Summary
Isolamento específico do estágio de médio a tarde folículos de Drosophila é útil para uma variedade de fins. Esses folículos se desenvolvem na cultura, o que permite manipulações genéticas e / ou farmacológicos a ser, juntamente com ensaios in vitro de desenvolvimento e de imagem ao vivo. Adicionalmente, os folículos pode ser utilizado para estudos moleculares, tais como isolamento de ARNm e proteína.
Abstract
Drosophila oogenesis ou desenvolvimento folicular tem sido amplamente utilizada para fazer avançar a compreensão dos processos biológicos de desenvolvimento e celulares complexos. Este artigo descreve métodos de como isolar folículos estágio médio a tardio (Stage 10B-14) e utilizá-los para fornecer novos insights sobre os eventos moleculares e morfológicas que ocorrem durante as janelas apertados de tempo de desenvolvimento. Os folículos isolados podem ser utilizados para uma variedade de técnicas experimentais, incluindo ensaios in vitro de desenvolvimento, imagens em tempo real, a análise da expressão de mRNA e análise de Western blot de proteínas. Os folículos em estágio 10B (S10B) ou mais tarde vai completar o desenvolvimento da cultura, o que permite combinar perturbações genéticas ou farmacológicas com o desenvolvimento in vitro para definir os efeitos de tais manipulações sobre os processos que ocorrem durante períodos específicos do desenvolvimento. Além disso, porque estes folículos desenvolver-se em cultura, eles são idealmente apropriados para estudos de imagiologia em directo, Que muitas vezes revelar novos mecanismos que medeiam eventos morfológicos. Os folículos isolados também podem ser usadas para análises moleculares. Por exemplo, as alterações na expressão de genes que resultam de perturbações genéticas pode ser definido para janelas de desenvolvimento específicos. Além disso, o nível de proteína, estabilidade e / ou pós-tradução estado modificação durante um estágio específico do desenvolvimento folicular pode ser examinado através de western blot analisa. Assim, o isolamento específico do estágio de folículos Drosophila fornece uma rica fonte de informações em processos amplamente conservadas do desenvolvimento e morfogênese.
Introduction
Cada ovário Drosophila é composto de ~ 16 ovaríolos, ou cadeias de sequencialmente amadurecimento câmaras de ovos ou folículos. Cada folículo é composta por um único oócito, células derivadas de enfermagem ou de suporte 15 da linha germinal, e ~ 650 células somáticas denominadas células foliculares (Figura 1A). Drosophila oogénese é dividido em 14 etapas morfologicamente definidas de desenvolvimento 1. Cada fase de desenvolvimento folicular é observado muitas vezes dentro de um único mosca, tornando relativamente fácil de isolar um número substancial dos folículos específica da fase.
Os meio-de-final etapas da ovogênese (Stages 10B-14) são particularmente adequados para o isolamento de fase (Figura 1). Na Fase 10B (S10B), o folículo é totalmente alongada (isto é, o seu comprimento é igual à de uma Fase 14 (S14) folículo, ver Figura 1 e Figura 2H) e metade do comprimento do folículo é composto de células enfermeiraenquanto que a outra metade é o ovócito (Figura 1C). Nesta fase, as células passam por enfermeira dramática remodelação da actina, o reforço da actina cortical e gerar feixes paralelos de dois filamentos de actina. Ao mesmo tempo, uma população de células foliculares, chamadas de células centrípetas, migram entre as células e a enfermeira de oócitos, e dois grupos dorsais de células foliculares de tornar especificado para sofrer a migração para formar os apêndices dorsais, aparelhos respiratórios tubulares para o embrião 3 . As células de enfermagem, em seguida, contrato (S11), apertando seu conteúdo citoplasmático para o oócito em um processo chamado de célula enfermeira dumping, que fornece o oócito com os fatores necessários para a conclusão da embriogênese (Figura 1D). As células, em seguida, submetidos a enfermeira morte celular (S12-S13) 4, e as células do folículo e secretar padrão da casca de ovo 5 (Figuras 1E-G). Assim, o fim do oogenesis é rico com um desenvolvimento importanted processos morfogenéticos.
Folículos isolados fase meio-de-final (S10B-S14) pode ser usado para uma variedade de fins, incluindo as análises moleculares. Por exemplo, o ARNm a partir de folículos encenadas pode ser isolado por RT-PCR, de microarray, ou análise de RNA-seq. Isto permite que se olhe para a expressão de genes dentro de uma janela de desenvolvimento curto, com apenas alguns tipos de células presentes, e determinar a expressão de genes é alterada por perturbações ou farmacológicas ou genéticas. Isolamento fase também pode ser usado para examinar as proteínas por transferência Western. Tal análise é importante porque ela permite quantificar o nível de expressão da proteína de tipo selvagem em relação mutantes em fases específicas. Apesar de se poder utilizar análises de imunofluorescência para conseguir resultados semelhantes, a quantificação de fluorescência é menos robusta, devido aos requisitos estritos que todos os pixels dentro da gama linear de detecção 6. Além disso, a análise de Western blot pode fornecer outras informações, tals, se a proteína for modificada posttranslationally ou é expressa a partir de uma isoforma específica de splicing. Isolado fases também pode ser utilizado para purificação de proteína, incluindo o fraccionamento subcelular ou coimmunoprecipitation.
Isolamento folículo específico-Stage também pode ser usado para ensaios in vitro de desenvolvimento 7 e live-imaging 8. Isolados folículos S10B-S13 continuará a desenvolver a S14 em meios de cultura simples (veja abaixo). É importante notar que os folículos S10A não vai progredir através célula enfermeira despejo usando as condições de cultura discutidas no texto. Temos usado S10B ensaios in vitro de desenvolvimento para definir o papel das prostaglandinas, tanto farmacologicamente e geneticamente, ao regular a remodelação actina utilizando células enfermeira dumping e desenvolvimento como ler-outs 7,9. Do mesmo modo, as fases posteriores do desenvolvimento, também pode ser isolado para determinar os efeitos de tratamentos farmacológicos ou homem genéticaipulations sobre processos específicos, como a migração centrípeta celular, migração apêndice dorsal / formação 10, e morte celular enfermeira. Tais ensaios podem ser utilizados para realizar telas de interacção dominantes ou ensaios, por exemplo, enquanto a heterozigosidade para mutações em pxt ou fascina sozinho não tem nenhum efeito sobre o desenvolvimento in vitro S10B, os folículos de heterozigotos duplas célula enfermeira exposição de dumping defeitos e um bloco em desenvolvimento 9.
Além disso, porque S10B-13 pode desenvolver-se em cultura, todos os processos que ocorrem durante este tempo pode ser observada por formação de imagens em directo. Essa imagem pode ser realizado simplesmente usando luz transmitida (se estiver interessado apenas em alterações macroscópicas na morfologia) ou com a microscopia confocal usando moscas transgênicos expressando sondas fluorescentes ou folículos corados com corantes de imagem ao vivo. Imagens ao vivo está sendo usado para fazer avançar substancialmente a nossa compreensão dos processos de desenvolvimento. De fato, imagin viverg de folículos fase tardia ampliou o conhecimento da migração apêndice dorsal, um exemplo de tubulogenesis 10. Esperamos que a imagem ao vivo de processos fase tardia adicionais, incluindo dinâmica de actina durante celular enfermeira dumping, vai fornecer novos insights sobre esses eventos de desenvolvimento. É importante notar que, enquanto S10A e estágios iniciais de desenvolvimento do folículo não vai continuar a evoluir para uma S14 na cultura, live-imagem dos eventos que ocorrem durante os estágios de desenvolvimento é possível, utilizando condições de cultura alternativos 11-14 (ver discussão mais informação).
Aqui nós fornecemos protocolos detalhados para isolar folículos fase tardia para qualquer desenvolvimento in vitro e live-imagem, ou análises moleculares (mRNA e isolamento de proteínas).
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Protocol
1. Preparando Drosophila Antes de encenar isolamento
- Faça molhado pasta levedura, combinando 50 g de fermento seco ativo com 90 ml de água destilada. Misture com uma espátula para combinar. Deixe a mistura repousar por ~ 30 min antes de avaliar a consistência. A consistência deve ser apenas espessa o suficiente para aderir ao lado de um frasco de voar, mas não correr para o lado. Para atingir a consistência desejada, pode ser necessário adicionar-se a 10 ml de água adicional, ou uma pequena quantidade de fermento seco. Guarde em um recipiente coberto a 4 ° C. A levedura armazenada pode ser usada para a ~ 1-2 semanas.
- Colete <24 hr velhas moscas adultas (ambos machos e fêmeas) dos genótipos desejáveis e colocá-los em um frasco com alimentos voar mais molhado pasta levedura manchada no lado do frasco. A temperatura a que as moscas são mantidas irá variar, dependendo da experiência. Para as experiências de rotina, as moscas são mantidas à temperatura ambiente. Considerando que as experiências em que um gene ésendo sobre-expresso utilizando o sistema 15 de maio UAS/GAL4 requerem manutenção das moscas, a 25 ° C ou mais, conforme apropriado.
- Fornecer as moscas com uma nova mancha de levedura pasta por dia durante 2 dias. NOTA: Como o desenvolvimento folicular é rigidamente controlado pelo estado nutricional da mosca fêmea, é essencial para fornecer a voar com o nutriente rico colar leveduras por pelo menos 36 horas antes da dissecção.
2. Isolando Mid-de-final Encenado Drosophila Folículos
- Permita que os meios de comunicação para atingir a temperatura ambiente (~ 30 min). Se os folículos encenadas vai ser utilizado para ensaios in vitro de desenvolvimento, recentemente preparar meios de IVEM (meios de insecto de Grace, 10% de soro fetal bovino inactivado pelo calor, e 1x penicilina / estreptomicina). Se os folículos encenadas vão ser utilizados para mRNA ou isolamento de proteínas usar qualquer inseto de Grace ou mídia IVEM. IMPORTANTE: temperatura de mídia é fundamental. Se a mídia é frio que vai alterartanto o citoesqueleto de actina e de microtúbulos e desenvolvimento do bloco.
- Anestesiar as moscas no frasco yeasted injetando CO 2 gás e coloque 3-5 moscas fêmeas em uma almofada de mosca sob CO 2. IMPORTANTE: Não deixe mais mulheres do que pode ser dissecados em um período de tempo de 10 minutos na plataforma de fly como a exposição prolongada ao CO 2 pode causar esterilidade e à morte.
- Encha um poço de uma placa 9-ponto com a mídia e coloque-o em cima de uma superfície escura (um pedaço de acrílico preto funciona bem). Concentre o escopo de dissecação sobre a parte inferior do poço.
- Usando # 5 fórceps Dumont pegar uma única fêmea com uma mão (este é o melhor feito usando a mão dominante). Muitas vezes, é mais fácil de pegar a fêmea pelas asas, pernas, tórax ou abdômen para a transição. Submergir o feminino na mídia bem cheios. Ajustar a focagem do microscópio, conforme necessário.
- Usando um segundo par de fórceps na mão não dominante, pegue a fêmea na extremidade anterior do abdômende modo que a extremidade posterior é posicionada para o lado dominante (Figura 2A). Certifique-se de manter a mosca submerso na mídia.
- Com a mão dominante, use a pinça para agarrar a cutícula no 2 º segmento pigmentada mais posterior e rasgá-lo longe do resto do abdômen (Figuras 2B-C).
- Usando a pinça na mão dominante, aperte delicadamente a extremidade anterior do abdome até os ovários emergir (Figuras 2D-E). Se necessário, coloque a pinça entre os dois ovários e puxá-los para fora da carcaça.
- Ou mover os ovários para um novo poço com meio fresco (Figura 2F) ou remover a carcaça de uma toalha ou papel Kimwipe. Isto é particularmente importante se os folículos são isolados para o desenvolvimento in vitro.
- Repita até 3-5 pares de ovários têm sido isolados. NOTA: Cada ovário é composto de ~ 16 ovaríolos ou cadeias de folículos sequencialmente amadurecendo. Cada ovaríoloestá contido dentro de uma bainha de músculo.
- Usando tornos de pinos e as agulhas fornecidas com eles, puxe para além do ovário, executando as agulhas entre os ovaríolos (Figura 2G). Isso às vezes vai liberar os folículos individuais também.
- Ovaríolos individuais e os estágios morfológicos facilmente distinguíveis de desenvolvimento folicular agora deve ser visível (Figura 2G, brincou além ovário). Referem-se Figuras 1 e 2H para diferenças morfológicas que podem ser utilizados para distinguir as diferentes fases. Para isolar os folículos que estão dentro ovarioles intactas e ainda contidos dentro de um invólucro do músculo, utilizar uma agulha de atravessar a ovaríolo no anterior do folículo anterior e na parte posterior do folículo imediatamente após o folículo de interesse. Isto vai quebrar a bainha do músculo e do folículo de interesse distância pode agora ser cortado a partir dos folículos vizinhas, sem danificá-la. Como etapas individuais são separados, mova os folículos de interesse, com uma pipeta de vidro, para um novo poço com meios frescos. Isto é particularmente importante quando se isola folículos para o desenvolvimento in vitro. NOTA: É importante apertar o bulbo da pipeta antes de entrar nos meios de comunicação para evitar que as bolhas de ar de redistribuir os folículos de interesse ao longo do poço. Além disso, se os folículos estão aderindo à pipeta de vidro, a pipeta pode ser pré-revestido com 3% de albumina sérica bovina (BSA), pipetando a solução de BSA cima e para baixo várias vezes e lavagem com meio de dissecação.
- Uma vez que os folículos suficientes têm sido isolados, prosseguir com as experiências posteriores.
3. Desenvolvimento in vitro de folículos S10B
- Isolar folículos S10B utilizando o protocolo de isolamento de fase (passo 2) em meios IVEM. Certifique-se de que os folículos estão rapidamente se afastou de detritos. Como estes folículos continuará a amadurecer, é important S10Bs que são recolhidos durante 30-60 minutos e, em seguida, colocado no meio de maturação de escolha. NOTA: S10B precisam ser cuidadosamente distinguida de folículos S10A (Figura 1C, em comparação com 1B), como folículos S10A não vencerão nos meios de cultura IVEM. Em ambos S10A e S10B folículos, metade do comprimento é constituído por células de enfermagem e a outra metade é o oócito, mas em S10B o comprimento do folículo é igual à dos folículos S14.
- Usando uma pipeta de vidro, mover ~ 30 folículos S10B para um poço de uma placa de cultura de tecidos de 24 cavidades. NOTA: Certifique-se de verificar se todos os folículos sendo transferidos são S10B e não amadureceram para S11.
- Prepare 1 ml de meio de maturação por bem, ou seja, mídia IVEM mais reagentes farmacológicos.
- Usando uma pipeta de vidro * puxado, retire o máximo de mídia do bem (passo 3.2) possível, e rapidamente adicionar mídia maturação de escolha. NOTA: É essencial usar um pip vidro puxadoette como folículos encenado pode ser facilmente absorvido tanto com pipetas de vidro ou pontas de pipeta com um Pipetman.
* Para fazer pipetas puxados: 1) aquecer a parte fina de, pipetas de vidro longas na chama de um bico de Bunsen apenas até que o vidro começa a amolecer, 2) mover imediatamente a pipeta para fora da chama e puxar horizontalmente para desenhar a pipeta um tubo fino, 3) quebrar para gerar uma ponta fina. CUIDADO: Use proteção para os olhos como fragmentos de vidro pode voar. - Repita os passos de 3,1-3,4 para o maior número de poços como o experimento exige.
- Permitir folículos desenvolver para> 10 hr e marcar a progressão do desenvolvimento sob um escopo de dissecação. NOTA: As experiências são geralmente marcados no dia seguinte para dar tempo suficiente para que os folículos se desenvolvem. S10B é ~ 5 horas, S11 é ~ 30 min, S12 é ~ 2 horas, e S13 é ~ 1 hora de duração a 25 ° C 1 e desenvolvimento à temperatura ambiente vai demorar um pouco mais. Experiências semelhantes à descrita para a folículos S10B pode serrealizada utilizando folículos S11-S13.
4. Isolamento Stage for Imaging ao vivo
- Isolar folículos de fase tardia (S10B-14) expressando o marcador fluorescente de preferência utilizando o protocolo de isolamento de fase (passo 2) em meios IVEM, movendo-se rapidamente para longe folículos de detritos.
- Mova folículos de interesse para novas mídias e, em seguida, transferir, com uma pipeta de vidro para uma placa de Petri inferior lamela. Tome o cuidado de adicionar mídia de modo que bolhas na área de fundo lamela, mas não está sobrando.
- Para filmes de lapso de tempo mais longos, às vezes é necessário para manter a umidade dentro da placa de Petri, adicionando um enrolado Kimwipe, umedecido com água, até a borda interior da placa de Petri. Coloque a tampa na parte superior.
- Imagem de um microscópio invertido. Resolução detalhada exigirá microscopia confocal. É necessário equilibrar a frequência de imagem, a força da iluminação, eo comprimento da imagem, o que terá de ser trabalhado de forma independente para cada lferramenta Abeling e processo de desenvolvimento.
5. Isolamento Estágio de Preparação mRNA
- Isolar folículos dos estágios individuais usando o protocolo de isolamento de fase (passo 2), quer com meios de comunicação de Grace ou IVEM.
- Usando uma pipeta de vidro, mova os estágios individuais de interesse em novos poços com mídia, é possível coletar vários estágios de uma só vez.
- Mantenha horários de coleta em 1 hora. Mover os folículos, utilizando uma pipeta de vidro, para tubos de microcentrífuga de 1,5 ml.
- Girar o tubo brevemente, em mini-microcentrífuga para sedimentar todas as folículos. Usando uma pipeta de vidro puxado (veja o passo 3.4) remova cuidadosamente todos os meios de comunicação. NOTA: Se estiver usando um tamanho microcentrifuge completo, girar os folículos em baixa velocidade.
- Adicione 100 ml de Trizol e triturar com a mão para ~ 20 segundos usando um pilão de plástico. Gire para baixo em full-speed em uma microcentrífuga e mover Trizol para um novo tubo de 1,5 ml de microcentrífuga com cuidado para não perturbar qualquer d peletizadaebris. Armazenar a -80 ° C.
- Repita os passos de 5,1-5,5 até folículos suficientes foram obtidos para o experimento. Rotineiramente, ~ 75 S10B, ~ 75 S12, S14 e ~ 100 folículos rendimento ~ 10 ug de ARN.
- Descongelar as amostras em gelo. Combinar as amostras, conforme apropriado, em um tubo de microcentrífuga e levar o volume até 800 Trizol ul. Prossiga com o isolamento do RNA, conforme indicado pelo fabricante. IMPORTANTE: Lembre-se de DNase tratar o RNA isolado com RNase DNase livre.
6. Isolamento Stage para Western Blotting
- Pré-aqueça um bloco de aquecimento a 100 ° C.
- Isolar folículos dos estágios individuais usando o protocolo de isolamento de fase (passo 2), quer com meios de comunicação de Grace ou IVEM. NOTA: É necessário determinar empiricamente quantos de um folículo estágio particular são necessários para observar cada proteína específica. Para proteínas altamente expressas 1-3 S10B folículos / assim é o suficiente para ver um sinal forte em um western blot. No entanto, é importante para fazer umamostra representativa, tendo os folículos de várias fêmeas. Assim, 15-20 folículos de um determinado estágio são normalmente coletados.
- Mover folículos, utilizando uma pipeta de vidro, para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Gire brevemente em um mini-microcentrifuge para agregar os folículos (veja o passo 5.4). Com cuidado, retire toda a mídia usando uma pipeta de vidro puxado (veja o passo 3.4) e adicionar 50 mL de PBS 1x e 50 mL de tampão de Laemmli 2x.
- Moer a mão para ~ 20 segundos com um pilão de plástico. NOTA: pilões de plástico pode ser reutilizado para a moagem de amostras ocidentais por lavagem e o tratamento em autoclave elas.
- Ferver as amostras durante 10 min, no bloco de calor.
- Descontraia brevemente no gelo, girando em velocidade total por 15 segundos em uma microcentrífuga. Ou coloque imediatamente em um gel SDS-PAGE ou armazenar a -20 ° C. NOTA: Se as amostras são armazenadas, lembre-se referver as amostras antes de carregar no gel.
- Realizar análise de western blot seguindo protocolos padrão.
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Representative Results
Quando o isolamento de fases específicas do desenvolvimento folicular Drosophila é essencial ser capaz de distinguir com precisão os diferentes estágios morfológicos. Isto é um pouco difícil de S10A e S10B, como as células de enfermagem e o oócito cada ocupar metade do comprimento do folículo nestas fases (Figura 1B em comparação com 1C). No entanto, os folículos S10A são mais curtos em comprimento do que os folículos S10B, como os folículos S10B são totalmente alongada e, portanto, igual ao comprimento de um folículo S14 (Figura 1C em comparação com 1G). Além disso, um subconjunto do folículo ou células somáticas durante o oócito chamadas células foliculares centrípetas começam a migrar entre as células e a enfermeira de oócitos em S10B. Durante S10B, que leva ~ 5 horas, as células enfermeira sofrer remodelação actina dinâmica para que a S11 contrato células enfermeira, apertando seu conteúdo citoplasmático para o oócito. Assim, em S11, região célula o enfermeiro temdiminuiu significativamente, enquanto que o ovócito expandiu (Figura 1D). Na S12, as células enfermeira começam a sofrer a morte e ter uma aparência mais opaca (Figura 1E), curiosamente, na cultura, restos celulares enfermeira dorsal onda em folículos S12 (ver S12S nas Figuras 3C'-D '). Durante S13, região célula a enfermeira é transparente como a morte celular está sendo concluída, e formação de apêndice dorsal está ocorrendo (Figura 1F). Por S14 só o oócito e as células do folículo permanecem, e formação apêndice dorsal está completa (Figura 1G).
O ensaio em desenvolvimento in vitro pode ser utilizado para avaliar as consequências de vários tratamentos farmacológicos e mutações genéticas no desenvolvimento S10B e celular enfermeira práticas de dumping (Figura 3). O desenvolvimento de S10Bs em cultura é robusta, no entanto, um número de factores que podem levar a resultados experimentais pobres. Na Figura 3A,são fornecidos os dados experimentais de ambos um sucesso e uma experiência fracassada. A experiência bem sucedida é aquela em que 80-100% dos folículos do tipo selvagem em meios de controle de célula completa enfermeira dumping e de progresso para S12-14 (Figura 3A, peso 1). Ocasionalmente, os controlos do tipo selvagem falhará, o que significa que menos de 80% dos folículos desenvolver (Figura 3A, em peso, 2). Este problema pode ser causado por uma série de problemas, incluindo: 1.) Incapacidade para distinguir S10A de folículos S10B (ver as Figuras 1 e 2), 2) os problemas de comunicação (temperatura, idade, etc), e / ou 3) folículos eram exposto a detritos por muito tempo.
O desenvolvimento in vitro de S10Bs pode ser usado em combinação com o tratamento farmacológico. Para esses experimentos, é importante que os controles de drogas, ou seja, o tratamento de folículos do tipo selvagem com a droga, são realizadas com cada experiência, pois a eficácia e / ou concentrando drogaíon pode mudar com o tempo. Para as experiências farmacológicas, é conveniente para analisar a relação entre a percentagem de folículos em desenvolvimento no tratamento da droga para que em meio de controlo, o que controla a pequenas diferenças de fundo genético. Muitas vezes, é útil para o tratamento com a concentração IC50 da droga, o que é a concentração que bloqueia 50% do tipo selvagem (yw) folículos de sofrer célula enfermeira dumping e de um maior desenvolvimento. . Assim, a proporção de folículos de tipo selvagem está prevista para ser de 0,5 (Figura 3B, a droga 1) A Figura 3B é um exemplo de como uma droga (aspirina) pode tornar-se demasiado concentrado (2 droga; provavelmente devido à evaporação do solvente) e bloco maior do que 50% dos folículos do tipo selvagem a partir de desenvolvimento. Para ilustrar ainda mais o desenvolvimento de ensaio in vitro, as imagens dos dois poços de desenvolvimento folículos S10B são fornecidos. Figuras 3C e D ilustram os folículos S10B no início doensaio, de controlo ou de aspirina tratada (~ 2 mm). mídia Figuras 3C 'e D' ilustrar o final do ensaio, revelando que a maioria dos folículos tratados de controlo desenvolveram a S14, enquanto que a maioria dos folículos tratados aspirina não têm célula enfermeira completou dumping.
O ensaio de desenvolvimento in vitro pode também ser utilizada para o rastreio de origens genéticas que são mais sensíveis a uma droga específica. Figura 3E contém dois exemplos disto. No primeiro exemplo, o fundo genético (expt1, azul bar) não consegue interagir com a aspirina como a razão permanece ~ 0,5; por outro lado, no segundo exemplo, o fundo genético (expt2, barra vermelha) aumenta o efeito da aspirina. Assim, o ensaio de desenvolvimento in vitro pode ser utilizado para definir os efeitos de mutações e reagentes farmacológicos sobre os eventos do desenvolvimento e morfológicas que ocorrem durante o fim oogénese; adicionalmente, o ensaio pode ser usado para avaliar tanto farmacológica e interacções genéticos (ver 9).
Isolamento fase também pode ser usado para geração de imagens ao vivo dos processos de desenvolvimento. Figura 4 é um exemplo de um filme de lapso de tempo de um folículo S10B expressando utrophin-GFP, o domínio de ligação da actina a partir de utrofina humana fundida à proteína fluorescente verde. Usando esta ferramenta de imagem, a formação de feixe de actina e de condensação podem ser visualizados. Muitas ferramentas estão disponíveis para geração de imagens ao vivo, incluindo linhagens transgênicas armadilha proteína 16,17, UAS impulsionado fluorescente etiquetado marcadores de organelas (mitocôndrias, Golgi, retículo endoplasmático, etc.), UAS impulsionado fluorescente etiquetado marcadores do citoesqueleto (proteínas de ligação de actina e actina, microtúbulos e proteínas de ligação de microtúbulos), as linhas de transgênicos expressando qualquer fluorescente etiquetado proteína de interesse, e corantes vitais (Nilo Red etiquetas lipídios neutros, rótulos Edu replicar DNA, FM4-64 etiquetas membranas).
ove_content "> A análise molecular pode ser realizada utilizando as fases isoladas de folículos de Drosophila. Para a análise de proteínas por transferência de western, é necessário determinar de forma empírica como muitos folículos, de uma determinada fase de desenvolvimento, são necessários para observar a proteína de interesse. Figura 5 é um exemplo de como a diluir sequencialmente um lisado de proteína concentrada para determinar o número de folículos S10B necessários para observar uma proteína particular, Fascin. Neste caso, um folículo S10B é suficiente para observar essa proteína por transferência de western.
Figura 1. Diagrama descrevendo a composição celular dos folículos Drosophila e imagens que ilustram a diferença morfológica do meio-de-final de estágio Drosophila follicles. A. Diagrama que representa a composição celular de um folículo S10A. BG. Imagens representativas dos folículos S10A-S14 Drosophila tiradas com um aparelho de som dissecar escopo. O folículo Drosophila consiste de 16 células derivadas de células germinativas: 1 oócito (vermelho, A) e 15 células de enfermagem ou de apoio (amarelo, A), que está cercado por ~ 650 células epiteliais somaticamente derivados (branco, magenta e ciano, A ). No S10A, uma metade do comprimento do folículo é composto de células de enfermagem (faixa amarela, B), que são cobertos pelas células foliculares de estiramento (magenta em A), e a outra metade é composto do oócito (asterisco vermelho , B), que é coberta pelas principais células do folículo corpo (brancos em A). No S10B, as células de enfermagem (suporte amarelo, C) e oócitos (asterisco vermelho, C) cada compor metade da length do folículo, no entanto, o comprimento total do folículo é agora igual ao de um folículo S14 (comparar C e G). Durante S11, as células de enfermagem (suporte amarelo, D) apertar rapidamente os seus conteúdos citoplasmáticos no oócito alongando (asterisco vermelho, D) em um processo de actina / miosina-dependente denominada célula enfermeira dumping. Por S12, o oócito (asterisco vermelho, E) foi totalmente alongado como célula enfermeira despejo é restos completos e apenas celulares enfermeira permanecer (suporte amarelo, E). Os restos celulares enfermeira (suporte amarelo, F) a morte celular completa a S13. S14 representa o folículo totalmente maduro, que é composto pelo oócito (asterisco vermelho, G), células somáticas, e casca de ovo, incluindo os apêndices dorsais (setas brancas, G). B. Escala bar = 0,1 mm.
Figura 2. Imagens fornecendo uma visão geral de dissecção dos ovários e do isolamento do folículo. A. Mergulhe a mosca na mídia dissecando e orientá-la para que ela seja realizada, por fórceps, na mão não dominante. B. Usando a mão dominante, agarre a cutícula no posterior do abdômen. C. Retire a cutícula fora, expondo os ovários (seta amarela). D. Trabalhando a partir do anterior do abdome em direção ao posterior, esprema delicadamente o abdômen liberando os ovários (seta amarela). E. Separe os ovários (seta amarela) a partir de qualquer cutícula restante (seta vermelha) e / ou órgãos internos (setas brancas). F. Transfira os ovários isolados a uma nova mídia dissecando bem que contêm. G. separar os ovários, o uso de agulhas de dissecação, para expor indifolículos individuais (comparar ovário intacto (superior) para ovário separados (em baixo). Branca seta aponta para um folículo S10B esfaqueado, um exemplo de um folículo que não deve ser utilizado para os experimentos posteriores. H. Selecionar os estágios morfológicos de interesse (estágios 10A -14 (S10A-S14) mostrado).
Figura 3. Exemplos de ensaios in vitro de desenvolvimento. A. Gráfico da porcentagem de S10B folículos que o desenvolvimento completo em cultura. peso 1 é um exemplo de desenvolvimento esperado de tipo selvagem folículos S10B (96% em desenvolvimento), enquanto em peso 2 é um exemplo de fraco desenvolvimento em cultura (68% em desenvolvimento). Nós normalmente descartar toda a experiência se o desenvolvimento de folículos do tipo selvagem S10B no meio de controlo é inferior a 80%. B. 50 para a aspirina à percentagem em desenvolvimento nos meios de controle. A IC50 é a concentração que bloqueia 50% dos folículos S10B de desenvolvimento, o que significa que o valor do tipo selvagem deve ser ~ 0,5. Drogas 1 é um exemplo da relação de tipo selvagem esperado (0,52), enquanto fármaco 2 é um exemplo do que acontece quando a concentração do fármaco é demasiado forte (0,37). CD '. Imagens de poços de desenvolvimento in vitro. CC'. Controlo tratada. DD '. Aspirina tratada (~ 2 mM). CD. Imagem da S10Bs no início do ensaio. C'-D'. Imagem dos folículos no ponto final do ensaio. Controle tratado folículos S10B desenvolver a S14s em cultura (C '), enquanto que a maioria dos folículos tratados aspirina não conseguem completar célula enfermeira práticas de dumping (D').
Figura 4. Exemplo mostrando o uso isolado S10B folículos para geração de imagens ao vivo. AF. Projeções máximas de 3 fatias de time-lapse z-pilhas de um folículo S10B isolado do utrophin :: GFP expressando moscas transgênicas (SQH-utrophin :: GFP). A'-F '. Inserções Magnified destacar uma única célula de enfermeira A- F. AF '. F-actina (utrofina :: GFP), branco. A, A'. Tempo (t) = 0 min. B, B '. T = 20 min. C, C'. T = 40 min. D, D '. t = 60 min. E, E'. t = 80 min. F, F '. t = 100 min. No ponto de tempo inicial, os filamentos de actina curtos pode ser observado que se estende para dentro a partir das membranas celulares enfermeiro (A, A '). Estes filamentos de actina alongar ao longo dos primeiros pontos de tempo (BC "em comparação com A, A ') até que estejam totalmente alongado (D, D'). Em momentos posteriores, esses filamentos de actina totalmente alongadas, em seguida, reduzir e condensar todo célula enfermeira práticas de dumping (EF ') bar A. Escala = 50 mm. A' Barra de escala. = 10 m.
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.. Figura 5 Ilustração de como determinar o número de folículos necessários para examinar uma determinada proteína por western blot Este é um western blot olhando expressão Fascin em folículos S10B (01:20, sn 7C, Cooley, L.; estudos de desenvolvimento Hybridoma Bank (DSHB), desenvolvido sob os auspícios do NICHD e mantido pela Universidade de Iowa, Departamento de Biologia, Iowa City, IA, 52242). Os números na parte superior representam o número aproximado de folículos S10B carregados por pista.
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Discussion
O folículo Drosophila é composto de apenas um pequeno número de tipos de células, tornando-o ideal para ambos morfológica e análises moleculares. Além disso, devido à estrutura do ovário, é relativamente fácil de obter um grande número de fases específicas do desenvolvimento folicular com um escopo de dissecação comum e uma formação mínima. À medida que cada estágio representa uma janela temporal, curto, isolamento fase pode fornecer informações moleculares significativas nos processos de desenvolvimento que ocorrem durante essa fase. Por exemplo, usamos meio-de-final de isolamento fase folículo para caracterizar as mudanças de expressão de genes que ocorrem durante S10B, S12, S14 e 18. Esta análise sugere um certo número de genes não caracterizados previamente são passíveis de contribuir para o desenvolvimento folicular e, em particular, a formação, de casca de ovo.
Isolamento Palco pode fornecer insights dramáticos em eventos morfológicos através de imagens ao vivo. Essa imagem pode ser realizada em al l estágios de desenvolvimento folicular Drosophila. Embora o foco deste trabalho é S10B-14, os leitores são referidos os seguintes artigos para live-imagem das fases anteriores: germário 13, folículo de alongamento 19 e estágio 9 11,12,14. As condições de cultivo utilizadas nestes estudos são distintos daqueles discutidos neste trabalho. Especificamente, estes estudos utilizaram Schneider Insecto meios com níveis variáveis de FBS (2,5-15%), bem como a adição de insulina 11-13,19 e, em alguns casos, a adição de mais de trealose, metopreno, 20-hidroxiecdisona e adenosina deamidase 14. É importante ressaltar que esses estudos de imagem ao vivo têm avançado significativamente nossa compreensão dos eventos que ocorrem durante estes estágios iniciais de desenvolvimento. No entanto, esses folículos em estágio inicial não pode progredir todo o caminho até a fase final do desenvolvimento folicular, S14. Inversamente, S10B-13 irá desenvolver a S14 na cultura.
ove_content "> Durante S10B-S14 muitos processos morfológicas que ocorrem podem ser estudados por imagens em tempo real. Por exemplo, imagens em tempo real pode ser utilizado para analisar o processo de despejo célula enfermeiro, o processo pelo qual as células enfermeira espremer o seu conteúdo citoplasmático para o oócito para fornecê-lo com tudo o que precisa para completar a embriogênese. célula enfermeira despejo pode ser observado por imagem time-lapse usando luz transmitida 7 ou por imagem confocal usando linhas de transgênicos expressando marcadores fluorescentes (ver Figura 4) uso. Continuação de imagens ao vivo está prevista para fornecer novos insights sobre a dinâmica do citoesqueleto das células necessárias para a enfermeira dumping. Live-imagem das fases posteriores também avançou a nossa compreensão do apêndice dorsal migração primórdios e tubulogenesis 10.Desenvolvimento in vitro de folículos S10B-S13 pode ser utilizado para definir os efeitos de ambos os reagentes farmacológicos e manipulações genéticas nos processos ocorremtocar durante este tempo. Temos usado no desenvolvimento in vitro de folículos S10B para estabelecer o papel das prostaglandinas na regulação celular enfermeira despejo 7. Posteriormente temos vindo a utilizar este ensaio para realizar uma tela farmacológico-interação, especificamente, temos vindo a testar se a perda de uma cópia de um regulador de actina aumenta ou suprime a célula enfermeira despejo defeitos devido à perda de prostaglandinas. Este ecrã tem revelado uma série de alvos a jusante putativos (9 e Spracklen, Meyer, e Tootle, dados não publicados). O ensaio também pode ser utilizada para analisar interacções genéticas por meio da avaliação de defeitos de desenvolvimento, tais como um bloco na célula enfermeira imersão, devido a heterozigosidade para dois factores diferentes (para um exemplo deste ver 9).
Enquanto isolando meio-de-final palco folículos Drosophila é um processo bastante simples, há uma série de fatores críticos para o sucesso ideal. Em primeiro lugar, a preparação das moscas estámuito importante. É melhor manter a diferentes genótipos de moscas em uma condição tão semelhante quanto possível, ou seja, o número de moscas por frasco, a proporção de mulheres para homens (proporção de 2:1 é o ideal), e fornecer fresco, fermento molhado de forma consistente. A alimentação (levedura úmida) e tempo de dissecção irá alterar a prevalência dos diferentes estágios de desenvolvimento. Verificou-se que quando as moscas são constantemente alimentado na parte da manhã, mais S10Bs pode ser isolado de manhã, ao passo que mais S12S estão presentes no período da tarde. Um segundo fator crítico é a mídia. Para o desenvolvimento in vitro e imagens ao vivo é essencial para preparar mídia IVEM frescos. Além disso, a mídia deve atingir a temperatura ambiente como mídia frias alterará as citoesqueleto, tanto actina e microtúbulos, e, portanto, pode afetar o desenvolvimento. É também importante para manter os folículos longe de detritos. Às vezes, durante a dissecção, o intestino vai sair com os ovários. Descobrimos que, se o intestino é rompidae os folículos são mantidos nos meios contaminados, os folículos não são susceptíveis de se desenvolver em cultura. À medida que os folículos de continuar a desenvolver-se em cultura, que é essencial para reverificar o preparo após dissecção antes de prosseguir com o desenvolvimento in vitro ou análises moleculares. Por fim, é importante ter um controlo adequado para as experiências. Para o desenvolvimento in vitro, é necessário o uso de folículos do tipo selvagem para testar que a mídia permite o desenvolvimento normal (80-100% de células enfermeira completa dumping), e para testar se os reagentes farmacológicos agir como esperado (veja a Figura 3).
Em conclusão, o isolamento do meio-de-final folículos fase de Drosophila podem fornecer uma visão significativa em processos de desenvolvimento através de uma variedade de técnicas experimentais.
Tabela de Reagentes e Equipamentos específicos:
| Nome do reagente | Companhia | Gatomum número | Comentários (opcional) |
|---|---|---|---|
| Ativa do fermento seco | Genesee Científica | 62-103 | Qualquer fonte de atividade do fermento seco é bom |
| Grace Insect Mídia | Lonza | 04-457F | |
| Inactivado por calor de soro fetal bovino | Atlanta Biologicals | S11050H | Qualquer inactivado pelo calor FBS deve funcionar |
| 10x Pen / Strep | Gibco / Invitrogen | 15140-122 | |
| Pin Vises e agulhas | Ted Pella, Inc. | 13561-10 | |
| Placa de ponto, Nine Bem | Corning | 7220-85 | |
| # 5 fórceps Dumont | Ferramentas Ciência Belas | 11252-20 | |
| 24 placas de múltiplos poços | Becton Dickinson | 35 3226 | Qualquer 24 poços de cultura de tecidos prato deve trabalhar |
| Pratos lamela inferior (35 mm) | MatTek Corporação | P35G-1.0-14-C | Espessura da lamela irá depender do microscópio / objectivo ser usado |
| Pipetas de vidro | Corning | 7095B-5x (para a transferência de folículos) 7095B-9 (para a produção de pipetas puxados) | |
| Pilão da amostra (1,5 mL; RNase / DNase livre) | Produtos de Pesquisa Internacional | 199228 | Qualquer pilão plástico que encaixa tubos de microcentrífuga de 1,5 ul pode ser usado |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 |
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Disclosures
Não há nada a divulgar.
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer a Thomas Lecuit (SQH-utrophin :: linha GFP), o Bloomington Stock Center, ea Developmental Studies Hybridoma Banco de reagentes. Agradecemos ainda todos os membros do Laboratório Tootle para discussões úteis e críticas do manuscrito. O financiamento da National Science Foundation MCB-1158527, e fundos de arranque da Anatomia e Departamento de Biologia Celular da Universidade de Iowa apoiaram este trabalho. National Institutes of Health Predoctoral Training Grant em Ciências Farmacológicas T32GM067795 apoiado AJS. Suporte de armazenamento de dados foi fornecido pela ICTS, que é financiado através do CTSA apoiado pelo Centro Nacional de Pesquisa de Recursos e do Centro Nacional para a Promoção da Ciência Translacional, Institutos Nacionais de Saúde, através Grant UL1RR024979.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Active Dry Yeast | Genesee Scientific | 62-103 | Any source of Active Dry Yeast is fine |
| Grace’s Insect Media | Lonza | 04-457F | |
| Heat Inactivated Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11050H | Any Heat Inactivated FBS should work |
| 10x Pen/Strep | Gibco/Invitrogen | 15140-122 | |
| Pin Vises and Needles | Ted Pella, Inc. | 13561-10 | |
| Spot Plate, Nine Well | Corning | 7220-85 | |
| #5 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| 24 multi-well plates | Becton Dickinson | 35 3226 | Any 24-well tissue culture dish should work |
| Coverslip Bottom Dishes (35mm) | MatTek Corporation | P35G-1.0-14-C | Coverslip thickness will depend on the microscope/objective being used |
| Glass pipettes | Corning | 7095B-5x (for transferring follicles) | |
| Glass pipettes - long | Corning | 7095B-9 (for producing pulled pipettes) | |
| Sample pestle (1.5 μl; RNase/DNase free) | Research Products International | 199228 | Any plastic pestle that fits 1.5 μl microfuge tubes can be used |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 |
References
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