Summary
在本出版物中，我们描述了一个快速，便捷的程序，用于隔离和培养主要从小鼠胰腺腺泡细胞。这种方法构成一个有价值的方法，以新鲜的正常/未转化的胰腺外分泌细胞的生理研究。
Abstract
此协议允许快速分离小鼠胰腺腺泡（少于1小时），使得有可能保持它们在培养一周以上。可以从一个单一的小鼠胰腺获得超过20×10 6个腺泡细胞。此协议可提供在独立处理多达10个并行胰腺。因为它保留腺泡结构，这种模式非常适合从胰腺肿瘤，这显示许多基因的改变，造成部分或者全部丧失腺泡分化的细胞系的建立在体外胰腺外分泌的生理研究。
Introduction
一个经常遇到的问题为研究实验室工作外分泌胰腺组织腺泡细胞在体外培养一段时间足够长，以允许长期实验的难度。
的一个因素阻碍这种培养系统的发展是由于在糖酵解，蛋白水解和脂解酶，字面消化的胰腺组织胰腺细胞的分离过程中，当它们被释放到高含量的实验操作胰腺组织所固有的灵敏度。
第二个因素是显着的体外可塑性腺泡细胞，这往往会失去它们的分泌特性和转分化其他成熟细胞，如胰腺导管细胞或肝细胞样细胞1。 在体外 ，这种细胞的可塑性变化与实验条件（如培养基成分）2 1到设计中引入了一定程度的复杂性。
已经开发了几种方法的腺泡细胞的分离和培养，从豚鼠胰腺3-5的第一。最初，这些协议涉及消化胰腺组织胶原酶糜蛋白酶和蛋白酶鸡尾酒的，剧烈的机械分离与最终的隔离。以这种方式分离的胰腺细胞显示异常的结构和功能特征，特别是根尖的结构和显着损害其膜受体的损失。分离出的细胞仍然是可行的只有1或2天。
制备分散，腺泡维护其内和细胞间的建筑，保护细胞膜，限制损坏表面受体，从而改善外分泌泌6-8。作为一个RESU，LT，这种方法提供延长7-10 天的体外腺泡细胞活力的主要优点。此外，这种方法目前优选的腺泡细胞分离9-12，因为维持细胞间的接触，包括通过间隙连接的细胞耦合，是一个重要的决定因素外分泌胰腺腺泡细胞表型的13。
由于去分化，腺泡细胞和导管上皮细胞转分化的起源积极的胰腺外分泌癌14建议的机制之一，分散腺泡模式也是足够的系统来研究胰腺癌的可塑性和其随后的分子机制。此外，在结合使用转基因动物的15,16和转基因技术的发展（2腺病毒或慢病毒转导，使用的纳米颗粒等），这可以在体外原腺泡细胞模型在确定各种遗传功能障碍如何影响腺泡细胞分化或去分化和调控，应该提供更好的了解胰腺炎的发作，癌前病变，细胞的可塑性变化的分子事件负责是非常有用的。
隔离分散腺泡是我们使用的方法，在我们的实验室中培养胰腺腺泡细胞。在这里，我们描述和讨论所采用的方法。它涉及酶解耦合无腺泡细胞的分离机械破碎胰腺组织（细菌胶原酶）。虽然大多数协议涉及培养腺泡，暂停或经过特殊处理的塑料基板，我们的成长他们只是简单地悬浮（24小时），播种之后如果需要长时间的细胞培养基质支架上。
此协议允许快速分离（少于1小时）分散胰交流INI，持续一个多星期的文化。它允许超过20×10 6每小鼠胰腺腺泡细胞的隔离。它的简单性使得能够处理多达10个独立的胰腺平行。保持腺泡内和细胞间的架构，从而腺泡分离的原代细胞的表型，这种模式构成了系统的首选转分化机制的研究，胰腺外分泌功能的机型，目前市面上的所有其他来自显示许多遗传性胰腺肿瘤改变导致细胞转化。
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Protocol
伦理委员会批准，所有程序监管的政府机关（“委员会评估COMMUN坳中心列昂·贝拉尔，A L'Animalerie中转DE L'ENS，AU PBES等AU LABORATOIRE P4”（CECCAPP））。小鼠保持在无特定病原体动物设施在的“PLATEFORME AniCan中心莱昂BERARD”（法国里昂），并符合机构的指引处理。
图1中所示的程序的示意图。
1。胰腺的解剖和的弯曲齿（0天）
一个非常迅速的夹层是一个最佳的提取收率的关键，并确保良好的生存能力培养的细胞。为了减少胰腺隔离所需的时间，所有的仪器和设备必须准备好之前，鼠标安乐死。
- 安乐死鼠标CO 2窒息或颈椎脱位。
这一步，所有的程序都必须与无菌剥离设备无菌的气氛下进行的（生物安全柜，II级）。
- 修正了鼠标和鼠标腹部喷用70％的乙醇。与任何解剖剪刀和镊子，作出一个V形的切口，并继续在生殖器区域隔膜完全打开腹腔。
- 位置对隔膜的肝叶如果身体腔是开放远远不够，他们应该留在那里。拉你的左边腹腔外，肠道和结肠，发现直肠。随着一对弯曲的镊子和解剖剪刀，抓斗和部分直肠。
- 在相同的双钳，仔细展开完全从直肠的肠道胃在你的左边拉肠道。
- 诺伊斯剪刀和一双镊子，小心地切沿着肠和胰腺具有健脾从其余的消化道中解脱出来。
- 抓斗的脾脏和胰腺部分连接（ 图2）。
在该步骤中，确保没有肠系膜脂肪组织和/或其他邻近组织（脾，肠等），可以收集与胰腺，以避免细胞污染。
如果在该程序的其余部分，来制备所有的缓冲区必须无钙离子Ca 2 +的螯合剂，以避免在单腺泡细胞外分泌胰腺组织的完整的解离。
- 在汉克的平衡盐溶液（HBSS）1X两次冲洗胰腺。
在这一步，因为脂肪组织会浮，胰腺会下沉，能够容易地可视化和迅速去除污染物的白色脂肪组织仍连接到胰腺。
如果胰腺需要被运送到细胞培养设备，它必须保持在冰上在HBSS中1个。
- 在无菌培养皿中含有5毫升的HBSS 1X胰腺转移。使用诺伊斯用剪刀和解剖刀，胰腺切片在1至3毫米3（ 图3A）的小件。
2。胰腺酶法和机械解离（0天）
- 将它们转移到无菌的50毫升的聚丙烯管中。
- 离心2分钟，在450×g离心4℃。吸弃上清，以去除细胞碎片和血细胞。
- IA型胶原酶溶液中加入10毫升（含HBSS，1X 10毫米HEPES，200 U / ml的collagena本身IA和0.25毫克/毫升的胰蛋白酶抑制剂），胰腺部分。使用25毫升血清吸管，将他们转移到一个25厘米2烧瓶。孵育20-30分钟，在37°C。 （每5分钟），在这段时间内进行机械分离大力的往复移动胰腺十倍左右的片段，在减小尺寸的无菌移液管（25，10，和5ml血清移液管）。
在此步骤中，有必要频繁地监测胰腺部分酶解的程度。
- 当胰腺组织似乎是游离（根据胰腺片段的消失和该溶液的混浊度增加）（ 图3B），停止酶反应通过加入10毫升冷的洗涤缓冲液（HBSS，1X含有5 ％胎牛血清（FBS）和10毫米的HEPES）。
- 转移到无菌的50毫升聚丙烯管和离心泵ifuge 2分钟，以450×g，4℃下小心吸弃上清，除去胶原酶IA解决方案。
- 重悬缓冲洗涤液用10毫升洗涤沉淀。离心3分钟，在450×g离心4℃。小心吸弃上清。重复此步骤两次。
3。过滤和播种分散腺泡（0天）
- 重悬细胞沉淀在7ml的Waymouth培养基含2.5％FBS，1％青霉素 - 链霉素混合物（PS），0.25 mg / ml的胰蛋白酶抑制剂，和25 ng / ml的重组人表皮生长因子（EGF）。
- 滤液中的细胞混合物中，允许它通过一个100微米的过滤器保留的非消化的片段（导管，血管，和胰岛）。胰腺腺泡结构（10-15细胞腺泡）通过。
- 用6ml的Waymouth培养基含FBS，PS，胰蛋白酶INH冲洗过滤器ibitor，和表皮生长因子。
在这一步之后，细胞必须是非常仔细地处理，以避免任何腺泡解离。
- 种子隔离腺泡在6孔培养皿中，每孔（2毫升）（ 图3C）。在37℃下，5％（体积/体积）的CO 2气氛中进行培养。
在这一步之后，腺泡细胞的悬浮培养。
4。腺泡细胞培养（1至10天）
- 二十四小时后，转移腺泡（悬浮液中）到一个新的6孔培养皿中，以消除污染物的细胞和细胞残留物附着过夜（ 图4）。
如果细胞培养数天或数本实验条件下，如果需要在单层培养的细胞，它是建议基质支架上，以传输和种子腺泡需要被扩展。
- 看到前一天鼎矩阵支持（0天），大衣型6孔培养皿I型胶原（5微克/厘米2）。 I型胶原蛋白的溶液中加入1毫升（50微克/毫升的0.02M的醋酸，0.2微米的过滤）在各孔中，在1小时，在37℃（或4过夜，使其被动地吸附于塑料℃下）。
- 吸I型胶原蛋白溶液和，冲洗两次磷酸盐缓冲液1X涂好。
- 允许涂好干（下微生物安全柜）使用前至少12小时。
- 隔离的主腺泡（在步骤4.1中得到的）转移到不同的I型胶原涂层的6孔培养皿中，并对其进行培养如先前所述，在相同的条件下（在37℃下在5％（体积/体积）的CO 2气氛中） 。细胞附着到I型胶原基板2天。
- 第3天，改变培养基中没有遵守，以消除非活菌。随着培养时间的增加，细胞会逐步SP阅读的含有胶原的支持。改变培养基每3天（ 图5）。
孤立的腺泡细胞后，可以算作一个完整的机械分离由使用托马细胞的计数室。注意隔离腺泡细胞不能被随后保持在培养。
可以得到腺泡文化的质量控制检查腺泡细胞的特异性标记物（如胰蛋白酶 ， 胰转录因子1亚基α，或羧肽酶A1（由免疫细胞化学或免疫荧光实验））的表达。
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Representative Results
图1图式“分散”腺泡主要腺泡细胞的分离方法。的关键步骤，这在协议过程中都必须严格遵守的讨论部分中描述的。
以方便其剥除，胰腺从腹部与附加的脾脏（ 图2）一起被收集。两个机构需要削减分开，仍然可以连接到胰腺残余的脂肪组织必须被删除（步骤1.6）。
宏观和微观图片， 如图3所示，代表每一个步骤的胰腺酶和机械解离后的结果。胰腺切片后，被划分为几个小部分（ 图3A中 ，步骤1.8）。 图3B示出了一个成功的酶解依靠仔细tempor方面的胰腺中人持续消化监测（步骤2.4）。这一步是至关重要的一步，以确定确切的时间。 图3C示出过滤后的胰腺混合物（步骤3.4）所获得的材料。只有分隔腺泡这一步后保留。
图4是一个典型的第1天，说明胰腺腺泡隔离使用我们的协议。腺泡细胞转移到一个新的培养皿可以消除的细胞碎片和附着的污染物细胞（步骤4.1）。
在图5中所示，I型胶原上培养时，腺泡细胞传播而失去它们的的腺泡分化（形态和三维组织），产生单层纺锤状细胞（步骤4.6）。
图1。示意性表示的协议，允许隔离小鼠原代分散腺泡。
图2。大体解剖胰腺的解剖后，红色和黄色的箭头分别指示剩余的脾脏和肠系膜脂肪组织的解剖与胰腺收集，需要削减。
图3。分散腺泡隔离（0天），用肉眼观察（左图）和相衬显微镜（右面板中，40倍的放大倍率）。A）弯曲齿后（25厘米2烧瓶中所示），B）在IA型胶原酶消化和活力机械dissociatiC）在6孔培养皿后过滤，并传输。
图4。分散腺泡文化，播种后24小时（1天），用相衬显微镜（40X的放大倍率）。
图5。分散腺泡上培养在I型胶原包被的盘2天，4天，7用相衬显微镜（40X，120X和240X的放大倍数）。
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Discussion
在这个协议中，我们描述了一个程序隔离胰腺腺泡细胞。在小于1小时，这种方法使得有可能超过20×10 6个腺泡细胞，每只动物隔离。由于其快速和简单的实现（多达10个胰腺可以被独立处理每个实验并行），该协议将出现一个很好的妥协之间的隔离方法3-5,9-12,17。
关键步骤/故障排除
这种方法的效率依赖在几个关键点上采取的预防措施。胰腺弯曲齿（步骤1.8）的第一个步骤是必不可少的随后的胰腺酶消化。切割不足会降低酶的解离和腺泡细胞的数量获得的产率。这就需要用胶原酶IA延长潜伏期，不可避免地造成过度腺泡细胞的连续解离地增加细胞死亡。
注意，上述的第二个关键步骤是消化胶原酶IA（步骤2.3）。酶解过多导致细胞死亡的一种高速率。胰腺消化的程度，必须经常监测在这个关键步骤（ 图3B）。经过机械和酶的解离，需要特别注意以非常轻柔地处理，以保持其胞结构分散腺泡支付。
限制
即使表皮生长因子（EGF）的Waymouth的文化的添加可能逐步腺泡导管转分化沉淀，它是维持细胞存活。
中所描述的协议和腺泡细胞的体外培养期间，如果需要的话，可以延长至多达10天播种细胞矩阵斯卡夫如I型胶原的孩子。然而，重要的是，由他人，培养细胞对I型胶原诱导腺泡细胞，导管上皮细胞转分化的进步。此过程开始后4天培养对胶原，并可以完成后7天。因此，可能有必要检查是否存在一个特定的导管的标记，如囊性纤维化跨膜电导调节器或角蛋白19（由免疫细胞化学或免疫荧光实验），如果需要延长1周腺泡细胞培养。作为基质支架，替代使用的基底膜通过减少分散腺泡的粘附，使得它可以延长他们的腺泡细胞表型的维持2天。
可能的修改
在剥离步骤直肠切片，增加细菌污染的风险。我们从来没有经历过这样的原位通报BULLETIN。然而，如果需要的话，还有另外一个程序来规避这种可能的问题。它由寻找胃，脾脏和十二指肠的第一部分，和连接的胰腺切片。请注意，这个替代过程需要完美掌握。否则，将得到剥离的持续时间更长的时间，然后拆下的生物材料的质量危害。
可以被优化的长期腺泡细胞的单层培养，特别是通过修改载体基质。如果需要，通过本实验条件下，I型胶原，可以被替换为另一种脚手架，如基底膜。在这种情况下，基质胶必须新鲜配制，在400微克/毫升的浓度在冷的磷酸盐，1X缓冲盐水。此后，井与基底膜（40微克/厘米2）温育在4℃下过夜这点一定要严格尊重。的培养过程中保持在步骤4中所描述的相同。
该方法CAN是进一步优化经验。例如，胰腺外分泌细胞在培养基中的氨基酸的量能调节蛋白质的合成，这些细胞18。 等 sphyris 2和BLAUER 等 19人阐述了一个完整的培养基中含有较高量的氨基酸（必需的和非必需的），促进维护腺泡细胞的分化状态。这种介质可能是非常有用的，如果一个人希望通过这种方法隔离了10多天的文化腺泡细胞。
另一个参数可以修改，如果需要长期培养，培养基中的pH值。生理上，腺泡细胞的顶端极是永久性的接触与富含碳酸氢钠，呈弱碱性的液体，从而引起胰液。这是诱人的推测，腺泡细胞环境的pH值可以在保持腺泡differentiatio的重要n个状态。某些协议先前报道了利用培养基中的pH值调整为7.8，以模仿“最初的”生理腺泡细胞19。
该技术中的意义
重要的是要提的是存在其他协议腺泡细胞培养，采用胰腺外植体和器官培养19。从外植体的膜，他们培养的胰腺细胞迁移的基础上，他们的应用程序，是比较困难的。这些胰腺细胞的分离，特别是需要的胰腺外植体培养的第一周。这种方法的主要优点是，没有酶解是必要的，这样既细胞膜的完整性和细胞 - 细胞相互作用被保留。在这些条件下，腺泡细胞可以在体外保持长达14天。然而，腺泡细胞培养是不是纯，和污染物的成纤维细胞，导管Ç细胞l，血管内皮细胞是不可避免地存在，这可能是不与某些类型的实验。相比之下，我们的过程中迅速产生一个纯粹的人口腺泡细胞，腺泡保护其初始架构。
多雷尔等人描述了另一种方法，为了分离不同的小鼠胰腺细胞类型（包括腺泡，导管，和内分泌细胞），用荧光激活细胞分选（FACS）17。这种方法是非常有效的腺泡细胞获得纯（或特定）人口。然而，它需要一个与特异性抗体的荧光标记之前，排序。此外，这个过程还需要在流式细胞仪和流式细胞仪的专业知识。此外，这种技术不允许腺泡细胞扩展的文化，由于他们最初的架构腺泡的损失。我们的快速方法允许延长分散腺泡细胞体外培养的质量，纯度，再进一步大部分日常应用的兼容。
未来的应用
一旦掌握了这种技术用于隔离/培养腺泡细胞应该在解决一系列问题被证明是非常有用的，特别是调查参与胰腺的可塑性和转分化的机制，这是众所周知的，但知之甚少。通过保留一些间和细胞内的通信，这分散腺泡模式仍然比永生细胞株生理有关。
胰腺肿瘤发生在该领域中，这种初级细胞模型提供了一个足够的系统研究腺泡细胞转分化，其中一个提议的机制，以产生积极的胰腺癌。人或鼠虽然永生细胞株（如Colo357，PANC-1，或BxPC3）可能是更灵活的使用比主腺泡细胞，其来源和他们的比赛法的的遗传状态（最初作为转化细胞系分离出胰腺肿瘤，甚至胰腺癌转移）构成重大研究这种机制的弊端。
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Disclosures
作者宣称，他们有没有竞争经济利益。
Acknowledgments
我们感谢工作人员AniCan（CRCL，里昂），动物保健技术援助。这项工作是协会倾LA RECHERCHE SUR LE癌症研究所杜国家癌症研究所国家德拉健康等德拉RECHERCHEMédicale（INSERM艾文莉计划），国家法甲抗癌症，支持，并通过奖学金从国家法甲抗癌症（JG），从研究所国家杜癌症（JG），部DE L'ENSEIGNEMENT高等等德拉RECHERCHE法国（RMP和DFV）协会倾LA RECHERCHE SUR LE癌症（ DFV）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 μm filter | Dutscher | 146560 | |
| 10 ml serological pipettes | Beckton Dickinson | 357551 | |
| 100 μm filter | Beckton Dickinson | 352360 | |
| 100 mm Petri dish | Beckton Dickinson | 353003 | |
| 1000 μl filter tips | Starlab | S1122-1830 | |
| 20 μl filter tips | Starlab | S1120-1810 | |
| 200 μl filter tips | Starlab | S1120-8810 | |
| 25 ml serological pipettes | Beckton Dickinson | 357535 | |
| 5 ml serological pipettes | Beckton Dickinson | 357543 | |
| 50 ml polypropylene tube | Beckton Dickinson | 352070 | |
| 6-well plate | Beckton Dickinson | 353046 | |
| Acetic acid 100% | VWR BDH Prolabo | 20104.298 | |
| Collagenase IA | Sigma-Aldrich | C2676 | |
| Curved forceps, Dumont #7 | World Precision Instruments | 14188 | To sterilize before use |
| Dissecting scissors, straight | World Precision Instruments | 14393 | To sterilize before use |
| Epidermal Growth Factor, human | Promokine | C-60180 | |
| Ethanol absolute (AnalaR Normapur) | VWR BDH Prolabo | 20821.310 | |
| Fetal Bovine Serum | Lonza | 14-801F | |
| Forceps, Dumont #5 | World Precision Instruments | 14098 | To sterilize before use |
| Hank’s Balanced Salt Solution 1x | Gibco | 14025050 | |
| HEPES 1 M (pH 6.98-7.30) | Lonza | 17-737F | |
| Incubator O2/CO2 | Sanyo | MCO-19M | |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse TS100 | |
| Matrigel | Beckton Dickinson | 356234 | |
| Microbiological Safety Cabinet, level II | Faster | SafeFast Elite 212 S | |
| Noyes scissors, sharp/sharp tips, German | World Precision Instruments | 500228-G | To sterilize before use |
| Penicillin-Streptomycin mixture | Gibco | 15140122 | |
| Phosphate Buffer Saline 10x | Gibco | 14200067 | |
| Pipet-Aid | Drummond Scientific Company | Pipet-Aid XP | |
| Pipetman P1000 | Gilson | F123602 | |
| Pipetman P20 | Gilson | F123600 | |
| Pipetman P200 | Gilson | F123601 | |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Scalpel | Paramount Surgimed Ltd. | Disposable Scalpel Size 23 | |
| T25 flask, 25 cm2 | Sigma-Aldrich | Z707481 | |
| Trypsin inhibitor, from Glycine Max | Sigma-Aldrich | T6522 | |
| Type I collagen | Beckton Dickinson | 354236 | |
| Waymouth’s medium | Gibco | 31220-023 |
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