Summary
근섬유는 정상과 질병 상태 모두에서 중요한 생리 과정을 조절하는 위장관의 영향력 기질 세포이다. 우리는 마우스 및 시험 관내 실험에 이용 될 수있는 인간의 결장 조직 모두에서 일차 근육 섬유 모세포의 분리를 허용하는 기술을 설명한다.
Abstract
근섬유는 많은 GI 기능에서의 중요한 역할에 대해 상당한 관심을 얻고있다 위장관 (GI) 요로의 기질 세포이다. 여러 근섬유 세포 라인은 체외에서이 세포를 연구하기 위해 상업적으로 사용할 수 있지만, 실험 세포 배양 조건에 노출 된 세포주에서의 연구 결과는 작품의 지나치게 환원 주의적 성격으로 인해 고유의 제한이 있습니다. 일차 근육 섬유 모세포의 사용은 세포주에서 확인 실험 결과를 확인하는 점에서 큰 장점을 제공한다. 동물 모델에서 기본 근육 섬유 모세포의 분리는 더 밀접하게 질병 상태가 연구되고 모방 조건에서 근육 섬유 모세포의 연구를 위해 수 있습니다. 세포가 기저 질환을 가진 환자에서 직접 오기 때문에 인간의 대장 조직에서 기본 근육 섬유 모세포의 분리는, 틀림없이 가장 관련성이 실험 데이터를 제공합니다. 우리는 u가 될 수있는 잘 확립 된 기술을 설명마우스와 인간의 대장 조직 모두에서 기본 근육 섬유 모세포를 분리 tilized. 이 고립 된 세포는 피하 장 근육 섬유 모세포와 일치하는 알파 - 평활근 액틴과 vimentin에 양성하고, 최근 desmin 음수로 특성화되었다. 주요 근섬유 세포는 세포 배양에서 성장 및 통로 한정 이상의 실험 목적을 위해 사용될 수있다.
Introduction
위장관 기능의 조절은 점막층과 내부 간엽 간의 복잡한 동적 상호 작용을 수반한다. 이러한 상호 작용은 일반적으로 항상성을 유지하는 역할뿐만 아니라 병적 인 조건 1에서 질병 상태의 개발로 이어질 수 있습니다. 근육 섬유 모세포는 점막 재생, 수리 및 섬유증 2를 포함 중요한 위장관 프로세스의 수를 조절하는 세포 모집단을 둘러싼 주변 분비 방식으로 통신 상피 층 바로 아래에 위치 기질 세포의 모집단입니다.
그것이 시츄 근육 섬유 모세포의 차의 많은 특징을 공유하기 때문에 18Co 세포주 널리 근섬유의 기능을 연구하기 위해 사용되었다 인간 결장 근섬유 세포주의 예이다. 이러한 단백질 - 평활근 액틴의 발현 (α-SMA) 및 멘틴뿐만 아니라 수의 표현을 포함이러한 표피 성장 인자 수용체, 또는 라이 소포스 파티 딕산에 3,4위한 수용체로서 세포 표면 수용체. 때문에 이러한 공유 미세 구조 특성뿐만 아니라 생물학적 기능 소재 유사성 18Co 세포주는 염증성 장 질환 또는 대장 암 3,6 많은 질병 상태의 컨텍스트에서 근섬유의 기능을 연구하기 위해 광범위하게 사용되고있다. 그러나, 세포주를 사용하여 고유의 제한 문제가있다. 이러한 성장 속도와 다른 세포 집단의 상호 작용과 세포의 표현형과 생물학적 기능을 변경, 기본 세포에서 세포 라인을 차별화 시간에 유전자형 불안정이 (가) 있습니다. 세포주는 또한 그것의 사용에 큰 제한 사항입니다 GI 미시 (상피, 간질, 혈관 구성 요소)의 일반 구성 요소를 부족합니다. 따라서, 실험 세포주 연구에서 도출 된 결론은 RI를 줄이기 위해 더 검증이 필요합니다오해의 SK.
기본은 근육 섬유 모세포 세포주 7에서 식별 된 실험 결과를 확인하기 위해 인간 및 마우스 결장 조직으로부터 얻을 수있다. 이 방법은 원래 Mahida, 등. 8에 의해 설명하고, 우리의 프로토콜은 마우스와 인간의 대장 9에서 기본 근육 섬유 모세포를 분리하는 데 사용할 수있는 많은 잘 설명 된 기술 중 하나입니다. 결장 질환의 마우스 모델의 경우,이 기술들은 이웃하는 셀과 상호 작용하는 방법을 연구하거나 정상 또는 병리 GI가 10,11 처리 모두에 기여하는 주요 근육 섬유 모세포를 분리하기 위해 사용될 수있다. 이러한 기술은 면역 조직 치유, 섬유증, 및 결장 선종 및 암종의 개발 점막에 기여하는 방법을 연구하기 위해 이용 될 수있다. 주요 근육 섬유 모세포 또한 양성 (염증성 장 질환, 협착, 게실염) 또는 악성 C의 작동시 절제 한 인간 결장 조직으로부터 얻을 수있다onditions. 인간과 마우스 대장 조직에서 고립 된 차 세포는 세포 배양에서 성장 및 통로의 제한된 수에 활용 될 수있다.
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Protocol
1. 콜론 조직을 얻기
마우스
이론적 근거 및 연구의 목적을 자세히, 동물 실험을 수행 할 수있는 프로토콜 제출 및 동물 연구 감독의 우리의 기관 사무실에 의해 승인되었습니다.
- 자궁 경부 전위 다음에 흡입 이소 플루 란으로 마우스를 안락사.
- 복부 정중선 절개를 멀리 소장을 철회하고 콜론을 확인합니다. 옆으로 방광과 자궁 (있는 경우)를 후퇴와 치골을 식별하고 직장을 노출 미세 가위로 잘라.
- 대장의 떨어져 직장의 지느러미 장간막을 해부하고 항문에서 맹장에 콜론을 동원하고, 소장에서 대장을 분리를 절개.
- 얼음처럼 차가운 인산염 완충 생리 식염수 (PBS)의 표본을 놓습니다.
- 얼음처럼 차가운 PBS로 10 ML의 주사기를 입력하고 콜론 OPE를 절단 한 후, 그 내용을 취소 여러 번 루멘 콜론을 플러시N 길이 방향 가위를 사용.
- 얼음처럼 차가운 PBS의 20 ML을 포함하는 50 ML 원뿔 관에 콜론을 배치합니다. 콜론은 특정 방향으로 배치 할 필요가 없습니다. 유체가없는 입자상 물질을 취소 할 때까지 PBS를 대체하여 대장을 씻으십시오.
사람의
이 조직뿐만 아니라 잠재적 위험과 혜택에 대한 평가를 얻기의 중요성을 자세히 설명, 수술 환자의 인체 조직을 얻을 수있는 프로토콜을 제출하고, 인간 연구 보호 프로그램의 우리의 기관의 사무실에 의해 승인되었습니다.
- 대장 외과 의사와 연구 협력은 연구를위한 인간의 조직을 얻을 수있을 필요가있다. 인간의 대장 조직을 얻을 수있는 프로토콜 제출 및 기관 검토위원회의 승인을 받아야한다.
- 서면 동의서는 이전의 수술로 환자로부터 얻어진다.
- 의사는 스탠드에 결장 절제술을 수행합니다ARD 패션. 결장 환자에서 제거되면, 시료는 즉시 병리로 이동합니다. 병리학 적 평가를 위해 필요하지 대장 벽의 전층 섹션에서 0.5이 제공되며, 즉시 얼음처럼 차가운 PBS에 배치됩니다. 이 시료는 대장 장간막을 포함하지 않아야하고, 지방의 존재가 소화 과정에 영향을 미칠 것이기 때문에 epiploic 부속기는도 제거해야한다.
2. 상피 세포를 발가 벗기다
- 50 ML 원뿔 관에 HBSS 5 ㎜ EDTA (실온) 25 ㎖에서 전체 마우스의 결장을 품어. 15 분 동안 37 ° C의 동요 노천탕 (250 RPM)에서 원뿔 튜브를 놓습니다. 15 분 후, 조심스럽게 액체를 부어 5 ㎜ EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 25 ㎖로 튜브를 리필, 5 씻어 총 반복합니다. 인간의 콜론, 병리학에서 대장 벽의 ½ 인치 스트립을 획득 한 후 네 개의 동일한 크기의 조각으로 가위로 결장을 잘라. 한 50 ML 원뿔 튜브에 조각 두 개를 놓고별도의 50 ML 원뿔 관에 결장 조직의 나머지 두 조각을 배치합니다. 그런 상술 한 바와 같이, HBSS 5 ㎜ EDTA 25 ㎖로 배양 및 세척을 수행합니다.
- 얼음처럼 차가운 PBS의 20 ML에 두 번 콜론을 씻어.
- RPMI-5 20 ㎖, 디스 파제 10 U, 및 콜라게나 D 2000 U (실내 온도)를 포함하는 새로운 50 ML 원뿔 튜브에 마우스 대장 조직을 놓습니다. 인간의 대장 조직의 경우, 디스 파제와 콜라의 양의 두 배 (20 U의 디스 파제, 4000 U 콜라게나 D)를 사용합니다.
- (수평으로 배치하는 경우, 너무 많은 통기 및 세포 손상이) 수직 방향 37 ° C의 동요 노천탕에서 튜브를 놓습니다. 최대 60 분 동안 250 rpm으로 흔들어. 디스 파제 및 콜라게나 D에 노출 된 후, 대장 조직을 소화하기 시작하고 대장 조직 힘줄보고 시작합니다. 이것은 일반적으로 약 30 분 소요됩니다. 콜론이 모양이되면, 효소에서 콜론을 제거합니다.
- 조직을 파괴하기 위해 위아래로 2-4 회를 각각의 튜브를 흔들어. 피5 분 탁상 원심 분리기 (4 ℃)에서 200 XG에서 조직을 ellet. 조심스럽게 뜨는을 부어 버린다.
3. 근섬유의 분리 및 문화
- 10 ㎖의 ACK 용해 완충액 (47 ° C)를 첨가하여 각 펠렛을 재현 탁. 다시 원심 분리기 5 분 (4 ℃) 200 XG에서, 부어 상층 액을 버린다.
- 피펫으로 10 ㎖의 RPMI-5를 추가하여 각 펠렛을 재현 탁.
- 100 밀리 TC 처리 접시에 10 ㎖ 피펫을 사용하여 70 μm의 메쉬 스트레이너를 통해 세포 현탁액 (5 ㎖)의 절반을 전달합니다. 그런 다음 RPMI-5의 추가 15 ML을 추가합니다. 다른 100mm의 TC 처리 접시에 세포 현탁액의 나머지 5 ㎖로 반복합니다. 하나의 마우스 결장 따라서 두 개의 100mm의 TC 처리 된 요리를 얻을 것입니다. 인간의 대장 조직의 하나 ½ 인치 스트립은 네 개의 100 mm의 TC 처리 된 요리의 총을 얻을 것입니다.
- 37 ° C에서 10 % CO 2 배양기에서 조직 배양 접시를 놓고 배양 조건은 동일 F 아르또는 마우스와 인간의 기본 세포.
- 3 시간 후, 부드럽게 HBSS의 두 가지 변화에 비 부착 세포를 씻어. 파편 부동 부드럽게 씻어해야합니다. 부착 세포는 상피 세포, 대식 세포와 근육 섬유 모세포로 구성된다. 일주일 후 파종 만 분할을 근육 섬유 모세포, 대식 세포와 상피 세포는 첫 번째 통과 후 senesce. 신선한 RPMI-5를 추가하고 세포 배양에서 세포를 성장.
- 세포는 5 분 동안 트립신 처리하여 계대하고 2:1 분할됩니다.
약어
HBSS : 행크의 균형 소금 솔루션, RPMI-5 : 로즈웰 파크 기념 연구소 매체, ACK : 암모늄 - 염화 칼륨, FCS : 태아 혈청, TC 처리 : 조직 배양 처리
솔루션
ACK 용해 버퍼 - (4.15 g NH 4 망할 CIA, 0.5 g의 KHCO 3, 18.6 mg의 나 2 EDTA, 400 ML의 H 2 O, 1 N HCl로 7.2-7.4로 산도를 조정). 필터 steriliz전자에서 0.2 μm의 필터와 매장을 통해 4 ° C. RPMI-5 - (500 ㎖ 만드는 : 454.5 ML RPMI, 25 ㎖의 FCS, 5 ㎖ 200 밀리미터 L-글루타민, 5 ㎖ 1 M HEPES, 산도 7.4, 5 ㎖를 100 mM의 피루브산 나트륨, 5 ㎖ 100X 펜 연쇄상 구균, PBS 500 ㎖의 50 mM의 B-ME).
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Representative Results
일단 고립 된, 인간의 기본 근육 섬유 모세포는 세포 배양에서 재배하고 (유로 4까지) 통로의 제한된 수의를 통해 사용할 수 있습니다. 이 세포는 장 피하 근육 섬유 모세포 5,7와 일치 - 평활근 액틴과 vimentin에 긍정적 인 것으로 특징 및 최근 desmin 음 (그림 1A) 있습니다. 또한 특성 별 모양의 형태 (그림 1B)가있다. 주요 근육 섬유 모세포는 세포주에서 확인 실험 결과를 확인하기 위하여 사용될 수있다. 이 방법은 염증성 사이토 카인 TNF-α (10 NG / ML)은 EGF 수용체 발현의 상향 조절을 유도하고 이러한 세포 7 신호 있음을 입증하기 위해 이용되었다. 상향 조절 EGF 수용체 발현 및 신호는 처음에는 앞서 언급 한 인간의 대장 근섬유 세포 라인 18Co (그림 2)를 이용하여 발견되었다. 그림 2A, 우리는에 18Co 세포의 노출 보여 TNF을45; EGF 수용체 발현의 시간에 따른 증가를 이끌었다. 이는 이들 세포에서 강화 된 EGF에 의한 COX-2 발현과 p42/44 MAPK 인산화 (그림 2B)와 상관 관계. 이러한 실험 결과를 확인하기 위해 실험은 대장 암 환자의 수술 적 절제 대장에서 격리 인간의 기본 근육 섬유 모세포를 이용하여 반복 하였다. 도 2C 및 2D에 도시 된 바와 같이, 일차 인간 근육 섬유 모세포 밀접 초기 18Co 세포주 7에서 식별 된 실험 결과를 모방.
그림 1. 주요 근육 섬유 모세포는 인간의 대장 조직 7에서 분리 할 수 있습니다. 고립 된 일차 전지는 (지속적-SMA과 vimentin에 양성 (그림 1A)이다 근섬유와 같은 표현형을 보여와 별 모양의 형태를 보여 주 
그림 2. 세포주 실험 결과는 인간의 기본 근섬유 세포 7을 사용하여 입증된다. 18Co 해당 TNF-α를 보여주기 위해 사용 된 인간 결장 근섬유 세포주는 이들 세포에서 EGF 수용체 발현 및 신호의 상향 조절 (도 2A)를 유도한다. EGF 수용체의 발현이 상향 조절은 EGF 이후 노출이 강화 p42/44의 MAPK의 인산화 및 COX-2의 발현을 주도도 2b에 도시, 강화 된 EGF 수용체 신호 전달과 관련되었다. 이러한 효과는 완전 EGF 수용체 억제제 AG1478로 억제 하였다. 대장 암 환자의 수술 적 절제 대장에서 고립 된 인간의 기본 근육 섬유 모세포는이 실험 결과를 확인 (그림 2C및 2D). 종양 괴사 인자 - 알파 = TNF-α, EGFR = EGF 수용체, AG = AG1478, COX-2 = 시클로 시게나 제 -2. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오. 
그림 3. 주요 근육 섬유 모세포는 마우스 대장 조직에서 분리 할 수 있습니다. 기본 마우스 근섬유 세포의 10X보기. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
마우스 또는 인간의 콜론을 사용하면 일반적인 방법은 비슷합니다. 이 기술은 또한 소장에서 근육 섬유 모세포를 분리하는데 사용될 수있다. 1 근육 섬유 모세포의 분리에 대한 구체적인 내용은. 마우스와 2. 인간의 대장은 아래에 설명되어 있습니다.
1. 마우스 콜론
마우스 결장 관개는 결장의 일단에 16 G 포퍼 무딘 엔드 바늘에 4를 부착함으로써 촉진된다. 세로 결장 절단 경우에도 도움이됩니다. 당신은 바늘에 결장 조직을 아코디언 수있다, 그 후에 날카로운 끝을 위로 가위의 한 끝을 배치하고 세로 엽니자를 때 가위의 가장자리에 결장 조직을 밀어 넣습니다.
2.1 단계에서, 죽은 세포에서 핵 물질이 세포의 응집을 초래할 수 있다는 것을 이해하는 것이 중요합니다. DNA 분해 효소 (50 ㎎ / ㎖)의 추가는이 문제를 해결하기 위해 사용될 수있다.
가장 중요한 단계는 2.4 단계입니다. CA를 유지대장 조직의 reful 시계. 콜론 힘줄보고 시작하면, 효소에서 콜론을 제거합니다. 당신은 전체 60 분에 콜론을 배양 할 필요가 없습니다. 결장 조직이 너무 오래 디스 파제 및 콜라게나 D에 노출되는 경우, 세포는 죽을 것이다. 이것은 낮은 세포 수율 발생합니다 일반적인 실수이다.
세포의 오염은 다른 일반적인 문제입니다. 주의 깊은 기술, 적절한 세척 및 여과는 세포 배양 작업을 위해 사용되는 표준 무균 기법과 함께, 오염의 위험을 최소화 할 것이다.
2. 인간의 콜론
효소와 인큐베이션 시간의 길이는 소화되는 시편의 크기에 달려있다. 우리는 일반적으로 인간의 대장 벽의 ½ 인치 전체 두께의 스트립을받을 수 있습니다. 인간의 대장 조직에서 근육 섬유 모세포를 분리하는 경우 단계 2.3의 수정이 있습니다. 단계 2.3의 경우, 인간의 콜론는 디스 파제의 양 (20 U)와 공동으로 두 개를 사용해야합니다llagenase의 D (4000 U)를 사용. 결장의 더 큰 세그먼트는 더 이상 배양 시간이 필요합니다. 또한, 효소의 특정 활동이 많이 다를 수 있음을 유의하십시오, 그래서 당신은 그에 따라 배양 시간을 조정해야 할 수도 있습니다.
기본 마우스와 인간의 근육 섬유 모세포 모두 들어, 고립 된 세포는 세포의 순도 평가하고 세포가 근섬유 같은임을 확인 0nce 문화에서 자란 평가되어야한다. 이것은 면역 조직 화학 염색 (마커를 근섬유하는 항체 - 평활근 액틴과 멘틴을 포함 포함하여 기술의 다양한 수행 할 수 있으며, CD68에 대한 단일 클론 항체는 대 식세포에 특정, CD31는 내피 세포에 특정하고, CD45 면역 세포에 특정; E-cadherin의 다양한 cytokeratins에 대한 항체는 상피 세포에 특정합니다. mRNA 발현도 RT-PCR (12)에 의해 평가 될 수있다. 유동 세포 계측법 또한 세포 분석 13 사용할 수 있습니다.
생체 외 및 공동 문화 실험에 사용할 수 있습니다. 기본 세포는 세포 - 세포 상호 작용 (14)를 연구하는 마우스의 피하 조직에 이식 할 수 있습니다. 미래의 응용 프로그램은 유전자 조작 다음 마우스 대장 내시경을 이용하여 동계 마우스의 결장 벽에 차 근육 섬유 모세포를 재 주입을 포함 할 수있다.
인간 및 마우스의 결장에서 일차 근육 섬유 모세포를 분리하는 대안 방법의 개수는 설명되었다. 두 가지는 다음과 같습니다 :
- Mahida, 등. 암. J. Physiol. 273 G1341-1348, (1997).
- 드 Wever에게, 등. 이자. J. Oncol. 39, 393-400 (2011).
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Disclosures
저자가 공개하는 게 없다.
Acknowledgments
이 작품은 JY에 건강 그랜트 5KO8DK085136-02의 국립 연구소에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Dispase I | Invitrogen/GIBCO | #17105-041 | |
| Collagenase D | Roche | #1 088 858 | |
| 4 in, 16 G Popper blunt-end needle | Fisher | #14-825-16K |
References
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