Summary
Dieser Artikel beschreibt die Verwendung eines Leuchtkäfer-Luciferase-GFP-Fusionsprotein zu untersuchen,
Abstract
Proteostasis, da die kombinierten Prozesse der Proteinfaltung / Biogenese definiert ist Rückfaltung / Reparatur und Abbau, ein empfindliches Gleichgewicht, das zelluläre gehalten, um zu vermeiden schädliche Folgen 1 werden muss. Externe oder interne Faktoren, die dieses Gleichgewicht stören können, um Protein-Aggregation, Toxizität und Zelltod führen. Beim Menschen ist ein wichtiger Faktor, um die Symptome, die mit neurodegenerativen Erkrankungen wie Chorea Huntington, Parkinson-und Alzheimer-Krankheiten 10 verbunden. Es ist daher wichtig, dass die Proteine in der Instandhaltung von Proteostase beteiligt identifiziert werden, um Behandlungen für diese schwächenden Krankheiten zu entwickeln. Dieser Artikel beschreibt Techniken zur Überwachung in vivo Proteinfaltung in Quasi-Echtzeit Auflösung mit dem Modell Protein Glühwürmchenluciferase fusioniert mit grün fluoreszierende Protein (GFP-FFL). FFL-GFP ist ein einzigartiges Modell chimären Proteins als die FFL-Einheit ist extrem empfindlich auf Stress-induzierten misfolding und Aggregation, die das Enzym inaktiviert 12. Die Luciferase-Aktivität überwacht wird unter Verwendung eines enzymatischen Assay, und das GFP-Einheit stellt ein Verfahren zur Visualisierung von löslichen oder aggregierten FFL mit automatisierten Mikroskopie. Diese Methoden gekoppelt sind mit zwei parallel und technisch unabhängige Ansätze, sowohl Rückfaltung und funktionellen Reaktivierung eines Enzyms nach Stress zu analysieren. Aktivität Erholung können direkt mit Kinetik der Disaggregation und Re-Solubilisierung korreliert werden, um besser zu verstehen, wie Protein-Qualitätskontrolle Faktoren wie Protein Chaperone um diese Funktionen auszuführen zusammenarbeiten. Darüber hinaus können Deletionen oder Mutationen zur Beiträge von spezifischen Proteinen oder Protein-Untereinheiten diesem Verfahren getestet werden. In diesem Artikel untersuchen wir die Beiträge des Proteins disaggregase Hsp104 13, bekannt, eine Partnerschaft mit der Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) Rückfaltung System 5, zu Proteinrückfaltung, diesen Ansatz zu validieren.
Introduction
Beim Menschen neurodegenerativen Erkrankungen wie Alzheimer, Parkinson und Huntington-Krankheit haben Proteinfehlfaltungen und Aggregation 10 verbunden. Cells beschäftigen molekulare Chaperone, um kinetische Trapping von zellulären Proteinen in misfolded inaktiven Strukturen 6 zu verhindern. Chaperone Teilnahme in komplizierten Wechselwirkung Netzwerke innerhalb der Zelle, aber es ist nicht vollständig geklärt, wie die Summe dieser Wechselwirkungen organismal Proteostase beiträgt. Eines der wichtigsten Chaperone für die Mehrheit der cytosolischen Proteinfaltung ist die 70 kD Hitzeschockprotein (Hsp70) Familie 19. Es hat sich gezeigt, dass in der Hefe Verlust von Hsp70 verringert die Fähigkeit, entstehende heterolog exprimiert FFL zu falten und das endogene Protein, Ornithin transcarbamoylase, in vivo 18, 7 falten. Die Fähigkeit zur Analyse mit nahezu Echtzeit Auflösung Faltung erleichtern das Verständnis, wie zusätzliche zelluläre Faktoren contribute dieser Hsp70-abhängigen Prozess. Darüber hinaus Falten / Umfaltungsreaktionen möglicherweise nicht völlig abhängig von diesen Beitrag Proteine, so Assays muss empfindlich genug, um sowohl große als auch kleine Veränderungen in der Kinetik und Effizienz zu erfassen.
Die Hefezelle disaggregase, Hsp104, spielt eine wichtige Rolle bei der Reparatur von aggregierten Proteinen misfolded. Obwohl Hsp104 Homologe in Pilzen und Pflanzen identifiziert worden sind, erscheint diese Familie zu sein, in Metazoen abwesend. Es wurde vorgeschlagen, dass andere Chaperone wie denen des Hsp110 Familie einige der bekannten Hsp104 Aktivitäten in Säugetieren 16 durchzuführen. Hsp104 ist ein AAA +, hexameren Protein-Komplex, dass die Funktionen in der Hefe zu renovieren Proteinaggregaten, einen Beitrag zur Rückfaltung und Reparatur 13. Hsp104, zusammen mit der Hefe Hsp70, Ssa1 und der Hefe Hsp40, Ydj1, zur Verwertung von denaturiertem FFL in Hefezellen 5, 8 erforderlich. Die kleinen Hitzeschock-Protein, Hsp26, hat auch gezeigt, dass requi seinrot für Hsp104-vermittelte Aufschlüsselung der FFL 2.
FFL ist ein Zwei-Domänen-Protein, das das Substrat Luciferin in der aktiven Stelle und infolge einer Konformationsänderung, ATP und Sauerstoff decarboxyliert erfordert bindet das Substrat und setzt Oxiluciferin, Kohlendioxid (CO 2), Adenosinmonophosphat (AMP), und Licht 11, 9, 3. Die im Handel erhältlichen FFL Substrat, D-Luciferin, Ergebnisse in Lichtemission zwischen 550-570 nm, die unter Verwendung eines Luminometer 15 werden kann. FFL ist außerordentlich empfindlich auf Denaturierung von chemischen oder Wärmebehandlungen und Aggregate schnell beim Entfalten. Bei Temperaturen zwischen 39-45 ° C ausgesetzt FFL reversibel entfaltet und inaktivierten 12. Im Gegensatz dazu sind GFP und seinen Derivaten sehr widerstandsfähig gegen Proteinentfaltung Spannungen 14. Daher Fusion dieser beiden Proteine erlaubt FFL als experimentell labilen Rest, der Targeting-funktionelle Funktion gFP um intrazelluläre Ablagerungen, die visualisiert werden kann mittels Fluoreszenzmikroskopie in der Bevölkerung und der einzelnen Zelle Ebenen. Verwendung des enzymatischen Assay in einer halbautomatischen Multimode-Reader mit automatisierten Mikroskopie gekoppelt ermöglicht ungeahnte gleichzeitige Beurteilung der Kinetik und Ausbeute Umfaltungsreaktionen. Darüber hinaus ermöglicht die einfache Molekulargenetik des Modells Eukaryoten Saccharomyces cerevisiae sowohl präzise Manipulation des Proteins Qualitätskontrolle Netzwerk und die Möglichkeit für die Entdeckung Ansätze für neue Spieler einen Beitrag zur zellulären Stressantwort und Proteostase identifizieren.
In dieser Studie sind Wildtyp (WT) und Hsp104 Deletionsstämme Ausdruck FFL-GFP unterliegen Proteindenaturierungsmittel Hitzeschock. FFL-GFP Rückfaltung durch sowohl einen enzymatischen Test und Mikroskopie als Proxy Auslesen zur Reparatur des exprimierten Proteom in einer Erholzeit Verlauf überwacht. Wenn zu WT-Zellen im Vergleich zeigen wir the Hsp104 Deletionsstamm ist ~ 60% weniger effizient Rückfaltung FFL-GFP, die Unterstützung bisherigen Erkenntnisse über eine Rolle in Hsp104 Reaktivierung denaturierter FFL 2.
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Protocol
1. Der Bau der Stämme, die FFL-GFP Plasmid
Für diese Studie wurde Saccharomyces cerevisiae-Stamm BY4741 (MAT a, his3Δ1, leu2Δ0, met15Δ0, ura3Δ0) zusammen mit einem Hsp104 Deletionsstamm aus der Hefe Knockout Sammlung (Open Biosystems / Thermo Scientific) verwendet. Die Streichung wurde bestätigt mit einem Hsp104-spezifischen Antikörper für Western-Blot-Analyse.
FFL-GFP wurde aus p426Met25-FFL-GFP exprimiert, hergestellt aus einem LEU2-basierte Quelle Plasmid aus dem Glover Labor an der Universität von Toronto und 17 erhältlich erhalten auf Anfrage bei den Autoren. Expression der FFL-GFP-Plasmid-Fusionsprotein wird durch die MET25 Methionin-reprimierbare Promotor kontrolliert. Das Plasmid wurde in jedem Stamm unter Verwendung eines Protokolls von Gietz et angepasst umgewandelt wurde. al, 1995:
- Zentrifuge 25 ml o f log-Phase-Zellen in einem 50 ml konischen Röhrchen bei 4.400 rpm für 2 min, mit 500 ul doppelt destilliertem H 2 0 (ddH 2 O) zu waschen, und entsorgen Überstand.
- Die Zellen in 250 ul TE / LiAc (Tris-HCl 10 mM, pH = 7,5, 1 mM EDTA, 0,1 M Lithium-Acetat). Inkubation bei 30 ° C ohne Mischen für 20 min.
- Übertragen Sie 50 ul kompetente Zellen in ein neues Röhrchen zusammen mit 5 ml (50 ug) von Träger-DNA und 5 ul (0,1-5 ug) von Plasmid-DNA. In 300 ul PEG / TE / LiAc (wie TE / LiAc plus 40% Polyethylenglykol) zu dieser Mischung und Inkubation Zellen bei 30 ° C für weitere 30 min.
- 1/10 Volumen (v / v) DMSO (36 ul) zu dieser Mischung und Hitzeschock bei 42 ° C für 6 min.
- Zentrifuge Mischung bei 6.000 min für 30 sec und entfernen Überstand. Die Zellen in 100 ul sterilem ddH 2 0 und Platte Zellen auf synthetischem Komplettmedium ohne Uracil (SC-URA).
2. Induktion von FFL-GFP
nt "> FFL-GFP induziert wird, wenn Zellen in der log-Phase sind, so dass die Mehrheit des Proteins vor der Hitze-Schock neu durchgeführt wird, um Proteine, die terminal über die Zeit aufgrund altersbedingter zellulären Unzulänglichkeiten aggregiert vermeiden.- Tag 1: Inkubation Zellen in 5 ml SC-URA bei 30 ° C rotierend O / N.
- Tag 2: Messen OD 600 und impfen frische Kulturen in 5 ml SC-URA OD 600 ~ 0,2.
- Inkubieren Kulturen mit Drehung bei 30 ° C, bis sie log-Phase OD 600 ~ 0,8-1,0 zu erreichen.
- Zentrifuge Zellen in 15 ml konischen Röhrchen bei 4.400 rpm für 3 min, abgießen Überstand und Zellpellet in 500 ul ddH 2 0; Transfer-Lösung in ein Mikrozentrifugenröhrchen.
- Zentrifuge bei 6.000 rpm und entsorgen Überstand.
- Die Zellen in 5 ml SC-URA-MET. Die Zellen sollten inkubiert Drehen in dieses Medium für 1 h bei 30 ° C werden
- Zentrifuge Zellen und das Waschen wiederholen in ddH 2 0 und entsorgen Überstand.
- Resuspend Zellen in 5 ml SC-URA Medium mit 100 ug / ml Cycloheximid, um die Proteinexpression zu hemmen, und fahren Sie sofort mit Schritt 3 fort.
3. Enzymatische FFL-GFP Recovery-Assay
Dieser Test ist ein quantitativer Ansatz, um die Konzentrationen von aktivem Enzym in einer Population zu bestimmen.
- Vorbereitung für diesen Test:
- Messen OD 600 für jede Probe.
- Vorbereitung der notwendigen Menge an D-Luciferin brauchte auf die Anzahl der Stichproben und der gewünschten Anzahl an Wiederholungen plus ca. 1.200 ul für die Schläuche. Endkonzentration von D-Luciferin ist ~ 23 g pro 100 ul der Zellen. Zunächst wird in Wasser bei einer Konzentration der Stammlösung von 7,5 mg / ml gelöst und auf 455 pg / ml in SC vor Experiment. In Fig. 2 drei Wiederholungen für jede Probe wurden analysiert, was in insgesamt 2,4 ml D-Luciferin verwendet.
- Programm-Reader für Flash lumizenz-Test (in Anlehnung an BioTek Gen5 "Flash-Lumineszenz-Assay mit Injection", für andere Instrumente Herstellerangaben beachten)
- Temperatur auf 30 ° C
- Set Platte Leser D-Luciferin hinzufügen, schütteln und lesen Sie jede auch einzeln.
- Lesen Lumineszenz (Endpunkt Lesung, 5 sec Integrationszeit, 180 Empfindlichkeit)
- Für Erholung Assay zwischen jeder Ablesung Shake für 5 min, 20 min zu verzögern, und schütteln Sie zusätzlich 5 min.
- Geben Sie 50 ul von D-Luciferin von einem Injektor.
- Vorheizen-Schock Lumineszenz wird unmittelbar nach Zellen zu Medien mit Cycloheximid, die Proteinsynthese zu stoppen hinzugefügt gemessen.
- Übertragen Sie 100 ul der Zellen für jede Probe mit der gewünschten Anzahl an Wiederholungen in einem festen, weißen 96-Well-Platte.
- Kontrollen sollten Folgendes umfassen eine leere Wasser und Zellen mit einem leeren Vektor.
- Starten Sie den Schreibschutz mit dem spefikationen oben aufgeführt sind.
- Um die Einheit der FFL FFL-GFP denaturieren, bebrüten die 5 ml Kultur in einem Glas Kultur Rohr bei 42 ° C für 25 min geschüttelt.
- Recovery-Assay Lumineszenz Lesungen sofort zu starten, nachdem die Zellen aus dem Inkubator, der Zeitpunkt Null ist, werden entfernt. Messen Lumineszenz gleiche wie oben für den ersten Zeitpunkt und alle 30 Minuten während 90 min beschrieben.
- Normalisieren Proben zur Vorwärmung-Schock-Lumineszenz-Werte, die auf der Grundlage der OD 600 (unterteilen die Vorwärmung-Schock Werte von OD 600) wurden angepasst.
4. Fluoreszenzmikroskopie
Dieser Assay ist eine semi-quantitative Verfahren zur Solubilisierung von Aggregaten im Laufe der Zeit in eine Population von Zellen zu bestimmen.
- Induktion ist die gleiche wie in Abschnitt 2 beschrieben, werden die Schritte 1-8 von Protokollen.
- Die gleichen Zeitpunkten getroffen werden wie oben beschrieben (Abschnitt 3, Schritt 4), aber für microscopy sammeln 1 ml der Zellen bei vorzuwärmen-Schock und jeden Wiederherstellungspunkt Zeitpunkt, und Inkubation Proben Drehen bei 30 ° C in Kultur Rohr.
- Visualisierung:
- Zentrifuge 1 ml der Zellen bei 6000 rpm für 30 sec und entfernen Überstand.
- Zellpellet in 2 ul ddH 2 O.
- Mix 2 ul Zellen sowie 2 ul 2% niedrig schmelzende Agarose auf dem Objektträger und fügen Sie ein Deckglas. Um eine einzelne Ebene der Zellen zu erhalten drücken Sie leicht den Finger in der Mitte des Deckglas und drehen, bis das Deckglas ist schwer zu bewegen.
- Zellen visualisiert werden mit 100X Öl-Objektiv am Fluoreszenzmikroskop; verwenden DIC zu den Zellen und die FITC-Filters zu visualisieren GFP-Fluoreszenz sichtbar zu machen.
- Nehmen mehrerer Bilder für jeden Stamm zu jedem Zeitpunkt zur Quantifizierung. Felder für Bilder sollte ~ 15-30 Zellen für quantitative post-experimentellen Analyse enthalten.
- Um Prozentsatz der Zellen, die Aggregate zu berechnen, zählen 50-100 Zellen insgesamt und teilen die Anzahl der Zellen, die Aggregate.
5. Single Cell Mikroskopie
Dieses Verfahren wird verwendet, um die Solubilisierung von einzelnen Aggregaten in einer einzigen Zelle im Laufe der Zeit zu folgen.
- Induce FFL-GFP-Expression, wie in Abschnitt 2 beschrieben, werden die Schritte 1-8.
- Nach Hitzeschock-, Zentrifugen-Zellen in 15 ml konischen Röhrchen bei 4.400 rpm für 2 min.
- Waschen der Zellen mit 500 ul Wasser und resuspendieren in 20 ul ddH 2 O.
- Für jeden Stamm Ausschneiden eines 5x5 mm Abschnitt eines SC-URA-Agar-Platte und mit der Oberfläche, die in Kontakt mit Petrischale Pipette 4 ul Zellen und Verbreitung auf Oberfläche des Agar mit Pipettenspitze. Lassen Sie stehen für ~ 1 min.
- Mit einer Pinzette Agar cube Abschnitt verdeckt platzieren auf einem ~ 55 mm Glasboden Gericht Nr. 0 und leicht andrücken.
- Visualisierung:
- Siehe i-iii in Abschn.Ionen-4.
- Set-Koordinaten für 2-4 Anlaufstellen für jeden Stamm je nach Dichte der Kultur.
- Schalten Sie die Kamera, um Bilder mit einer Z-Stapel mit den entsprechenden Bereich zu nehmen (- / + 15 um mit einem 0,5-1,0 um Schichtdicke) alle 5 Minuten für eine 90-Minuten-Zeitraum.
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Representative Results
Hefe ist abhängig von der disaggregase an Hsp104 effizient falten hitzedenaturierten Proteine. Die Aktivität der FFL-GFP wurde nach einer 25 min Hitzeschock überwacht, mit einem Lumineszenz-Assay Flash Abbildung 1. Die Ergebnisse dieser automatisierten Assays in 2 gezeigt ergab eine schrittweise Erhöhung der Aktivität über 90 min, die letztlich zu einer> 80% Ausbeute in WT-Zellen führte. Die hsp104Δ Stamm gewonnen 19% der ursprünglichen Aktivität gegenüber dem gleichen Zeitraum. Darüber hinaus war das Ausmaß der anfänglichen Inaktivierung viel höher in dem Chaperon Mutantenstamm (26% der Aktivität in WT und 11% in hsp104Δ) darauf hindeutet, dass Hsp104 werden dient eine schützende Rolle Vorspannung oder rasch zuordnet Denaturierung FFL-GFP während der Hitzeinaktivierung Schritt zur Verringerung Verlust der Enzymaktivität.
Bevölkerung Mikroskopie bestätigt die enzymatische Aktivität Assay. Nahezu alle Zellen in der Mutante hsp104D strain gepflegter mindestens eine FFL-GFP Aggregat auf die Anzahl der Aggregate in der WT-Stamm, der um 62% innerhalb von 90 Minuten nach der Hitze-Schock (Abbildung 3) verringerten sich im Vergleich. Während eine große Zahl von gebildeten Aggregate unmittelbar nach Hitzeschock in beiden Stämmen, sank die Zahl der Zellen mit WT Aggregate schnell während hsp104Δ Zellen konnte die beobachtbaren puncta löschen. Diese Daten bestätigen die Aktivitäts-Assay, die eine 52% Erholung der Wirtschaftstätigkeit in WT gegenüber einem minimal 8% für die Verwertung in hsp104Δ Stamm zeigte.
Einzelzelle automatisierte Mikroskopie zeigte, dass in WT-Zellen gegenüber dem hsp104Δ Stamm, FFL-GFP mit einer höheren Rate wurde gelöst (repräsentative Standbilder werden in Abbildung 4 dargestellt, siehe ergänzende Filme für Zeitserien von FFL-GFP re-Solubilisierung). Darüber hinaus waren die Dynamik der Protein-Aggregate sehr unterschiedlich, in den WT-Zellen Aggregate eher verschmelzen Daher ist solubilisiert, und dies war nicht in der hsp104Δ Stamm beobachtet. Dieser Assay unterstützt nicht nur die Ergebnisse aus den beiden anderen Methoden, sondern zeigt einen Einblick in einen möglichen Mechanismus, wie das aggregierte Protein solubilisiert und rückgefaltet.
Abbildung 1. Schematische Darstellung der FFL-GFP Hitzeschock-Recovery-Test. FFL-GFP-Expression wird in log-Phase in Zellen, die in SC-URA inkubiert wurden induziert. Um Zellen zu induzieren inkubieren in SC-URA-MET für 1 Stunde. Zentrifuge Zellen resuspendieren und in SC-URA, die 100 ug / ml Cycloheximid (CHX). Für Hitzeschock-inkubieren Zellen bei 42 ° C für 25 min. Erlauben Zellen durch Inkubation bei 30 ° C erholen Die Proben werden für 90 min Zeitverlauf. Zur enzymatischen Assays D-Luciferin vor jeder Messung hinzugefügt.ref = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/50432/50432fig1large.jpg" target = "_blank"> Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2. FFL-GFP enzymatische Rückfaltung / Recovery-Assay. Proben von WT und hsp104Δ Zellen (100 ul) wurden vor dem Hitzeschock gesammelt und sofort nach der Hitze-Schock für jeden Zeitpunkt (0, 30, 60 und 90 min). Drei Wiederholungen jeder Probe wurden in die Vertiefungen einer 96-Well-Platte, weiß für jeden Zeitpunkt aliquotiert. Für Lesungen, wurde die Platte Lesegerät zu messen Lumineszenz alle 30 min für 90 min bei 30 ° C.
<br /> Abbildung 3. FFL-GFP Rückfaltung Mikroskopie. 1 ml Zellen zu jedem Zeitpunkt (pre-HS, 0, 30, 60 und 90 min) wurden gesammelt und zentrifugiert. Überstand wurde abgesaugt und die Zellen wurden in 2 l Wasser suspendiert. Die Zellen wurden durch Mischen mit 2 ul niedrig schmelzende Agarose vorbereitet. Die Zellen wurden visualisiert mit dem 100X Öl-Objektiv. Repräsentative Bilder jedes Zeitpunkts gezeigt. Die Quantifizierung wurde durch Zählen der Zellen in 4-5 Felder und der Berechnung des Prozentsatzes von Zellen, die Aggregate (n ~ 100) durchgeführt.
Abbildung 4. Einzelzelle Rückfaltung Mikroskopie Zeitverlauf der FFL-GFP. Beitrag Hitzeschock-5 ml Zellen wurden gesammelt, zentrifugiert, gewaschen und in 20 ul ddH 2 O. 4 ul Zellen wurden auf einem 5 mm 2 platziert
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Discussion
In diesem Artikel wird das Modell Protein FFL-GFP wurde verwendet, um zu zeigen, dass die Hefe disaggregase, Hsp104 zu Protein re-Solubilisierung und Reparatur trägt. Die enzymatische Assays und Mikroskopie differentiell den Status des gleichen Substrats Protein Rückfaltung Effizienz und Ausbeute zu bestimmen abgefragt. Ergebnisse der enzymatischen Assays Erholung vermuten, dass nicht nur der maximalen Erholung der hsp104D Mutantenstamm ineffizient, aber die anfängliche Größe der Entfaltung Spannung größer war in der Mutantenstamm (Abbildung 2). Die Analyse zeigt auch, dass während hsp104D Zellen schien zu versuchen, Reparatur, sie nicht in der Lage, um das Protein so schnell wie WT Zellen falten waren. Diese Methode erlaubt empfindliche und quantitative Analyse der FFL-GFP Tätigkeit enthüllt die wesentliche Rolle der Hsp104 der Reparatur dieses Proteins.
Mikroskopie Ergebnisse legen nahe, dass der Grund für die ineffiziente Reparatur von denaturiertem Enzym FFL durch t isto Protein Trapping innerhalb von Aggregaten. Die Bevölkerung zeigte, dass in Zellen ohne Hsp104, keine Zellen konnte ganz klar alle Aggregate in 90 min (Abbildung 3). Darüber hinaus zeigten die Analysen, dass einzelne Zelle Aggregate Sicherung im Laufe der Zeit, was darauf hindeutet, dass die Konsolidierung von kleineren Aggregaten zu größeren Strukturen kann die Reparatur und Rückfaltung zu unterstützen (Abbildung 4). Während dieses Ergebnis ist nicht offensichtlich von den Standbildern, erlauben Zeitraffer-Filmen ein, um das dynamische Verhalten von unabhängigen Aggregate folgen. Beobachtung von Aggregaten über den Zeitverlauf aufgedeckt verringert Aggregat Fusion im hsp104Δ Stamm, der angibt, dass diese Zellen nicht bilden die größeren Strukturen so effizient und darauf hindeutet, dass Hsp104 für diese Facette des Protein Qualitätskontrolle erforderlich ist. Eine weitere Vermutung ist, dass Zellen Protein schneller lösen aus diesen größeren Aggregaten, die zusätzlich enthalten die Disaggregation und Reparatur maschinenbau. Einzel-Zell-Mikroskopie kann auch verwendet werden, um festzustellen, ob andere Chaperone und Co-Chaperone, die in den größeren gegenüber kleineren Aggregaten sind, und wenn dieser Wohnsitz Muster über die Zeit variiert.
Zusammen stellen diese Methoden erlauben sowohl biochemische und zellbiologische Analyse von Protein-Faltung und Reparatur in lebenden Zellen. Integration der Ergebnisse aus den drei beschriebenen Methoden bietet mehrdimensionalen Einblick in die Kinetik und Effizienz der zellulären Regeneration nach proteotoxic Hitzeschock. Automation der einige oder alle der Schritte in dem Protokoll ermöglicht auch größere Probenmengen und biologischen Wiederholungen in einem bestimmten Experiment, die Erhöhung der Stabilität und höchste Sicherheit für den Ausgang. Darüber hinaus sind diese Methoden theoretisch kann um in menschlichen Zellen und nicht nur für genetische Analysen verwenden, sondern auch für Chemikalien, die Proteostase ändern zu untersuchen.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium der National Institutes of Health (NIGMS-074696) zu KAM und einer American Society of Microbiology Robert D. Watkins Graduate Student Research Fellowship an JLA Wir danken auch John Glover an der Universität von Toronto für die Bereitstellung der FFL unterstützt Source-GFP-Plasmid.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Synergy MX Microplate Reader | BioTek | ||
| Olympus IX81-ZDC Confocal Inverted Microscope | Olympus, Tokyo Japan | ||
| Lumitrac 200 white 96-well plates | USA Scientific | ||
| SlideBook 5.0 digital microscopy software | Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO, USA | ||
| Equipment | |||
| Tris Base | Fisher | BP152-1 | |
| (LiAc) Lithium Acetate | Sigma | L6883 | |
| PEG (polyethelene glycol) | Fisher | BP233-1 | |
| EDTA | Fisher | BP120-1 | |
| DMSO | Malinckrodt | 4948 | |
| SC | Sunrise | 1300-030 | |
| SC-URA | Sunrise | 1306-030 | |
| cycloheximide | Acros Organics | 357420050 | |
| D-luciferin | Sigma | L9504 | |
| low melt agarose | NuSieve | 50082 | |
| immersion oil | Cargille | 16484 | |
References
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