Summary
xenografts גידול האנושי בעכברים עם מערכת חיסון חלשים הם כלים רבי ערך כדי ללמוד ביולוגיה בסרטן. פרוטוקולים ספציפיים כדי ליצור xenografts תת עורי וintrahepatic מתאי אנושיים hepatocellular קרצינומה או שברי גידול מתוארים. התחדשות כבד הנגרמת על ידי כריתה חלקית בעכברי נמען מוצגת כאסטרטגיה כדי להקל על קליטתם intrahepatic.
Abstract
In vivo מודלים ניסיוניים של קרצינומה hepatocellular (HCC) כי לשחזר את המחלה האנושית מספקים פלטפורמה רבת ערך למחקר להפתופיזיולוגיה מחלה ולהערכה קליני של טיפולים חדשניים. אנו מציגים מגוון רחב של שיטות ליצירה תת עורית או xenografts HCC האנושי בעכברים עם מערכת חיסון חלשים orthotopic שיכול להיות מנוצל במגוון רחב של יישומי מחקר. עם דגש על השימוש ברקמת גידול ראשונית מחולים שעברו כריתה כירורגית כנקודת התחלה, אנו מתארים את ההכנה של השעיות תא או שברי גידול לxenografting. אנו מתארים טכניקות ספציפיות לxenograft רקמות אלה תת עורי), או ii) intrahepatically, או על ידי השתלה ישירה של תאים סרטניים או שברים בכבד, או בעקיפין על ידי הזרקה של תאים לתוך טחול העכבר. אנו גם מתארים את השימוש של כריתה החלקית של כבד עכבר הילידים בזמן xenografting כאסטרטגיה ללגרום למצב של התחדשות כבד פעילה בעכבר הנמען שעשוי להקל על קליטתם intrahepatic של תאים סרטניים אנושיים ראשוניים. התוצאות הצפויות של טכניקות אלה באים לידי ביטוי. הפרוטוקולים שתוארו אומתו באמצעות דגימות אנושיות ראשוני HCC וxenografts, אשר בדרך כלל לבצע פחות וחסונה יותר משורות תאי HCC האנושי המבוססות היטב כי נמצא בשימוש נרחב ומצוטטות לעתים קרובות בספרות. בהשוואה לשורות תאים, אנו דנים גורמים אשר עשוי לתרום לסיכוי הנמוך יחסית של engraftment HCC העיקרי במודלי xenotransplantation ולהגיב על בעיות טכניות שעלולות להשפיע על קינטיקה של צמיחת xenograft. אנחנו גם מציעים שיטות שיש ליישם כדי להבטיח שxenografts השיגה במדויק דומה רקמות HCC הורה.
Introduction
קרצינומה hepatocellular (HCC) היא הסרטן החמישי הנפוץ ביותר בעולם והסיבה הכי בקצב המואץ למוות מסרטן בצפון אמריקה. גורם הסיכון הנפוץ ביותר עבור HCC הוא שחמת כבד, בתדירות הגבוהה ביותר מתרחש עקב דלקת כבד כרונית נגיפית, שימוש לרעה באלכוהול, מחלות אוטואימוניות, או הפרעות מטבוליות תורשתיות 1.
למרות נטל מחלת הכבד שהוטל על ידי HCC על אוכלוסיות ברחבי העולם, הפתופיזיולוגיה של HCC מובנת יחסית גרוע בהשוואה לסוגי סרטן שכיח אחרים כגון מעי גס, שד, או סרטן הערמונית. לדוגמא, אירועים מולקולריים ותאיים ספציפיים נהיגה tumorigenesis להישאר להיות מוגדרים 2 באופן ברור. כמו רוב סוגי סרטן אפיתל מוצקים אחרים, גישות הגנומי חשפו את ההטרוגניות בסטיות קשורות עם HCC 3. מספר המחקרים גילו פעילות מסודרות של מגוון רחב של מסלולי איתות מעורבים בהתפשטות תאים, survival, בידול ואנגיוגנזה 4. בנוסף, תפקידם של תאי גזע סרטני בpathobiology HCC נשאר להתברר 5.
עם הבנה מוגבלת של הפתופיזיולוגיה HCC, בארסנל של טיפולים יעילים לHCC גם נשאר מוגבל יחסית. חולים בשלב מוקדם, עם גידולים מוגבלים לכבד הם מועמדים לטיפול מרפא באמצעות אבלציה גידול או כריתה כירורגית, אם כי ההישנות היא שכיחה. עבור חולים עם מחלה מתקדמת יותר, כימותרפיה והקרנות הם בעלי יעילות מוגבלת ומשמשים בעיקר לבקרת מחלות בכוונה פליאטיבי 6.
באיכות גבוהה במודלי ניסויי vivo של HCC האנושי ובכך מספקת פלטפורמה רבת ערך למחקר בסיסי נחוץ להפתופיזיולוגיה של HCC האנושי, כמו גם להערכה של גישות טיפוליות חדשניות. בהשוואה לשימוש בשורות תאים או מודלים עכבר מוגדרים מאוד, xenografts של פריגידולים אנושיים בעכברים עם מערכת חיסון חלשים מרי צמחו ככלים רבי ערך למחקרים מסוג זה שכן הם מסוגלים משחזרים מחלות של בני אדם עם נאמנות גבוהה גם בעת לכידת הטרוגניות שקיימת בתוך ובין חולים השונים 7,8. לשם כך, פיתחנו מגוון רחב של שיטות להקמת xenografts HCC האנושית בעכברים עם מערכת חיסון חלש. בעוד שרוב המחקרים שפורסמו מעורבים xenografts HCC לתאר את השימוש בשורות תאי HCC האנושי מבוססות היטב למטרה זו, אנו מתמקדים באופטימיזציה של מבחני שלנו כדי ליצור xenografts מדגימות HCC עיקריות מתקבלת מייד לאחר כריתה כירורגית של חולים.
טכניקות xenografting שונות עשויות להידרש למחקר יישומים שונים. לדוגמא, xenografts תת עורי שנוצרה מתוך שברי גידול נוצרות במהירות, נמצאת במעקב בקלות, ועשוי להיות מתאים יותר לממשל מקומי של הרפוי רומן עם נוחניטור של תגובת גידול. xenografts intrahepatic עשויה להיות רלוונטית יותר למחקרים הנוגעים לתפקידו של המיקרו בכבד בביולוגיה HCC. Xenografts שנוצרה מהשעיות תא גידול נחוצות לזיהוי והאפיון של תת תא ייזום גידול או לניסויים הדורשים במניפולציות מבחנה של תאים סרטניים לפני xenotransplantation. וכך פיתחנו ומאומתים הפרוטוקולים הבאים להקים תת עורית או xenografts intrahepatic מהשעיות תא או שברי גידול נבעו מדגימות HCC האנושי ראשוניות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
סקירה סכמטי של הפרוטוקול מוצגת באיור 1.
1. עיבוד של דוגמאות HCC האנושי
להשיג דגימות HCC האנושי ראשוניות בהסכמת מטופל בכתב ובאישור של ועדת האתיקה במחקר המוסדית. פרוטוקולים אלה בוצעו במוסד שלנו עם אישור מרשת הבריאות באוניברסיטת מחקר האתיקה המועצה בהתאם לכל הנחיות מוסדיות, לאומיים ובינלאומיות לרווחת אדם.
לאסוף דגימות HCC טריות בהקדם האפשרי לאחר ההליך כירורגי דגימות פעם אחת מתאימות ננקטו לצורך קליני. באופן אידיאלי זה אמור להתרחש בתוך 30 דקות לאחר הסרת הרקמה מהמטופל. כפי שמודגם באיור 2, מדגם של לפחות 1 סנטימטר 3 המתקבל מהפריפריה של הגידול הוא אופטימלי, שכן החלק מהגידול המרכזי עשוי להיות נמקים.גידולים שלא קיבלו כל טיפול לפני כריתה כגון קרינה, כימותרפיה, או אבלציה עדיפים על מנת למקסם את הסיכוי שתאים סרטניים הם בת קיימא. ידית רקמות אנושיות ראשוניות בהתאם לפרוטוקולי מגן אישיים סטנדרטיים לחומר ביולוגי מסוכן. לבצע את כל המניפולציות במעבדה של רקמות גידול והכנות תא בארון בטיחות ביולוגית בכיתה השנייה תוך שימוש בטכניקות מזוהמות.
- מניחים את מדגם HCC הטרי ב10-25 מיליליטר F12 של Dulbecco סרום ללא שינוי הנשר בינוני / של חזיר על 4 מעלות צלזיוס ולהעביר על קרח למעבדה לעיבוד והכנה של שברים ו / או תאי רקמות לxenografting לעכברים מיידיים.
- בעזרת מלקחיים סטריליות, למקם את מדגם הגידול בx 20 מ"מ צלחת פטרי 100 מ"מ או משטח עבודה אחר מתאים סטרילי. מחלקים את מדגם גידול לרסיסים של כ 2-3 מ"מ 3 באמצעות סכין אזמל כירורגי No.10. בשלב זה, לשקול Snap-הקפאה או של תיקון פורמליןשתי ברי גידול לניסויים אחרים או ניתוחים כנדרש.
- לxenografting של שברי גידול, למקם כמה שברי HCC לתוך צינורות microcentrifuge אחד או יותר המכילים מספיק Matrigel לאפשר לברים להישאר מתחת למים. שמור על צינורות אלה על קרח.
- להכנת תרחיף תאים סרטניים, השתמש בלהב סכין המנתחים כירורגית כדי לקצץ את רקמת HCC שנותר ככל האפשר ולערבב עם 5-10 מיליליטר של DMEM-F12 בצינור חרוטי 50 מיליליטר תלוי בנפח של הרקמה הטחון.
- הוספת סוג IV collagenase וdispase השני בריכוזים סופיים של 200 יחידות / מיליליטר ו0.8 יחידות / בהתאמה מ"ל. פיפטה את התערובת למעלה ולמטה גם באמצעות פיפטה 25 מיליליטר.
- לאטום צינור דגירה את התערובת משלב 1.6 על 37 מעלות צלזיוס ב5% חממת פחמן דו חמצני ל30-60 דקות בהתאם לרכות של רקמת הגידול. פיפטה את התערובת למעלה ולמטה כמה פעמים כל 10 דקות כדי להעריך את ההתקדמות של עיכול אנזימטי.
- לאחר diGestion הושלם, להעביר את פתרון הגידול דרך מסננת 100 תא מיקרומטר. בעדינות מועך את הרקמות שנותרו במסננת התא באמצעות פיפטה קצה 25 מיליליטר כדי לאפשר למספר המרבי של תאים סרטניים לעבור. אסוף את ההשעיה התא המתוחה בצינור חרוטי 15 מיליליטר.
- צנטריפוגה ההשעיה תא הגידול ב1,200 סל"ד במשך 5 דקות ב 4 ° C.
- בעדינות למזוג supernatant. בהתאם לגודל של גלולה, להוסיף 2-5 מיליליטר של תאי דם אדומים 1x הקר כקרח (RBC) תמוגה חיץ ופיפטה בעדינות מעלה ומטה כדי resuspend את הכדור. שמור על קרח למשך 5 דקות.
- הוספת DMEM-F12 בהיקף כולל של 15 מיליליטר ו צנטריפוגות ב 1,000 סל"ד במשך 5 דקות ב 4 ° C כדי לשטוף את מאגר תמוגה RBC.
- בעדינות למזוג supernatant ו resuspend תא גלולה גידול RBC-החופשי בDMEM-F12.
- ספירת תאי קיימא באמצעות הרחקת trypan כחולה באופן ידני או עם דלפק תא אוטומטי.
- aliquots תאים סרטניים צנטריפוגה המכילים את numbe הרצויr של תאים להזרקה כפי שתואר לעיל, resuspend את הכדור וכתוצאה מכך התא ב30 μl של Matrigel קר כקרח, ולאחסן על קרח.
אופציונאלי: לאחר שלב 1.11, אנו ימוצה באופן שיגרתי CD45 + תאים אנושיים (לויקוציטים) מהשעית תא גידול בתפוצה רחבה ו / או לטהר תת קבוצות של תאים סרטניים באמצעות cytometry זרימה או חרוזים immunomagnetic. פרוטוקולים מפורטים לטכניקות אלו מתוארים היטב על ידי היצרנים של נוגדנים הרלוונטיים, חרוזים, וזרימת cytometers.
הערה: הפרוטוקול שתואר לעיל יכול לשמש גם כדי לעבד xenografts גידול האדם נבצר מעכברים על מנת לבצע השתלת סדרתי, החלפת רקמת xenograft לרקמות HCC האנושי ראשוניות בשלב 1.1. במצב זה, לאחר שלב 1.11, אנחנו באופן שיגרתי לרוק חדירת תאים עכבריים מהשעית התא באמצעות נוגדן כנגד אנטיגן histocompatibility העכבר H2K.
2.Xenografting
לנהל את כל הליכים בבעלי החיים בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים המוסדי. ההליכים המתוארים במסמך זה הושלמו בשימוש בבעלי החיים לפרוטוקול ספציפי שאושר על ידי ועדת הטיפול בבעלי חיים ברשת בריאות באוניברסיטה בהתאם ועמידה בכל סוכנויות הרלוונטיות הרגולציה ומוסדיות, תקנות והנחיות.
מכשור לאספקה של חומרי הרדמה נדיפים שאיפה לבעלי חיים קטנים צריך להיות מנוצל על פי נהלי הפעלה סטנדרטיים של מתקן בעלי החיים ומכון מחקר. לבצע את כל ההליכים כירורגיים באמצעות טכניקת aseptic וכלים סטריליים בארון בטיחות ביולוגי בכיתה השנייה. לנצל כשל חיסוני חמור סוכרתי שאינה סובל מהשמנת יתר בשילוב (NOD / SCID) או NOD SCID / אינטרלוקין 2 null שרשרת גאמא קולט זנים / (NSG) של עכברים משני מינים ב6-8 שבועות של גיל (המעבדה ג'קסון, בר הרבור, ME) 9,10. אלהעכברים חייבים להיות מאוחסנים ונשמרו במתקן מסוגל לספק תנאי הפתוגן ללא מתאימים לבעלי חיים עם מערכת חיסון חלש.
הכן את העכברים לניתוח בתא אספקת 5% (v / v) Isoflurane בשאיפה ב1 ליטר / דקה של חמצן. לשמור על הרדמה עד שיש אובדן של רפלקס קרני ובוהן בבעלי החיים (ים). לxenografting תת עורית, לגלח אזורים קטנים אחד או יותר על dorsum של החיה (ים) ולנקות את העור עם 70% אתנול. לxenografting intrahepatic, לגלח את החזה והבטן הגחון של החיה (ים) מהשחי למטה לאזור המפשעה ולנקות את העור עם 70% אתנול.
2.1 השרשה תת עורי של שברי גידול
- מניחים את העכבר המורדם נוטה, שמירה על ההרדמה שאיפת Isoflurane (2% (v / v) ב1 ליטר / דקה O 2) עם שופר. החל Tear-ג'ל כדי להגן על העיניים של בעל החיים מפגיעה טראומטית.
- לחטא את אזור הגב המגולח (ים) עם פולידיןלקרצף כירורגית אחרי 70% אתנול ולבסוף עם פתרון povidone-יוד.
- לעשות חתך בעור 5 מ"מ באמצעות מספריים חדים סטרילי.
- הכנס מספריים קהים סגרו בעדינות לתוך החלל תת עורי והתפשט בעדינות לפתח כיס גדול מספיק כדי להכיל שבר גידול.
- הכנס את בר הגידול מוכן בשלב 1.3 לכיס תת עורית באמצעות מלקחיים בסדר סטרילי.
- לסגור את החתך בעור באמצעות תפרים או קליפים.
- לספק טיפול לאחר ניתוח לעכבר כמתואר להלן.
2.2 הזרקה תת עורית של תאים סרטניים
- הכן את בעלי החיים כפי שמתואר בשלבי 2.1.1 ו 2.1.2.
- טען את ההשעיה של תאים סרטניים בMatrigel מוכן בשלב 1.13 לתוך מזרק אינסולין עם 29 G 1/2 במחט.
- הכנס את המחט לתוך החלל תת עורי ולפרוק את תכולת המזרק. קידום מספר מילימטרים המחט במישור תת עורי משם frאום אתר ניקור העור מונע דליפה של ההשעיה התאים הסרטניים מחוץ לאתר לנקב עם נסיגה של המחט.
- לספק טיפול לאחר ניתוח לעכבר כמתואר להלן.
2.3 השרשה intrahepatic של שברי גידול
- שימוש 27 G 1/2 במחט במזרק 1 מיליליטר, לנהל 350 μl של תת עורי תמיסת מלח הרגיל סטרילי בdorsum של צווארו של בעל החיים המורדמים, כדי לפצות על הפסדי נוזלים במהלך ניתוח. לשיכוך כאבים, לנהל 350 μl של עצירות סטרילי הנורמלית מלח המכיל (0.1 מ"ג / קילוגרם) תת עורי באגף של בעלי החיים, באמצעות מחט 1/2-in 27 G במזרק 1 מיליליטר.
- הנח את פרקדן העכבר על משטח מחומם מראש עם האף והפה ממוקם בתוך השופר, כדי לספק תחזוקת הרדמה שאיפת Isoflurane (2% (v / v) ב1 ליטר / דקת O 2).
- להאריך את הגפיים ולאבטח אותם עם קלטת למשטח ההפעלה כדי לייעל את החשיפה שלבטן הגחון ובית החזה.
- בצע את ההליך תחת מנורת מגדלת כדי לייעל את ההדמיה.
- לעקר את העור המגולח בבטן ובבית החזה הגחון עם לקרצף כירורגית פולידין ואחרי 70% אתנול ולבסוף עם פתרון povidone-יוד.
- בעזרת מספריים חדים סטרילי, לעשות חתך בעור רוחבי בין שתי המדינות subcostal ולחלק את שכבות השרירים להיכנס לחלל הצפק כדי לאפשר חשיפה נאותה של כל הכבד.
- הנח תפר בעור מעל לתהליך xiphoid ולאבטח אותו לשופר עם קלטת על מנת לאפשר חשיפה טובה יותר של הכבד ומבנים סמוכים.
- השתמש בשני אפליקטורים כותנה שקצה סמוכים ואחורית אל הכבד כדי לייצב אותו.
- עושה חתך באורך 3 מ"מ ועומק על פני השטח של הכבד באמצעות להב אזמל סטרילי מס '10.
- מייד להחיל Surgicel ולחץ עדין לאתר החתך כדי להשיג עצירת דימום; להסיר אחרי 60-90 שניותולהמשיך רק אם עצירת דימום מוחלטת הושגה.
- הנח צעד שבר גידול 1.3 לתוך חתך הכבד עם מלקחיים בסדר סטרילי או עם מחט 18 G.
- החל חתיכה קטנה של Surgicel על החתך הכבד כדי למנוע תזוזה של שבר הגידול ולהבטיח עצירת דימום מתמשכת.
- סגירת החתך עם תפרים או קליפים.
- לספק טיפול לאחר ניתוח כמתואר להלן
2.4 השרשה intrahepatic של תאים סרטניים באמצעות הזרקה ישירה לתוך הכבד
- הכן את העכבר כמתואר ב2.3.1 שלבי 2.3.7 לעיל.
- טען את ההשעיה התא הסרטני (מוכן בשלב 1.13) לתוך מזרק אינסולין באמצעות 29 G 1/2 במחט.
- עם הכבד התייצב באמצעות מטוש צמר גפן-קצה, להכניס את מחט מזרק האינסולין לתוך הכבד ולקדם את הקצה כמה מילימטרים מעבר לאתר לנקב לאורך מטוס subcapsular.
- בעדינות לפרוק את תכולת המזרק ולאתרנגולת להסיר את המחט מהכבד.
- Surgicel מקום על האתר לנקב והפעיל לחץ עדין עם המוליך כותנה שקצה כדי למנוע דליפה של ההשעיה התא הסרטני וכדי להשיג עצירת דימום מוחלטת.
- סגירת החתך עם תפרים או קליפים ולספק טיפול שלאחר ניתוח, כמתואר להלן.
2.5 Xenografting intrahepatic של תאים סרטניים באמצעות הזרקה לתוך הטחול
- הכן את העכבר כמתואר ב2.3.1 צעדים ל2.3.5 לעיל.
- בעזרת מספריים חדים סטרילי, לעשות 1 סנטימטר עזב חתך subcostal להיכנס לחלל הצפק.
- השתמש המוליך כותנה שקצה על מנת לשקף את הבטן cranially ולצד ימינו של בעל החיים במטרה לחשוף את הטחול.
- על ידי טיפול ברקמות שומן מסביב עם מלקחיים atraumatic בסדר סטרילי, לספק את הטחול לתוך החתך ומקום המוליך כותנה שקצה מאחורי הטחול כדי לייצב אותו.
- באמצעות 5-0 תפר משי, מקוםקשר רופף קשור מראש סביב הטחול מעל הקוטב התחתון.
- טען את ההשעיה התא הסרטני (מוכן בשלב 1.13) לתוך מזרק אינסולין באמצעות 29 G 1/2 במחט.
- הכנס את מחט מזרק האינסולין לקוטב התחתון של הטחול ולקדם את זה בעבר ברמה של הקשר קשור מראש הרופף.
- לאט לפרוק את תכולת המזרק, להוציא את המחט מהטחול, ולהדק את הקשר כדי למנוע כל דליפה של ההשעיה התא הסרטני המוזרק.
- החלף את הטחול לתוך חלל הצפק.
- סגירת החתך עם תפרים או קליפים ולספק טיפול שלאחר ניתוח, כמתואר להלן.
2.6 כריתה חלקית כדי להקל על קליטתם intrahepatic של רקמת גידול אדם
- הכן את העכבר כמתואר ב2.3.1 צעדים ל2.3.7.
- עם מספריים חדים סטרילי, לחלק את רצועת falciform המצורפת לאונה החציוני של הכבד.
- באמצעות המוליך כותנה שקצה, לגייסהאונה השמאלית של קשר קשור מראש כבד ועמדה רופף של 5-0 תפר משי סביב האונה השמאלית. לקדם את הקשר הרופף הקרוב ככל האפשר לכיוון גבעול bilio וכלי דם של האונה השמאלית ולהדק את הקשר.
- בלו דיסטלי האונה השמאלי לקשירה באמצעות מספריים סטרילי, ומשאיר גדם קטן כדי למנוע החלקה של הקשר ודימום שלאחר מכן.
- שימוש בטכניקה דומה, לקשור ולכרות את רוב האונה החציוני של הכבד, הימנעות כיס המרה.
- השימוש Surgicel ולחץ עדין עם המוליך כותנה שקצה לאורך פני שטח החתך של parenchyma הכבד כדי להשיג עצירת דימום מוחלטת.
- לxenografting intrahepatic של שבר או גידול תאים סרטניים, להמשיך בצעדים 2.3.8 ל2.3.11 או 2.4.2 ל2.4.5 כפי שתואר לעיל.
- לxenografting intrahepatic של תאים סרטניים באמצעות הזרקת הטחול, לנצל אפליקטורים כותנה שקצהו כדי לשקף בעדינות את הבטן cranially ולצד ימינו של בעל החיים, exposing הטחול. להמשיך עם צעדים 2.5.4 ל2.5.9 כפי שתואר לעיל.
- סגירת החתך עם תפרים או קליפים ולספק טיפול שלאחר ניתוח, כמתואר להלן.
טיפול לאחר ניתוח 2.7
- הסר את העכבר משופר ההרדמה שהאיפה.
- מניחים את העכבר בכלוב תחת מנורת חום למשך כ 20 דקות עד שהתאושש מהרדמה וגיוס באופן מלא.
- חזור על מינון עצירות כל שעות 8-12 במהלך 2-3 הימים לאחר הניתוח הראשון.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 3 מדגים את המראה האופייני של xenograft HCC האנושי תת עורי ואת מראה histopathological המקביל של הגידול. ההתפתחות והצמיחה של xenografts תת עורית ניתן לפקח בקלות על ידי בחינה יומית של עכברי נמען. מרווח הזמן בין xenografting ופיתוח של גידול עשוי להשתנות במידה רבה בהתאם לסוג של רקמה (שבר גידול לעומת השעיה תא), המקור של רקמות (מדגם עיקרי מטופל, xenograft passaged, או שורת תאים), והכמות של רקמה המושתלת ( מספר התאים או בגודל של שבר גידול). לדוגמא, xenografts הגדולה עלולה להתפתח מההזרקה של 5 x 10 6 תאים של שורת תאי HCC מבוססת היטב בתוך 1-2 שבועות, בעוד 6 חודשים עשויים להידרש לפיתוח xenograft דומה מ1 x 10 5 תאים המתקבלים ממדגם HCC החולה ראשוני. אנחנו לא נצפו היווצרות xenograft תת עורית יאוחר מ -6 חודשים לאחר implantation של מדגם הגידול, ובכך להקריב את עכברי נמען בtimepoint זה אם xenografts לא פיתחה.
איור 4 מדגים את ההופעה הטיפוסית של xenografts HCC האנושי intrahepatic השיגה מהשתלה ישירה של רקמת גידול בכבד, כמו גם אלה שהושגו מהזרקה של תאים סרטניים לתוך הטחול. xenografts intrahepatic לא ניתן לאתרם בקלות על ידי בדיקה גופנית כללית של עכבר הנמען, אלא אם הגידול הוא גדול מאוד, או שהביא לפיתוח של מיימת או נפיחות בבטן. למרות ששיטות הדמיה של בעלי החיים קטנות כגון סריקת CT זמינות בכמה מכוני מחקר ויכולות להיות מנוצל כדי לחקור את הכבד של עכברי נמען 11 מדויק, אנחנו לא רואים את זה בגישה נרחבת ישימה, מעשית, או חסכונית עבור רוב החוקרים. ראינו כי בקצב שבי xenografts intrahepatic לפתח דומה לקצב שבו subcutaneoשלנו xenografts לפתח, והוא מושפע באופן דומה על ידי משתנה כגון הסוג, מקור, וכמות של רקמה המושתלת. בהתבסס על הביצועים של xenografts תת עורית הנגזרת מאותה רקמת הורה לזה המשמש לxenografts intrahepatic, אנו בוחרים timepoint להקרבה של עכבר הנמען והבדיקה של הכבד, אלא אם כן הוכחה ברורה של גידול intrahepatic גדול קיימת לפני זה. יש לנו ציינו כי התוספת של כריתה חלקית להליך xenografting intrahepatic משמש משפרת את ההסתברות להשגת קליטתם של רקמה הסרטני אנושית בכבד העכבר, אבל לא נראה שזה להאיץ את קצב צמיחת xenograft.
טבלת 1 מסכמת את שיעורי engraftment גידול הושגו לאחר ההשתלה של רקמות HCC האנושי ראשוניות בעכברים עם מערכת חיסון חלשים תוך שימוש בטכניקות השונות שתוארו בפרוטוקול זה. לכל אחת משיטות השתלה, המכנה של שיעור מיצוי הגידול משקפת זמזום ייחודי מדגם HCC. נתונים אלה מראים כי, לרקמות HCC האנושי ראשוניות, שיעורי engraftment תת עורית נחותים לשיעורי engraftment intrahepatic מושגת על ידי הזרקת תאים הסרטניים intrasplenic או השתלת שבר גידול intrahepatic, וכי כריתה חלקית מופיעה כדי לשפר את קליטתם intrahepatic. אמנם יש לנו מנוצלים בהצלחה הזרקה ישירה לתוך תא כבד העכבר כדי ליצור xenografts intrahepatic מהקווים מבוססים היטב אדם HCC תא (מידע לא מוצג), יש לנו לא נוצר כל xenografts intrahepatic בשיטה זו באמצעות דגימות HCC אנושיות ראשוני, למרות השימוש בכריתה חלקית .
איור 1. סקירה סכמטי של פרוטוקול הממחיש את זרימת עבודה לעיבוד והכנת מדגם HCC, כמו גם האפשרויות הבאות xenografting (הבלעה).
544fig2.jpg "/>
איור 2. דגימת כריתת כבד ממטופל עם קרצינומה hepatocellular. חולה זה לא קיבל כל טיפול משלים לגידול. התיבה הלבנה מצביעה על חלק מעשי של הגידול ליד בפריפריה אשר התקבלה לxenografting. סרגל קנה מידה בצד ימין למעלה מתאים ל1 סנטימטר.
איור 3. C xenograft קרצינומה hepatocellular אדם נוצרה מההזרקה תת עורית של תאים סרטניים.) הגידול יכול להיות מוערך בקלות באגף ימין של בעלי חיים. ב ') הגידול נתפסת להיות שונים מהרקמות הסובבות אחרי הקרבת בעלי החיים.) היסטולוגיה של הגידול מדגימה תכונות אופייניות של קרצינומה hepatocellular, כוללים תאים כמו הפטוציט-עם atypia הגרעיני ויחס גרעיני לcytoplasmic גבוה, העדר שטחי פורטל, וdisttrabeculae orted עם עובי מוגבר של צלחות hepatocellular. סרגל קנה מידה מתאים ל1 סנטימטר בפנלים A ו-B, ובC פנל 100 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה.
איור 4. xenografts קרצינומה hepatocellular אדם intrahepatic. xenograft) שנוצרה מהשתלה של שבר גידול אנושי בכבד העכבר. גידול intraparenchymal מצויינים על ידי חץ שחור. בקנה מידה של סרגל בחלק תחתון של תצלום בxenograft סנטימטר. ב ') שנוצרה מהזרקה של תאים סרטניים אנושיים בטחול העכבר הבא כריתה חלקית. גידול intraparenchymal מצויינים על ידי חץ שחור. סרגל קנה מידה מתאים ל1 סנטימטר. סעיף היסטולוגיה C) דרך מרווח של demonstrat xenograft intrahepaticing תכונות אופייניות של קרצינומה של אדם hepatocellular (מימין למטה) וכבד עכבר נורמלי סמוך (למעלה משמאל). סרגל קנה מידה מתאים ל100 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה.
| אתר השתלה | שיטת השתלה | שיעור מיצוי גידול |
| תת עורי | השעיה תא | 6/55 (10.9%) |
| בר גידול | 23/136 (16.9%) | |
| טחול | השעיה תא | 3/15 (20%) * |
| השעיה תא + כריתה חלקית | 6/14 (42.9%) * | |
| כבד | בר גידול | 6/13 (46.2%) |
| בר גידול + כריתה חלקית 2/3 (66.7%) | ||
| השעיה תא | לא בוצע | |
| השעיה תא + כריתה חלקית | 0/8 (0%) | |
| * חלקן של דגימות שהניבו גושי גידול intrahepatic | ||
טבלת 1. שיעורי אנוש HCC engraftment בעכברים עם מערכת חיסון חלשים המתאימים לטכניקות השתלה שונות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
יש לנו תארנו מגוון של טכניקות כדי להקים תת עורי וxenografts HCC האנושי בעכברים עם מערכת חיסון חלשים intrahepatic שיכול להיות מיושמים על מגוון רחב של שאלות ומבחנים ניסיוניים. בעוד xenografts תת עורי הייתה בשימוש נרחב ללמוד היבטים שונים של הביולוגיה HCC, xenografts intrahepatic מתוארות בספרות רק לעתים נדירות. יתר על כן, רוב המחקרים המתארים את השימוש בxenografts יצרו אלה משורות תאים מבוססות היטב. בהתחשב במגבלות של שורות תאי סרטן בדוגמנות הביולוגיה גידול אנושית 12, היינו מוטיבציה כדי לאמת את הטכניקות שתוארו לעיל באמצעות רקמות HCC האנושי ראשוניות. למרות שאינו נתמך על ידי ניתוח סטטיסטי בשל גודל המדגם הקטן של קבוצות ניסוי, התצפיות שלנו באופן סובייקטיבי לחשוף מגמה משכנעת לקראת שיעורי קליטתם השתפרו עם התוספת של כריתה חלקית להשתלת intrahepatic של תאים סרטניים או שברים. </ P>
כמה מחקרים שקפדנות ניסו לנצל רקמות עיקריות השיגו engraftment תת עורית המוצלחת עם חלק קטן מאוד של דגימות המטופל השיגו 13-15. יש לנו גם ציינו כי חלקן של דגימות HCC אנושיות ראשוני שהצלחה נקלט במרחב תת עורית של עכברים עם מערכת חיסון חלש תוך שימוש בטכניקות שתוארו לעיל מוגבל לכ 15%. בכבד האדם, נגעי HCC הם hypervascular, מקבלים אספקת הדם שלהם בעיקר דרך 16,17 העורק הכבד. אנו משערים כי שיעור קליטתם הנמוך של רקמות HCC העיקריות שאנו ואחרים שנצפו עשוי להיות תוצאה של הפגיעות של רקמות HCC טריות להיפוקסיה היחסית של microenvironment שלתוכו הם xenografted, ללא אספקת עורקים הוקמה. הרגישות של רקמות HCC לנימק איסכמי מהיר בפרק הזמן שבין כריתה וxenografting כירורגית עשויה גם AccouNT לקצב קליטתם הנמוכה שהושג בעכברים.
עבור הדור של xenografts HCC האנושי intrahepatic מהשעיות תא הסרטני, מצאנו כי הזרקה של תאים לתוך הטחול היא גישה נוחה מבחינה טכנית, כי תוצאות בשיעורים מעולים של engraftment כבד מדגימות HCC האנושי ראשוני. הטחול הוא מבנה vascularized ביותר, אשר עשוי לשפר את תמיכת תאי HCC בהשוואה לאתרים אחרים בגוף העכבר, ושממנו התאים סרטניים מופיעים לנסוע בקלות לתוך הכבד דרך ורידי הטחול ופורטל. בהשוואה לparenchyma הכבד, שלתוכו הוא קשה מבחינה טכנית להזריק ישירות תאים ללא דליפה או דימום, יש לו את הטחול את היכולת המבנית כדי להתאים את עוצמת הקול של ההשעיה התא שהוא מוזרק, וניתן ligated בקלות ברגע הזרקת התאים הסרטניים הושלם. הזרקה של השעיות תא ישירות לתוך וריד השער או העורק כבד בעכברי 6-8 בשבוע שישנים היא לא מבחינה טכנית FeAsible.
יש לנו מנוצלים כריתה חלקית בעכברי נמען כדי להקל על קליטתם intrahepatic של רקמות HCC אנושיות. למרות שמודלי עכבר של כריתה החלקית היו בשימוש נרחב כדי ללמוד את הביולוגיה של התחדשות כבד 18, אנחנו לא מודעים לכל דיווחים המתארים אותו בשילוב עם xenotransplantation גידול intrahepatic. מאז התחדשות כבד מתרחשת במהירות בתוך כמה הימים הראשונים שלאחר כריתה חלקית, שהערכנו כי הביטוי המוגבר של גירויי mitogenic וangiogenic בתוך parenchyma הכבד הייתי טוב יותר לתמוך בקליטתם ושגשוגם של רקמה פגיעה גידול אנושי או תאים מושתלים בתוך את החלק הנותר של כבד העכבר, בהשוואה לכבד עכבר במצבו "מנוחה" 19. בבני אדם, גורם הסיכון הגדול ביותר להתפתחות HCC הוא מתקדם פיברוזיס בכבד או שחמת הכבד, המתאפיין בפיתוח של לא רגנרטיבית לא מאורגןdules, ואשר כבר נתפסת על ידי חלק כמצב של פגיעה בכבד כרונית והתחדשות 20. הטכניקות שיש לנו הפגנו לנקלטים רקמות HCC אנושיות לתוך כבד העכבר על ידי הפעלת התחדשות כבד עשויות להיות מודל יקר ערך על מנת לאפשר חקירת התפקיד של microenvironment הכבד ומנגנוני התחדשות כבד בפתופיזיולוגיה של HCC.
בעוד הטכניקות המתוארות במסמך זה הן מסוגלת לייצר xenografts HCC האנושי ראשונית באיכות גבוהה בעכברים עם מערכת חיסון חלש, חוקרים שוקלים את השימוש בפרוטוקולים אלה יש לקחת בחשבון מספר מגבלות של המודל. ראשית, הפרוטוקולים שלנו לשלב עיכוב מינימאלי בין כריתה כירורגית של רקמה חולה והעיבוד הבא שלה במעבדה, ובכל זאת השיג שיעורי קליטתם גבוהים נשאר אתגר, זה מצביע על כך שיישום מעשי של טכניקות אלה דורש קרבה של אתר אוסף רקמות מטופלמעבדה, או תשתית שיכול למזער את העיכובים בהעברת דגימות טריות. שנית, ניתוחי intraabdominal מורכבים על 6-8 עכברים עם מערכת חיסון חלש ישנים בשבוע שחייבים להתבצע על ידי אנשים שהוכשרו כראוי על מנת להשיג את הישרדותם של בעלי החיים במשך כמה חודשים לפני xenografts יוצרת; נהלים אלה וטיפול בבעלי חיים שלאחר מכן שניהם זמן והמשאבים אינטנסיביים. שלישית, ההתפתחות וההתקדמות של xenografts intrahepatic לא יכולים להיות במעקב בקלות מבלי להקריב בעלי חיים בנקודתי זמן שנקבע מראש, להגביל את השירות של xenografts במיקום זה עבור סוגים מסוימים של מבחני כפי שתואר לעיל. בנוסף, xenografts intrahepatic נגזרת מהזרקה של תאים לתוך הטחול עשויה להציג גושים מרובים כפזורים ברחבי parenchyma הכבד שקשה לכמת באופן מדויק במונחים של סך נטל גידול. לבסוף, חשוב לציין כי גושים הסרטניים intrahepatic כתוצאה מההזרקה של תאים לתוך הטחול יכולים לבחורively משקף אוכלוסיות מסוימות של תאים המסוגלים הגירה מהטחול לייזום הכבד וגידול שלאחר מכן.
בעת יצירת xenografts מרקמות HCC האנושי ראשוניות, חשוב גם כדי לוודא שxenografts התוצאה דומה HCC. אנחנו הוכיחו בעבר כי לימפומה בטעות יכולה להתפתח מלויקוציטים נוסע בתוך רקמות HCC האנושי xenotransplanted 21. כך אנו לרוקן באופן שגרתי CD45 + leukocytes אדם מהשעיות תא גידול ראשוניים ולנצל RT-PCR, cytometry זרימה, הערכת histopathological, ואימונוהיסטוכימיה לassay xenografts למאפיינים טיפוסיים של HCC. כאשר passaging xenografts הוקמה למחקרים נוספים, צריכים גם להיות מדולדלים תאים עכבריים גידולי הסתננות באמצעות נוגדן כנגד אנטיגן histocompatibility העכבר H2K. אם יישום המחקר כרוך בשימוש שבברי גידול או המדידה של צמיחת xenograft, הניתוח של xenograFTS בנקודת סיום המחקר צריך לכלול הערכה של המידה שבה הגידולים שחדר על ידי כדוריות דם לבנות אדם ותאי עכבר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מכון קנדי לבריאות מחקר שלב 1 המטפל-פרס מדען (AG) ושל גרנט תפעולי מהאגודה לחקר הסרטן (AG). המחברים מודים לד"ר ג'ון דיק לתמיכה בפרויקט זה שלו.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Mod. Eagle Medium/Ham’s F12 50/50 Mix x1(DMEM-F12) | WISENT Bioproducts | 319-075-CL | |
| Collagenase TypeIV | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| Dispase II | Stemcell Technologies | 7923 | |
| Matrigel Matrix | Becton-Dickinson Biosciences | 354234 | |
| 10 % Buffered Formalin solution | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| 0.9 % Saline Solution (NaCl), sterile | House Brand | 1011-L8001 | |
| Betadine surgical scrub | Purdue Pharma | NPN 00158313 | |
| Buprenorphine (Temegesic) NR 0.3 mg/ml | Reckitt Benckiser | ||
| Isoflurane USP, 99.9 %, inhalation anesthetic | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | M60302 | |
| Tear-Gel | Novartis Pharmaceuticals | ||
| Frozen section compound | VWR | 95057-838 | |
| Cryomold, Tissue -Tek | Sakura Finetek | 4566 | |
| Precision Glide Needle 18G 1 ½ | Becton-Dickinson Biosciences | 305196 | |
| Precision Glide Needle 27G ½ | Becton-Dickinson Biosciences | 305109 | |
| Insulin syringe, 3/10 cc U-100, 29G½ | Becton-Dickinson Biosciences | 309301 | |
| Surgical blade No.10 | Feather Safety Razor Co. | 08-916-5A | |
| #5-0 Soft silk surgical suture, 3/8" taper point needle | Syneture | VS-880 | |
| Transpore surgical tape | 3M Health care | 1577-1 | |
| Cotton applicator | Medpro | 018-425 | |
| Surgicel, oxidized regenerated cellulose | Ethicon | 1951 | |
| Cell strainer 100 μm nylon | Becton-Dickinson Biosciences | 352360 | |
| Magnification lighting with mobile base | Benson medical Industries Inc. | model: RLM-CLT-120V | |
| Petridish sterile 100x20 mm | Sarstedt | 821474 | |
| Tissue forcep, 1x2 teeth, 4-1/2" | Almedic | A10-302 | |
| Adson dressing forcep 4-3/4" | Almedic | A10-220 | |
| Eye dressing forcep, serrated, straight, 4" | Almedic | A19-560 | |
| Hartman Hemostatic Forceps, curved, 3-1/2" | Almedic | A12-142 | |
| Iris scissor, curved, 4-1/4" | Almedic | A8-690 | |
| Iris scissor, straight, 4-1/2" | Almedic | A8-684 | |
| Olsen-Hegan needle driver, 5-1/2" | Almedic | A17-228 |
References
- El-Serag, H. B.
- Li, Y., Tang, Z. Y., Hou, J. X. Hepatocellular carcinoma: insight from animal models. Nat. Rev. Gastroenterol Hepatol. 9, 32-43 (2012).
- Tateishi, R., Omata, M. Hepatocellular carcinoma in 2011: Genomics in hepatocellular carcinoma--a big step forward. Nat. Rev. Gastroenterol Hepatol. 9, 69-70 (2012).
- Hoshida, Y., et al. Molecular classification and novel targets in hepatocellular carcinoma: recent advancements. Semin. Liver Dis. 30, 35-51 (2010).
- Ji, J., Wang, X. W. Clinical implications of cancer stem cell biology in hepatocellular carcinoma. Semin. Oncol. 39, 461-472 (2012).
- Villanueva, A., Hernandez-Gea, V., Llovet, J. M. Medical therapies for hepatocellular carcinoma: a critical view of the evidence. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. , (2012).
- Jin, K., et al. Patient-derived human tumour tissue xenografts in immunodeficient mice: a systematic review. Clin. Transl. Oncol. 12, 473-480 (2010).
- Sausville, E. A., Burger, A. M. Contributions of human tumor xenografts to anticancer drug development. Cancer Res. 66, 3351-3354 (2006).
- Shultz, L. D., et al. Multiple defects in innate and adaptive immunologic function in NOD/LtSz-scid mice. J. Immunol. 154, 180-191 (1995).
- Ohbo, K., et al. Modulation of hematopoiesis in mice with a truncated mutant of the interleukin-2 receptor gamma chain. Blood. 87, 956-967 (1996).
- Fiebig, T., et al. Three-dimensional in vivo imaging of the murine liver: a micro-computed tomography-based anatomical study. PLoS One. 7, e31179 (2012).
- Masters, J. R. Human cancer cell lines: fact and fantasy. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1, 233-236 (2000).
- Yamashita, T., et al. EpCAM-positive hepatocellular carcinoma cells are tumor-initiating cells with stem/progenitor cell features. Gastroenterology. 136, 1012-1024 (2009).
- Ma, S., et al. miR-130b Promotes CD133(+) liver tumor-initiating cell growth and self-renewal via tumor protein 53-induced nuclear protein 1. Cell Stem Cell. 7, 694-707 (2011).
- Yang, Z. F., et al. Significance of CD90+ cancer stem cells in human liver cancer. Cancer Cell. 13, 153-166 (2008).
- Park, Y. N., et al. Neoangiogenesis and sinusoidal "capillarization" in dysplastic nodules of the liver. Am. J. Surg. Pathol. 22, 656-662 (1998).
- Sigurdson, E. R., Ridge, J. A., Kemeny, N., Daly, J. M. Tumor and liver drug uptake following hepatic artery and portal vein infusion. J. Clin. Oncol. 5, 1836-1840 (1987).
- Mitchell, C., Willenbring, H. A reproducible and well-tolerated method for 2/3 partial hepatectomy in mice. Nat. Protoc. 3, 1167-1170 (2008).
- Michalopoulos, G. K. Liver regeneration after partial hepatectomy: critical analysis of mechanistic dilemmas. Am. J. Pathol. 176, 2-13 (2010).
- Zhang, D. Y., Friedman, S. L.
- Chen, K., Ahmed, S., Adeyi, O., Dick, J. E., Ghanekar, A. Human solid tumor xenografts in immunodeficient mice are vulnerable to lymphomagenesis associated with Epstein-Barr virus. PLoS One. 7, e39294 (2012).
