En modifierad Heterotopisk Svinbakbenstrans modell för Translational vaskulariserad Composite allotransplantation (VCA) Forskning

Summary

Vaskulariserad Composite Allotransplantations (VCA) har blivit en klinisk verklighet. Dock är bred klinisk tillämpning av VCA begränsad av kronisk multiläkemedels immunosuppression. Författarna presenterar en tillförlitlig och reproducerbar stora djurmodell för att översätta nya immunmodulerande strategier som kan minimera eller potentiellt eliminera behovet av immunsuppression i VCA.

Abstract

Vaskulariserad Composite allotransplantation (VCA) såsom hand-och ansiktstransplantationer utgör en livskraftig behandlingsalternativ för komplexa muskuloskeletala trauma och förödande vävnadsförlust. Trots gynnsamma och mycket uppmuntrande tidiga och mellanliggande funktionella resultat, förkastande av den mycket immunogena hud komponent i en VCA och eventuella negativa effekter av kronisk multidrog immunosuppression fortsätter att hämma utbredd klinisk applikation av VCA. Därför måste forskningen i denna roman område att fokusera på translationella studier relaterade till unika immunologiska funktioner i VCA och för att utveckla nya immunmodulerande strategier för immunmodulering och tolerans induktion efter VCA utan behov av långsiktig immunosuppression.

I artikeln beskrivs en tillförlitlig och reproducerbar translationell stora djurmodell av VCA som består av en osteomyocutaneous flik i ett MHC-definierad svin heterotop bakbenen allotransplantation. Briefly, är en väl vaskulariserad hud paddla identifierats i antero regionen lår med hjälp av nära infraröd laser angiografi. De underliggande muskler, knäled, distala femur och proximala tibia skördas på en lårbens vaskulär pedicle. Denna allograft kan anses vara både en VCA och en vaskulariserad benmärgstransplantation med dess unika immun privilegierade funktioner. Den transplantat transplanteras till en subkutan buk ficka i det mottagande djuret med en hud komponent exterioriserades till dorsolaterala området för immunövervakning.

Tre kirurgteam arbeta samtidigt i ett väl samordnat sätt för att minska anestesi och ischemi tider, och därigenom förbättra effektiviteten i denna modell och minska potentiella confounders i experimentella protokoll. Denna modell utgör grunden för framtida terapeutiska strategier för att minska och eventuellt eliminerar behovet av kronisk multidrog immunosuppression i VCA.

Introduction

Vaskulariserad Composite allotransplantation (VCA) såsom hand-och ansiktstransplantationer är nu en klinisk verklighet med många hand-och ansiktstransplantationer utförs i hela världen ^12. Trots att tidiga och mellanresultat är goda och mycket uppmuntrande ^2, fortsätter kravet på kronisk multi immunosuppression för att begränsa dess utbredd klinisk applikation. De framsteg inom musmodeller av VCA inklusive supermikro anastomoser och nonsuture manschetten tekniker ^{13, 3} har banat väg för en bättre förståelse av alloimmuna svar i VCA. Myriader av immunmoduler protokoll har föreslagits för kliniska applikationer baserade på vår bättre förståelse av immunmekanismer i VCA men de måste valideras i en stor djurmodell som skulle vara rimliga förutsägelser om deras prestation hos människor ^7. Baserat på fysiologiska och immunologiska likheter mellan systemen mänskliga och svin organ 9 och icke-humana primatmodeller ^1.

Denna artikel ger en detaljerad översikt över den metod som används i vår MHC definierade svin heterotop bakbenen transplantation modell, som fungerar som grund för våra nuvarande och framtida immunmodulerande strategier som syftar till att inducera immuntolerans till VCA och därmed bredda dess kliniska tillämpning. Vi använder väl karakteriserade inavlade grisar uppfödda till homozygositet vid svin leukocytantigen locus speciellt för deras användning inom transplantationsrelaterad forskning ^11. Vi höjer en vaskulariserad osteomyocutaneous flik baserad på lårbens fartyg. Klaffen innehåller intakt vaskulariserad benmärg i distala femur och proximala tibia. Antero låret huden är också inkluderad i transplantatet och exterioriserades till dorsolaterala aspekt av mottagardjur för immunövervakning av de mest immunogena komponenten of VCA. Dorsolateral positionering underlättar klinisk undersökning i stående och sittande positioner och håller allograft huden relativt ren också.

Ustener et al. Presenterade en av de första stora djurtranslationella modeller i VCA genom att transplantera radiella forelimb osteomyocutaneous klaffar i utavlade gården grisar ^15. Gruppen utnyttjade denna modell för att demonstrera för första gången att akut avstötning i VCA som innehöll den mycket immunogena huden komponent kan fördröjas och behandlas med en kliniskt relevant strategi utan signifikanta läkemedelsspecifika komplikationer och biverkningar. De goda resultat som erhållits i denna studie senare byggde ett grundläggande steg i att utforma läkemedelsbehandlingar för mänsklig rekonstruktiv transplantation. Även om dessa tidiga gris VCA modellerna var väl lämpade för att utveckla protokoll för att förhindra avstötning av hud, muskler, ben, nerver och kärl som de saknade specialiserade strukturer såsom artikulära cartilage och synovial membran av lederna. Efterföljande ansträngningar var inriktade på bland annat den mediala siffran i djuret, som krävde full längd gjutna placering för att förhindra graft rubbas ^14. Även lämplig för att undersöka avvisande av alla viktiga delar av lem transplantation, en av de stora begränsningar av denna modell var efter transplantationen ambulatorisk svårigheter på grund av att kasta placering. Således heterotopiska svin lem allotransplantation modeller, bestående av skenbenet, vadben, knäled, distala lårbenet, omgivande muskler, och en hud paddel, skapades för att i första hand studera immunologiska aspekter av VCA samtidigt som djuret fritt ambulate postoperativt med minimal morbidit ⁸ .

Utvecklingen av väl karakteriserade SLA-definierade inavlade svin genom det banbrytande arbetet av Dr David H. Sachs ledde till en ny era av translationell VCA forskning. Använda en heterotop bakbenen transplantation modell i en mindre antigen obalans inställning, Mathes et al. ¹⁰ visade obestämd överlevnad muskuloskeletala komponenter med en kort kurs av cyklosporin-behandling. Huden komponent överlevnad var dock bara förlängd jämfört med ingen behandling kontroller. Förlusten av huden komponent av transplantatet skulle tillskrivas en isolerad och mycket kraftig immunrespons, i synnerhet till epidermis. På samma sätt, med hjälp av helt inkompatibla grisar med T-cells utarmning, en kort kurs av cyklosporin och cytokin mobiliserat givar perifera mononukleära blodceller inducerade tolerans endast till muskuloskeletala komponenter och huden komponenten fortfarande förkastades ^5. Detta fenomen, som kallas "split tolerans", väckte ett paradigmskifte i VCA forskning med ett större fokus på den mycket immunogena huden komponent, som är en integrerad del av de flesta rekonstruktiv transplantationer utförts hittills.

I denna modifierade modellen utnyttjar vi end-to-end-anastomos av ligating mottagaren femoralartären och vrida den cephalad (Figur 1). Detta minskar inte bara ischemitiden genom att tillåta användning av en konventionell kopplingsanordning, men också minskar risken för anastomotisk misslyckande. Vi har inte observerat några ischemiska händelser efter ligation av lårbensartären i våra mottagare anger att säkerheter cirkulation var tillräcklig för att ge kärl till den infödda benet. Dessutom, i detta modifierade förfarande är externaliserats hud komponent mobiliseras baserat på de underliggande perforator fartyg och är placerad i sidled (figur 1) i motsats till en ventral ljumske position i den traditionella modellen ^10. Detta möjliggör enkel visualisering av transplantatet för immunövervakning i en stående eller sittande ställning på djuret.

Därför är en tillförlitlig och reproducerbar stor djurmodell viktigt att undersöka toleransinduktions strategier mot huden komponenten i VCA och för att utveckla nya noninvasive immun strategier för bättre prediktion av graft överlevnad övervakning.

Protocol

I den här videon publikation var alla djurförsök utförs i enlighet med en djurprotokoll som godkänts av Johns Hopkins University Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC).

1. Preoperativ Planering

1. Vi använder MHC-definierade MGH inavlade minigris (15-20 kg) i vår translationella studier för lem allotransplantation, där en manlig donator ger lemmar för två kvinnliga mottagare (Figur 1). Före operation, givar-och mottagarländer djuren genomgå noggrann klinisk utvärdering av en veterinär.
2. För att minimera narkos och ischemi tid, givar-och mottagarländer förfaranden genomföras samtidigt på tre operationsbord i en dedikerad stort djur operationssal. Teamwork och samordning mellan kirurgteam samt veterinärpersonal är avgörande för den totala framgången för detta förfarande. Operationsplanen diskuteras med veterinär team i ett formellt möte 1-2 Veckor före operationsdagen.
3. En tunnel central venkateter (7 Fr dubbla lumen Hickman kateter) placeras i ett yttre eller inre halsvenen för varje mottagare djuret före transplantation för immunosuppressiv övervakning läkemedelsnivå och intravenös administrering av immunsuppressiv och / eller immunmodulerande läkemedel. Dessa katetrar placeras under direkt vision genom en venös cut-down teknik och tunnlas bakre att avsluta högt på rygg nacke och säkras med hjälp av monofilament icke absorberbara suturer och plåster sjal runt halsen.
4. Håll djur NPO (ingen fast föda, men får vatten ad lib) minst 12 timmar före operation.
5. På dagen för kirurgi, stillsam djur med ketamin 20 mg / kg och xylazin 2 mg / kg IM.
6. Placera en lämplig storlek endotrakealtub och anslut den till anestesiapparat och respirator (underhålls på isofluran 0,5-3%)
7. Placera en intravenös kateter i en marginell öronven och administreravikt baserad 0,9% saltlösning under hela förfarandet.
8. Administrera förebyggande smärtlindring (buprenorfin 0,02 mg / kg IV).
9. Administrera profylaktisk antibiotika (cefazolin 20-25 mg / kg IV) innan den ursprungliga snittet för både givare och mottagare djur.
10. Använd steril teknik i alla förfaranden för både mottagare och givare. Detta innefattar användning av autoklaverade eller gas steriliserade instrument, masker, huvud mössor, sterila operationsrockar och sterila handskar. Raka området av snittet med en klippmaskin och desinficera med omväxlande Betadine-lösning och alkohol.

Intraoperativ övervakning:

1. Efter induktion och intubation, upprätthålla anestesi med en inandning blandning 0,5-3% isofluran i syre.
2. Övervaka hjärtfrekvens, pulsoximetri, EKG, end-tidal _CO2 och rektal temperatur hela tiden och spela in varje 15 min.
3. Förhindra hypotermi med en Bair Hugger varm forcerad filt.

1. Placera donatordjuret i ryggläge på operationsbordet och drapera på ett sterilt sätt.
2. Använd nära-infraröd laser angiografi att identifiera perforator fartyg till den antero huden. Injicera indocyaningrönt på ca 0,06 mg / kg utspätt i 2-5 ml normal saltlösning genom perifer vaskulär access. Ungefär 10 sekunder senare, utför 30 sek-2 min av nära infraröda inspelningar. Använd video från dessa inspelningar för att identifiera hålslag. Baserat på hålslag, markera ett område av huden (ca 100 cm ²⁾ för övervakning.
3. Använd en skalpell för att göra en ljumske hud snitt i kontinuitet med markeringar för huden paddel (Figur 2).
4. Identifiera femorala fartyg och isolera dem distalt till nivån på suprageniculate grenar och proximalt till samma nivå som inguinal ligament.
5. Dissekera huden och subkutan vävnad samtidigt preserving området av huden paddel. Sutur kanterna av huden för att underliggande muskler att undvika kontraktion under klaffen skörd.
6. Utför en osteotomi strax ovanför hasled med hjälp av en tigersåg (Electric Pen Drive, Synthes, West Chester PA).
7. Dela upp musklerna i den proximala låret använda diatermi.
8. Dividera lårbenet på mitten axel lämnar en osteomyocutaneous flik på en vaskulär pedicle. Klaffen innehåller huden paddla, underliggande lårmuskler, knäled, distala femur och proximala tibia som inkluderar intakt vaskulariserad benmärg med dess unika immunologiska funktioner.
9. Använd ben vax för att uppnå hemostas i märgutrymmen. Smidig ben kanter använder ronjeurs som förberedelse för mottagaren.
10. Håll transplantat perfusion på sin vaskulära pedicle tills mottagarens femorala fartyg är beredda (Figur 3).
11. När mottagaren dissektion är klar ligera givarlårbens fartyg som proximalt som möjligtnd ingjuta transplantatet med histidin-tryptofan-ketoglutarat (HTK, Custodiol, Newtown PA) före transplantation.
    OBSERVERA: Donator lem transplanteras på den kontralaterala sidan av mottagaren, dvs den vänstra givaren lem för den högra sidan av den mottagande och den högra givaren lem för den vänstra sidan av mottagaren).
12. Euthanize donator svin omedelbart efter skörd det andra bakbenet med användning av 100 mg / kg IV natriumpentobarbital. Döden bekräftas av veterinärpersonal per etablerat protokoll.

4. Mottagarens Procedure (bakbensallotransplantation)

1. Starta mottagaren induktion och intubation omedelbart efter den första givaren snitt för att möjliggöra beredning av mottagande fartyg medan givaren lem skördas. Detta eliminerar onödig väntetid och minskar den totala anestesitiden för givare och mottagare.
2. Placera djuret på rygg med en 30 ° vridning på operationssidan att allow exponering av dorsolaterala sidan.
3. Gör en ljumske incision och exponera lårbens fartyg; isolera dem distalt till nivån för de suprageniculate grenar och proximalt till nivån av det inguinala ligamentet.
4. Skapa en subkutan ficka från ljumsken till dorsolaterala bukväggen för transplantatet infällda (Figur 4).
5. Ligera de levererande fartyg och spola transplantatet med HTK.
6. Utför transplantatet infälld i ett inverterat sätt: Har huden paddla inför dorsolateral att möjliggöra enkel immunövervakning i stående ställning och de skurna ändarna av femorala fartyg inför kaudalt tillåta end-to-end-vaskulära anastomoser utan spänning på fartyg ( Figur 5).
7. Om tillgängligt, använd en vaskulär kopplingsanordning (Synovis, St Paul MN) för venösa anastomoser (storlek 2,5-3,5 är lämplig för 10-20 kg djur). Detta minskar avsevärt ischemitiden jämfört med konventionella metoder.
8. Utför arteriell Anastomoses med en konventionell sutur teknik med 9-0 sutur (Synovis, St Paul MN)
9. Efter vaskulär öppenhet bekräftas, säkra transplantat på plats med 3-0 PDS suturer (Figur 5). Musklerna i graften sutureras till bukväggen muskler. Transplantatet musklerna bör inte sutureras till muskler de mottagande lår, eftersom det kan vara skadliga när djuret rör sig i närheten av buren.
10. Exteriorize huden paddeln på dorsolaterala sidan för immunövervakning (figur 6) och sutureras den till den intilliggande huden med 3-0 Vicryl subkutana suturer och 4-0 monofilament absorber avbrutna hud suturer.
11. Stäng ljumske huden i skikt med hjälp av 3-0 Vicryl subkutana suturer och 4-0 monofilament absorber avbrutna hud suturer.
12. Placera en 50-100 mikrogram / timme fentanylplåster för postoperativ smärtlindring.
13. Efter bakbenen allograft transplantation, tillbaka djuret till sin penna en gång vaken och andas bekvämt på egen hand.

Representative Results

Tjugofyra SLA-definierade svin heterotopiska bakbenen transplantationer utfördes med hjälp av vår modifierad teknik med en genomsnittlig ischemi tid på 78 min (Range: 62-94 min). Graft nedfällning och dorsolaterala hud paddel positionering uppnåddes utan svårighet hos alla djur. Nära infraröd laser angiografi visade utmärkt transplantat perfusion i alla mottagare. De första tolv venösa anastomoser utfördes med hjälp av konventionella sutur tekniker medan de senaste tolv venösa anastomoser utfördes med hjälp av en vaskulär kopplingsanordning. Ett djur med den konventionella suturen tekniken krävs en reanastomosis när en venös blodpropp identifierades omedelbart efter ingreppet. Inga komplikationer observerades i alla anastomoser utförs med kopplingsanordningen. Mottagande djur erhöll en kort kurs (30 dagar) av takrolimus monoterapi med eller utan givare benmärg (BM) infusion och kostimulatoriska blockaden. Takrolimus dosering justerades för att uppnå målnivåer för 10 till 15 ng / ml. Den korta kursen takrolimus bara och obehandlade djur tjänade som kontroller. Det co-stimulering blockad baserad immunmoduler protokoll resulterade i över 6 månader överlevnad efter transplantation. Det fanns inga tecken på GVHD i alla mottagare. Samtliga långfristiga efterlevande (utöver 150 dagar efter transplantationen) hade livskraftig vaskulariserad benmärgen vid tidpunkten för avlivning som visar tillförlitligheten i denna modell för att undersöka unika immunologiska funktioner i benmärgen komponenten i VCA (Figur 7).

Figur 1. Schematisk bild av en svin heterotopisk bakbenstransplantation. En osteomyocutaneous klaff skördas från donator bakbenet och transplanteras till en subkutan ficka längs bukväggen hos mottagaren.

TITEL "fo: keep-together.within-page =" alltid ">
Figur 2: Osteomyocutaneous klaff skörden. Donator hud paddla Perforator zoner i den anterolaterala låret identifieras med hjälp av laser angiografi att avgränsa huden paddla i osteomyocutaneous flik.

Figur 3: Osteomyocutaneous klaff skörden. Graft på sin vaskulära pedicle Flap består av distala lårbenet, knäled, proximala tibia, fibula, lårmuskler och hud paddla skördas på ett lårbens vaskulär pedicle.

Figur 4: Mottagare förfarande: Creation av en subkutan buk-ficka. Subkutan dissekering genomförs för att skapa en bukväggen ficka som sträcker sig från ljumsken till den dorsolaterala bukväggen.

Figur 5: Mottagare förfarande: Graft indrag och reperfusion efter mikrovaskulär anastomos. End-to-end lårbens kärl anastomos utförs efter klaff infälld. Donator lem används för den kontralaterala sidan av mottagaren (dvs.. Den vänstra givaren lem för den högra sidan av den mottagande och den högra givaren lem för den vänstra sidan av mottagaren).

Figur 6: Hud komponent exterioriseras till dorsolateral läge för immunövervakning. Under inlägg, är fliken placerad på ett sådant sätt att huden paddel vetter dorsolaterala bukväggen, där det sutureras till mottagarens hud. Denna position tillåter enkel övervakning av klaffen.

Figur 7: Bilderna från transplanterade djur: (A) Långtids överlevande (> 150 dagar) med inga kliniska tecken på avstötning. (B) Långsiktigt överlevande (> 150 dagar) med inga kliniska tecken på avstötning. The allograft erhölls från en donator med mörk färg hud. Båda (A) och (B) fick co-stimulering blockad (CTLA4Ig) baserad immunmodulerande terapi. (C) Negativ kontroll (korttids takrolimus behandling endast) med de pitelisering och avancerad avvisande så fort takrolimus drogs tillbaka (Dag 30).

Discussion

Historiskt ingick heterotopiskt bakbenen transplantation protokoll exteriorisering av en hud paddla på den ventrala bukväggen och fartygen anastomoseras i en end-to-side sätt (Hettiarachty 2004). Men i vår modifierade metoden, en inverterad flik insetting och end-to-end-anastomos bringa huden paddel mer i sidled och därmed underlättar immun övervakning i en stående position hos djuret. Identifieringen av sural artär och zonerna med maximal perfusion använder nära infraröd laser angiografi ytterligare förbättrar tillförlitligheten i huden paddla.

I vår modifierad teknik, vi utför end-to-end anastomos mellan lårbens fartyg för att minimera tekniska fel i samband med mikrovaskulär anastomos. End-to-end anastomos också möjligt för oss att använda ett kärl kopplingsanordning (Synovis St Paul MN) för venös anastomos, vilket ytterligare minskade varm ischemi tid. Vår erfarenhet var ischemi tid mer förutsekan med hjälp av en kopplingsanordning och sedan variation i ischemi tid är direkt korrelerad med immunologisk resultatet, denna modifiering förbättrat tillförlitligheten i denna modell. Emellertid har användningen av en kopplingsanordning resulterar i ytterligare materialkostnader men anses fortfarande kostnadseffektivt baserat på den totala kostnaden för förfarandet och undvikandet av potentiella komplikationer.

Våra heterotopiska bakbenen transplantationer omedelbart producerade cirkulerande givar-härledda benmärgsceller vilket framgår av manliga givare härrör SRY kvantitativ PCR-analys. Dessutom har lönsamheten i benmärgen komponenten i allograft i vår långsiktiga överlevande bekräftas med immunohistokemi. Detta förbättrar ytterligare tillförlitlighet i vår modell som ett undersökande verktyg för unika immun privilegierade funktioner i vaskulariserad benmärg, som är en nyckelkomponent i vissa rekonstruktiv transplantationer. Denna osteomyocutaneous flik innehåller också knäleden med artikulär cartilage och en ledhinnan och fungera som en tillförlitlig modell för att bedöma förkastande av dessa specialiserade strukturer.

Trots att den här modellen verkar vara idealisk för translationella studier som undersöker immunologiska aspekter av VCA och dess komponenter, inklusive hud, muskler, nerver, kärl och leder det ändå inte göra det möjligt att bedöma ett funktionellt resultat. När immunologiska barriären övervinns, kan ytterligare modifieringar och / eller ytterligare translationella modeller utföras för att undersöka terapeutiska strategier för att förbättra motoriska och sensoriska funktion VCA.

Med hjälp av denna modell, visade vår grupp att höga doser benmärgscell infusion i kombination med co-stimulerande blockad optimerad induktionsbehandling, minskat underhåll immunosuppression, och på obestämd tid förlängd transplantatöverlevnad ^16. Sådana riktade immunmoduler protokoll som kombinerar benmärgs cellbaserade strategier och bioläkemedel kan Facilitate immun tolerans och eliminera behovet av multi immunosuppression för att upprätthålla graft överlevnad efter VCA.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
HTK	Custodial	N/A
EQUIPMENT
Electric Pen Drive	Synthes, Westchester PA	05.001.011	Reciprocating saw
Vascular Coupling device	Synovis, Newtown PA	21003B