החומר האפור מפגין Ccl11 ב pericarya העצבית, דנדריטים אקסונים (חום) מוכתם שיתוף עם או איבא-1 + (A; כחול) או ED1 + (B; כחול) מקרופאגים / תאים microglia C:. בקרה שלילית; פרט מראה תאים תושב ללא תווית בקרן הגחון של החומר האפור בחוט השדרה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
נהלי IHC רגילים לעתים קרובות דורשים התאמות ספציפיות כדי להשיג תוצאה אופטימלית, מה שמרמז ניסיון רב נפוץ אבל גם "ניסוי וטעייה" גישה. מ הכנת רקמה עד להדמית היעד, כמעט כל צעד בפרוטוקול עלול להיות כפוף להם כדי המעוצבים באופן אינדיבידואלי שינויים על מנת לשפר את התוצאה הסופית. פרוטוקול מכתים זוגי המוצג כאן מדגים חלבון מבוסס IHC מיקוד מותאם במיוחד להערכת גומלין בין חלבוני היעד של העניין שלנו קבוע פורמלין, עכברוש-מוטבע פרפין סעיפי רקמות CNS ו LN מושפעים neuroinflammation. ככזה, הוא יכול לשמש הדרכה ללימוד הטכניקה של IHC, אלא גם כמקור השראה לניסויים מתקדמים יותר. עם זאת, יש לזכור כי רפרודוקציה גרידא של פרוטוקול זה למיקוד חלבונים אחרים ו / או ברקמות אחרות מאשר כאן מוצגים עשויים להפיק תוצאות לא טובות.
> הכלאה באתרו באמצעות נעול חומצות גרעין (LNA) riboprobe נגד Ccl11 הציג upregulation של רמות ה- mRNA בהתאמה ב CNS של זן העכברים congenic 10. ממצא זה אושר על ידי qPCR מנתח. יתר על כן, qPCR חשף upregulation Ccl11 גם LN היקפי congenic בהשוואה סוג בר (WT) זן. לבסוף, כתם המערבי (WB) הראה upregulation משמעותי של חלבון Ccl11 בשתי רקמות היעד של זן העכברים congenic מוגן המחלה 10. לכן, אנו בקשנו לבחון את מקור הכמוקין ישירות ברקמות היעד, ולשם כך פתחנו את הפרוטוקול המכתים הכפול המתואר לעיל.
מלבד הימנעות מזיק מכני של הרקמה במהלך לנתיחה שלאחר המוות ופוסט קיבעון decalcification, חתך רקמות עשויה להיראות די מאתגר. החתך בדרך כלל דורש מיומנות ותרגול. איכות הפרוסה תלויה של היבטים רביםuch כמו התאמת זווית ישרה בין גוש רקמות הסכין כדי להפחית את הלחץ המופעל על מדגם במהלך חיתוך, מהירות חיתוך, וכו 'עובי הפרוסות רקמות מוטבע פרפין המיוצר על ידי מזחלת microtome עשוי להשתנות בין 2 ל 50 מיקרומטר. חותכים פרוסות הרקמה פרפין הם רכובים מתוך באמבט מים חמים על גבי שקופיות זכוכית רצוי מצופה מסחרית עם דבק כגון פולי- L- ליזין או aminopropyltriethoxysilane (APTS) כדי להבטיח אחיזה טובה יותר במהלך ההליך מכתים בדרישה. בניגוד cryo סעיפים רקמות אשר נחתכים על כ -20 ° C באמצעות cryomicrotome מיובשים ב RT לפני מכתים, מקורר בלוקים פרפין פרוס ב RT, מיובשים לאחר מכן ב 50 60 ° C לפני deparaffinization.
מאוד השתמרנו רקמות אדריכלות, אפיטופים מורפולוגיה יעד תא חיוניים להערכת לוקליזציה גומלין של חלבוני היעד. על מנת להשיג preser רקמה האופטימלייש vation, דגימות להיות קבוע כראוי, באף אחת מקריש או fixatives cross-linking. fixatives קרישה, כגון אתנול, הם לעתים קרובות יותר משמש cryopreservation. Denaturation חלבון באמצעות אתנול מושג באמצעות התייבשות רקמת 9; דבר אשר עלול לגרום שימור הסלולר לקוי 16. בניגוד fixatives המקריש, פורמלדהיד הוא מקבע מקשר צולב אשר רוב תדירה היסטולוגיה שגרתית IHC 9 הן שימור רקמת cryo- ונפט. השגנו קיבעון אופטימלי עבור החולדה CNS ו LN ידי טבילה לתוך פתרון פורמלדהיד במשך 24 שעות ב 4 ° C לפני decalcification והטבעה פרפין שלאחר מכן. למרות גרימת שינויים עמוקים הקונפורמציה של מקרומולקולות (פורמלדהיד כלומר יוצר גשרים מתילן כי crosslink חלבונים ובכך להסוות אנטיגנים, אשר עשוי למנוע ספציפית מחייב של נוגדנים), זה חצי-הפיך, מגיב קוולנטיים מספק גבוהה qualשימור רקמת ity. יש לציין, הטמפרטורה ומשך קיבעון עם ריאגנטים cross-linking עשוי להשפיע על כמה מן ההיבטים של IHC כגון חתך, זיהוי epitope ואפילו תגובתיות צולבת. כך הוא לפי-קיבעון יתר הקיבוע באמצעות ריאגנטים מבוססים אלדהיד כגון פורמלדהיד עלול לגרום חפצים כי הם בעיקר בשל autolysis או 17 צולבות קישורים מוגזמים, בהתאמה. אף על פי כן, מכתים רקע נוקב בשל חלבון הידרופובי כריכה שנצפה על ידי overfixation ניתן להפחית באמצעות מאגרים מומלחים נמוכים המכילים דטרגנטים nonionic, או על ידי העלאת ה- pH של חיץ הדילול בעת שימוש Abs polyclonal 18. עם זאת, מכתים רקע נוקב (רעש) הנגרם על ידי אינטראקציות חלבון יוניות אלקטרוסטטי יכול להיות מופחת באמצעות מאגרי diluent עם כוח יוני גבוה, אשר בעת ובעונה האחת עלול להחמיר את הרעש הנגרם על ידי חלבון הידרופובי מחייב 18. כשמדובר זיהוי של אפיטופים היעד, פורמלדהיד-iשינוי nduced של מבנה שלישוני של חלבונים יכול להיות, אם כי לא לגמרי, הפוך על ידי אחזור אנטיגן 19: i) על ידי חימום מאגרים עם ערכי pH שונים (אחזור epitope המושרה בחום (הייר), ii) על ידי השפלה אנזימטי (פרוטאז-induced יחזור epitope (מזח; 20)), iii) על ידי הדגרת אלקליין חזקה או פתרון חומצה, או סוכרוז 21, 22 או IIII) על ידי טיפול עם חומצה פורמית מרוכזת 23. הייר מופיע נוח רוב היעד אפיטופים 19. מלבד משך חימום, ערך ה- pH של הפתרונים כגון EDTA (pH 5.5, 8.5 או 9.0) או חיץ נתרן ציטרט (pH 6.0- 6.2) עשוי להיות חיוני לתוצאה של הייר. יש לציין, כי התוצאה המספקת ביותר במחקר שלנו הושגה על ידי אידוי הדגימות עבור 1h בפתרון EDTA עם ערך pH 8.5.
למרות נוגדנים מעדיפים להיקשר אפיטופים הספציפיים שלהם, משיכה ספציפית, בדומה Ag מאותו המקור מחייבאתרים, לא ניתן לשלול לחלוטין. יש לציין, כנראה השיטה היעילה ביותר לצמצום מכתים הרקע הוא הדגירה בחסימת חלבונים (כגון FCS השתמשו במחקר שלנו) לפני היישום של שרירי הבטן העיקרי 9. Abs חד השבטי העיקרי עדיף בכל מקרה מעל שרירי בטן polyclonal בשל סגולי גבוהה יותר ובכך אות רקע נוקב מופחתת. אף על פי כן, תגובתיות צולבת עדיין עשויה להופיע, כמו שרירי בטן monoclonal מופנים נגד אפיטופים המורכבים בדרך כלל ממספר קטן של חומצות אמינו, אשר עשוי להיות חלק מאיזה אחר (נוקבים) חלבון 24. בניגוד חד שבטי, Abs polyclonal יש סיכוי גבוה יותר של הכרת isoforms המרובה של חלבון המטרה. אנחנו בתחילה השתמשנו בשני Abs העיקרי שונה כדי לזהות Ccl11: i) polyclonal וגדל עיזים ii) monoclonal וגדל עכבר. בידיים שלנו, שני המוצרים הציג אותו דפוס מכתים עבור chemokine היעד. על מנת לבצע שיתוף מכתים סימולטני, השתמשנו Ccl1 עכברוש עז אנטיAb 1 בשילוב עם נוגדנים נגד איבא-1, ED1 ו CD8, בהתאמה, אשר כל יוצרו העכבר. עם זאת, מלבד בעת ובעונה אחת, immunostaining הכפול יכול גם להתבצע ברצף 25, כנדרש על שיתוף תיוג של שרירי הבטן העיקריות המיוצרות מאותו המין.
ריכוז העבודה האופטימלי של שרירי הבטן השתמשו במחקר שלנו נאמד באמצעות סדרת מבחן-דילול כמו יחס אופטימלי בין עוצמת האות הספציפי ואת רעשי הרקע. עם זאת, יש לזכור כי ריכוז עבודה אופטימלי של אותו הנוגדן יכול לפעמים להשתנות בין איברים, מינים, פתולוגיה רקע, וכו 'יש לציין, permeabilization לא נדרש בהליך המכתים שלנו שבוצע פרפין מוטבע, 3-5 מיקרומטר קטעי רקמה עבה, עם זאת, דטרגנטים כמו טריטון X-100 יכול עדיין שימשו להפחתת מתח הפנים ובכך להקל על מחייב בין אנטיגן נוגדן. עלשיפור להיפך, permeabilization- בתיווך של חדירה Ab נדרש בדרך כלל לגילוי חלבון בתאים בתרבית או השעיות תא (immunocytochemistry (ICC)), עבור immunofluorescence (IF) בסעיפים קריו ו IHC / IF ב טריים (עבה, vibratome לחתוך) חופשיות צף בחתכי רקמה.
פקדים מרובים הם בעצם חשובים ליצירת immunotargeting הספציפי / אמין. כביקורת חיובית, השתמשנו ריאות ממודל חולדה של אסטמה, שבו נוכל לזהות Ccl11 + אאוזינופילים. הפקדים השליליים הודגרו רק o פתרון חסימה / n ב 4 ° C בהיעדרו של שרירי הבטן העיקריות.
כבר הזכרנו כמה סיבות ותרופות פוטנציאל ההפחתה של אות רקע. מוצר immunostaining נוקבים עלול להתרחש גם כתגובה בין DAB ו pseudoperoxidase של תאי דם אדומים peroxidase של תאים מיאלואידית 26. פעילות של אנזימים אלה, בדיוק כמו קאוס הרעשed ידי ביוטין אנדוגני או AP הופחת כבר במהלך קיבוע בפורמלין. עם זאת, המקדים עם מתנול / H 2 O 2 הוא הכרחי הנוסף או להשלים האיון שלהם 27, 28. מכתים רקע הנגרם על ידי פעילות AP ברקמות יונקות יכול להיות מעוכב עוד יותר על ידי levamisole 29, או על ידי חומצה אצטית 29. מחייב נוקב כמו התוצאה של משיכה יונית בין avidin ומולקולות הסלולר ו"חורים 30 ניתן להימנע על ידי החלפת avidin לבין חלמון עם streptavidin מ Streptomyces avidinii 31.
DAB הוא כנראה אַב צֶבַע הנפוץ ביותר בשימוש ב IHC. מלבד DAB (המוצר התגובה חום), chromogens peroxidase אחרים לשימוש הן 3-אמינו-9-ethylcarbazole (AEC; אדום), 4-כלור-1-Naphthol (CN, כחול) tetramethylbenzidine (TMB; כחול). chromogens AP נבחר בדרך כלל הם FB, מהיר האדום (FR), fuchsin חדשים 5-bromo-4-כלורו-3-indolylphosphate / ניטרו blue כלוריד tetrazolium (BCIP / NBT). הבחירה של אנזימי chromogens היא בעצם עניין של העדפה אישית, עם זאת, ייתכן שאת תובילי את תכונות היעד כגון לוקליזציה, דפוס ביטוי, אלא גם על ידי הנוכחות של פיגמנטים אנדוגני (מלנין, hemosiderin) 32. Counterstain היא הצעד האחרון, פקולטטיבי בהליך IHC בדרך כלל מבוצע באמצעות hematoxylin, אדום מהיר גרעיני או מתיל 18 ירוק. באופן כללי יותר מתאים התיוג היחיד, counterstain הופך לפשוט יותר את הפרשנות של מורפולוגיה רקמות וזה צריך להיות מפותח בעדינות כדי למנוע הפרעה כלשהי עם משקע אַב צֶבַע.
עם השלמת קטעים מכתים הליך רקמות צריך להיות מותקן בזהירות עם coverslip באמצעות הרכבה בינונית. היווצרות של בועות אוויר יש להימנע. לצד הגנה פיזית, הרכבה בינונית משפר ראיה ואיכות ההדמיה. כך או אורגני / הידרופובי או מימי / הידרופילי, ה- CHOICE של מדיום ההרכבה בהתאם מסיסות של המוצר הסופי של הממס האורגני. בעוד הרכבה בינונית מבוסס toluene- יהיה מתאים, למשל, עבור DAB, הרכבה בינונית מימית ניתן ליישם לכל chromogens האנזימטית, לרבות סימון פלואורסצנטי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Isoflurane (Isofluran): 1-Chlor-2,2,2-trifluorethyl (difluormethyl ether) 2-Chlor-2-(difluormethoxy)-1,1,1-trifluorethan (C3H2ClF5O) | Baxter | 1001936060 | Eye irradiation. Probably influences fertility and damages baby in uterus. Administer only in adequately equipped anesthetizing environment. |
| Sodiumchloride (NaCl) | Merck | 1.0604 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS), tablet | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Paraformaldehyde (OH(CH2O)nH (n = 8 - 100)), 4% in 1x PBS | Apl pharma | 34 24 28 | Health hazard. Corrosive. Flamable. Acute toxicity. |
| Ethanol ≥99.5%, absolute (CH3CH2OH) | Sigma-Aldrich | 459844-1L | Flamable. |
| Xylene (Xylenes, histological grade; C6H4(CH3)2 | Sigma-Aldrich | 534056 | Flamable. Acute toxicity. |
| Histo-Comp Paraffin Wax | Tissue-Tek | V0-5-1001 | |
| Adhesive Microscope Slides | Starfrost | MIC-1040-W | |
| Xylol substitute XEM-200 | Vogel GmbH | ND-HS-200 | Respiratory sensitization. Carcinogenicity. |
| α-CD8 (Ox-8) mouse anti-rat, primary antibody | AbD Serotec | MCA48G | |
| α-Iba1 (AIF1) mouse anti-rat, primary antibody | Millipore | MABN92 | |
| α-CD68 (ED1) mouse anti-rat, primary antibody | AbD Serotec | MCA341R | |
| α-eotaxin C-19 (CCL11) goat anti-rat, primary antibody | Santa Cruz BT | SC-6181 | |
| Alkaline phosphatase (AP)-conjugated secondary antibody | Dakopatts, Denmark | D0314 | |
| Biotinylated secondary antibody | Amersham Biotech | RPN1025 | |
| Avidin- horseradish peroxidase complex (HRP) | Sigma-Aldrich | A3151 | |
| Naphthol AS-MX phosphate (C19H18NO5P) | Sigma-Aldrich | N4875-1G | Acute toxicity. |
| Fast Blue RR Salt, Azoic Diazo No. 24 (C15H14ClN3O3 x 1/2 ZnCl2) | Sigma-Aldrich | FBS25 | |
| Levamisol hydrochloride (C11H13ClN2S) | Sigma-Aldrich | 31742 | Acute toxicity. |
| 3,3'-Diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB Chromogen) | DAKO | S3000 | Highly flammable. Toxic. |
| Copper sulphate (CuSO4) | Merck | 1.02791 | Acute toxicity. Environmental hazzard. |
| GelTol Aqueous Mounting Medium | Thermo Electron Corporation | 230100 | |
| Hydrogen peroxide, 30% (H2O2) | Merck | 107210 | Acute toxicity. |
| Methanol (CH3OH) | Fluka | 65543 | Acute toxicity. Respiratory sensitization. Carcinogenicity. Flammable. |
| Tris (hydroxymethyl) aminomethane, TRIS base (C4H11NO3 ) | AppliChem | A1379 | Skin and eye irritation. |
| Tris Buffered Saline (TBS), tablet | Sigma-Aldrich | T5030 | |
| Di- Sodium hydrogen phosphate dihydrate (Na2HPO4 x 2H2O) | Merck | 1.0658 | |
| Sodium dihydrogen phosphate monohydrate (NaH2PO4 x 1H2O) | Merck | 1.06346 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Cambrex BioScience | DE-14-802F | |
| DAKO cytomation wash buffer 10x | DAKO | S3006 | Should be stored at 2-8 °C to inhibit bacterial growth. Avoid foaming. |
| N,N-Dimethylformamide; DMF (C3H7NO) | Fluka | 40250 | Flammable. Acute toxicity. |
| Glas coverslips 24 x 36 mm | Menzel-Gläser | BB024036A1 | |
| Hydrochloric acid, conc. (HCl) | Sigma-Aldrich | 30721 | Corrosive, irritant, permeator. Lung sensitizer (as acid mist). Toxic. |
| Hydrochloric acid solution volumetric, 2 M HCl (2 N) | Fluka | 71826 | Corrosive, irritant, permeator. Lung sensitizer (as acid mist). Toxic. |
| Sodium nitrite, ReagentPlus, ≥99.0% (NaNO2) | Sigma-Aldrich | S2252 | Oxidant. Toxic. Dangerous for the environment. |
| Ethylenedinitrilotetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA; C10H14N2Na2O8 x 2H2O) | Merck | 1.08454 | Oral exposures may cause reproductive and developmental effects. |
| Equipment | |||
| Tissue-TekV.I.P Vacuum Infiltration Processor | Sakura | 5902 VIP Jr. 115 V, 60 Hz | |
| Hacker-Bright 8000 Series Base Sledge Microtome | Hacker instruments | ||
| Household food steamer | Braun | MultiGourmet FS 20 | |
| Light microscope | Leica Polyvar 2 | ||
References
- Coons, A., Creech, H. J., Jones, R. N. Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group. Proc Soc Exp Biol Med. 47, 200-202 (1941).
- Nakane, P. K., Pierce, G. B. Enzyme-labeled antibodies: preparation and application for the localization of antigens. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 14, 929-931 (1966).
- Avrameas, S., Uriel, J. Method of antigen and antibody labelling with enzymes and its immunodiffusion application. C R Acad Sci Hebd Seances Acad Sci D. 262, 2543-2545 (1966).
- Mason, D. Y., Sammons, R. Rapid preparation of peroxidase: anti-peroxidase complexes for immunocytochemical use. Journal of immunological. 20, 317-324 (1978).
- Faulk, W. P., Taylor, G. M. An immunocolloid method for the electron microscope. Immunochemistry. 8, 1081-1083 (1971).
- Coons, A. H., Kaplan, M. H. Localization of antigen in tissue cells; improvements in a method for the detection of antigen by means of fluorescent antibody. The Journal of experimental medicine. 91, 1-13 (1950).
- Polak, J. M., Van Noorden, S. Introduction to immunocytochemistry. , Bios Scientific Publishers Ltd. Oxford, UK. (2003).
- Elias, J. M., Margiotta, M., Gaborc, D. Sensitivity and detection efficiency of the peroxidase antiperoxidase (PAP), avidin-biotin peroxidase complex (ABC), and peroxidase-labeled avidin-biotin (LAB) methods. American journal of clinical pathology. 92, 62-67 (1989).
- Ramos-Vara, J. A.
- Adzemovic, M. Z., et al. Expression of Ccl11 associates with immune response modulation and protection against neuroinflammation in rats. PloS one. 7, 39794 (2012).
- Bauer, J., et al. Endoplasmic reticulum stress in PLP-overexpressing transgenic rats: gray matter oligodendrocytes are more vulnerable than white matter oligodendrocytes. Journal of neuropathology and experimental neurology. 61, 12-22 (2002).
- Bradl, M., Bauer, J., Flugel, A., Wekerle, H., Lassmann, H. Complementary contribution of CD4 and CD8 T lymphocytes to T-cell infiltration of the intact and the degenerative spinal cord. The American journal of pathology. 166, 1441-1450 (2005).
- Zhang, C., Lam, T. T., Tso, M. O. Heterogeneous populations of microglia/macrophages in the retina and their activation after retinal ischemia and reperfusion injury. Experimental eye research. 81, 700-709 (2005).
- Hirasawa, T., et al. Visualization of microglia in living tissues using Iba1-EGFP transgenic mice. Journal of neuroscience research. 81, 357-362 (2005).
- Norment, A. M., Salter, R. D., Parham, P., Engelhard, V. H., Littman, D. R. Cell-cell adhesion mediated by CD8 and MHC class I molecules. Nature. 336, 79-81 (1988).
- Hoetelmans, R. W., van Slooten, H. J., Keijzer, R., Jvan de Velde, C. J., van Dierendonck, J. H. Routine formaldehyde fixation irreversibly reduces immunoreactivity of Bcl-2 in the nuclear compartment of breast cancer cells, but not in the cytoplasm. Applied immunohistochemistry & molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 9, 74-80 (2001).
- Hayat, M. Microscopy, Immunohistochemistry and antigen retrieval methods for light and electron microscopy. , Kluwer Academic. New York. (2002).
- Boenisch, T. Formalin-fixed and heat-retrieved tissue antigens: a comparison of their immunoreactivity in experimental antibody diluents. Applied immunohistochemistry & molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 9, 176-179 (2001).
- Shi, S. R., Key, M. E., Kalra, K. L. Antigen retrieval in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues: an enhancement method for immunohistochemical staining based on microwave oven heating of tissue sections. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 39, 741-748 (1991).
- Huang, S. N. Immunohistochemical demonstration of hepatitis B core and surface antigens in paraffin sections. Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 33, 88-95 (1975).
- Shi, S. R., Cote, R. J., Taylor, C. R. Antigen retrieval immunohistochemistry: past, present, and future. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 45, 327-343 (1997).
- Taylor, C. R., Shi, S. R. Antigen retrieval: call for a return to first principles. Applied immunohistochemistry & molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 8, 173-174 (2000).
- Kitamoto, T., Ogomori, K., Tateishi, J., Prusiner, S. B. Formic acid pretreatment enhances immunostaining of cerebral and systemic amyloids. Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 57, 230-236 (1987).
- Nelson, P. N., et al.
- Van der Loos, C. Immunoenzyme multiple staining methods. , Bios Scientifc publishers Ltd. New York. (1999).
- Elias, J. Immunohistopathology. A practical approach to diagnosis. , ASCP Press. Chicago. (2003).
- Straus, W. Letter: Cleavage of heme from horseradish peroxidase by methanol with inhibition of enzymic activity. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 22, 908-911 (1974).
- Streefkerk, J. G. Inhibition of erythrocyte pseudoperoxidase activity by treatment with hydrogen peroxide following methanol. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 20, 829-831 (1972).
- Ponder, B. A., Wilkinson, M. M. Inhibition of endogenous tissue alkaline phosphatase with the use of alkaline phosphatase conjugates in immunohistochemistry. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 29, 981-984 (1981).
- Petrelli, F., Coderoni, S., Moretti, P., Paparelli, M. Effect of biotin on phosphorylation, acetylation, methylation of rat liver histones. Molecular biology reports. 4, 87-92 (1978).
- Yagi, T., Terada, N., Baba, T., Ohno, S. Localization of endogenous biotin-containing proteins in mouse Bergmann glial cells. The Histochemical journal. 34, 567-572 (2002).
- Van Hecke, D. Routine Immunohistochemical Staining Today: Choices to Make, Challenges to Take. Journal of Histotechnology. 1, 45-54 (2002).
