Controle quantitativo e temporal de oxigênio Microenvironment no Ilhéu Individual

Resumo

O controle microfluídico de oxigênio confere mais do que apenas conveniência e velocidade em relação às câmaras hipóxicas para experimentos biológicos. Especialmente quando implementado por difusão através de uma membrana, o oxigênio microfluídico pode fornecer modulações simultâneas de fase líquida e gasosa no nível de microescala. Esta técnica permite experimentos multiparamétricos dinâmicos críticos para o estudo da fisiopatologia das ilhotas.

Resumo

Oxigenação simultânea e monitoramento de fatores de glicose no acoplamento estímulo-secreção em uma única técnica é fundamental para a modelagem de estados fisiopatológicos da ilhota hipóxia, especialmente em ambientes de transplantes. Técnicas de câmara de hipóxia padrão não pode modular os estímulos, ao mesmo tempo, nem fornecer monitoramento em tempo real dos fatores de glicose no acoplamento estímulo-secreção. Para superar estas dificuldades, aplicamos uma técnica de micro várias camadas de integrar tanto aquosa e modulações de fase gasosa através de uma membrana de difusão. Isto cria uma sanduíche estimulação em torno das ilhotas microscaled dentro do polidimetilsiloxano transparente dispositivo (PDMS), que permita o controlo dos factores de acoplamento acima mencionadas, através de microscopia de fluorescência. Além disso, a entrada de gás é controlado por um par de microdispensers, proporcionando, modulações quantitativos sub-hora de oxigénio entre 0-21%. Esta hipóxia intermitente é aplicada para investigar um novo fenômeno da ilhat pré-condicionamento. Além disso, armado com microscopia multimodal, fomos capazes de olhar para o cálcio detalhada e dinâmica do canal K _ATP durante esses eventos hipóxicos. Nós encaramos hipóxia microfluídica, especialmente a técnica de dupla fase simultânea, como uma valiosa ferramenta no estudo de ilhotas, assim como muitos ex vivo tecidos.

Introdução

A hipóxia dinâmica é importante em biologia, especificamente para transplantes de ilhotas

A hipóxia dinâmica é um importante parâmetro fisiológico e fisiopatológico em muitos tecidos biológicos. A mudança no oxigênio, por exemplo, é um potente sinal de desenvolvimento na angiogênese. Além disso, os padrões espaciais e temporais na hipóxia modulam o HIF1-alfa e desempenham papéis em doenças como o câncer de pâncreas. A hipóxia também é um fator de confusão que afeta os resultados do transplante de ilhotas. Recentemente, oscilações temporais de hipóxia, ou hipóxia intermitente (HI) demonstraram benefícios no "pré-condicionamento" das ilhotas

Protocolo

1. Preparando as ilhotas do rato

1. Dissecar camundongos C57BL / 6 e isolar ilhotas por digestão de colagenase e separação de gradiente de densidade de Ficoll. (Consulte os artigos JOVE referenciados em^2,3).
2. Incubar ilhotas em meio RPMI-1640 contendo 10% de FBS, 1% de penicilina/estreptomicina e 20 mM de HEPES em placas de Petri (37 °C, 5% de CO₂). Pós-isolamento, ilhotas de cultura por 24 horas antes do uso em experimentos. Use as ilhotas dentro de 1-2 dias para garantir resultados consistentes.

2. Fazendo a plataforma microfluídica

1. Gere as geometrias da microestrutura em fotomásc....

Resultados

Central para esta técnica de hipóxia de ilhotas é a capacidade de modular estímulos nas fases aquosa e gasosa na mesma câmara microfluídica com transientes em escala de minutos. Figura 1 mostra um resultado representativo das a) duplas estimulações e b) modulações rápidas medidas dentro da câmara de ilhotas. A modulação aquosa, demonstrada pela introdução de fluoresceína na câmara, atinge o equilíbrio em três a quatro minutos de mistura. Além disso, o oxigênio pode ser ajustado de 5 a 21% com transientes.......

Discussão

As múltiplas modalidades integradas nesta técnica de hipóxia de ilhotas apresentam vários pontos observados aqui para solução de problemas. Primeiro, as ilhotas isoladas continuam a se degradar e se desintegrar em cultura devido às enzimas digestivas das células acinares. Padronizar experimentos para 1-2 dias após o isolamento das ilhotas é, portanto, fundamental para obter resultados consistentes. Em segundo lugar, o fluxo aquoso foi interrompido durante a hipóxia e a hipóxia intermitente para evitar a depuração convect.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
< forte > reagente / material< / forte >
Spinner	Laurell	WS-400
SU8	MicroChem	SU8-2150 / SU8-2100
Placa de aquecimento digital	PMC Dataplate	722A
Lâmpada de cura UV	OmniCure	S1000
PMDS	Dow Chemical	Sylgard 184
Câmara	Corona Wand ETP	BD-20AC
	Bel-Art	420220000
Microdispensadores	The Lee Company	IKTX0322000A
Energia 5 V e 20 V DC	Shack
NI USB	National Instrument	NI USB-6501
Termômetro	Omega Engineering, Inc.
Bomba Peristáltica	Gilson	Minipulse 2
Sensor de Oxigênio	Ocean Optics	NeoFox
Fraction Collector	Gilson	203
Pippette	Fisher Scientific	Finnpipette II 100μ l
Microscópio de Epifluorescência Invertida	Leica	DMI 4000B
Tubos Cônicos de 50 ml	da Fisher Scientific
Sondas Moleculares	Corante de Fluorescência Rodamina 123
HEPES	Sigma-Aldrich Glucose Sigma-Aldrich
Soro Bovino Albumina	Sigma-Aldrich
30 in Tubos de Silicone	Cole-Parmer		1/16 in x 1/8 in 1.5 ml
Eppendorf Tubes	Fisher Scientific
Y-connectors	Cole-Parmer		Conectores de Seringa de 1/16 in e 4 mm
	Cole-Parmer		1/16 in
de	cotovelo Cole-Parmer
			1/16 in

de Vácuo Rádio de Sondas Moleculares de Corante de Fluorescência Fura-2 , de da Life Technologies, Meios de Cultura de Tecnologias de Vida Sigma-Aldrich RPMI-1640 Plugue Luer fêmea Conectores retos de Conector