Модели и методы для оценки Перевозка системам по наркотикам Доставка по клеточные барьеры

Summary

Многие терапевтические приложения требуют безопасной и эффективной транспортировки носителей лекарственных средств и их грузов по клеточные барьеры в организме. В этой статье описывается адаптацию установленных методов оценить скорость и механизм транспортировки наноносителей наркотиков (NCS) через клеточные барьеры, такие как желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) эпителия.

Abstract

Суб-микрометр носители (наноносителей; НК) повышения эффективности лекарств путем улучшения растворимости, стабильности, время циркуляции, адресности, и отпустите. Кроме того, пересекая клеточные барьеры в организме имеет решающее значение как для перорального применения терапевтических НК в обращении и транспорта из крови в ткани, где вмешательство не требуется. NC транспорт через клеточные барьеры достигается: (I) парацеллюлярная маршруту, через переходного нарушения стыках, которые сцепляются соседние ячейки, или (II) трансцеллюлярного маршрут, где материалы усвоены эндоцитоза, перемещаемых через тела клетки и секретируется на противоположной поверхности клеток (transyctosis). Доставка по клеточные барьеры можно облегчить путем сочетания терапии или их носителей с таргетинга агентов, которые специфически связываются с клеточной поверхности маркеров, участвующих в транспорте. Здесь мы предоставляем методы для определения степени и механизм НК транспорта через модель клеточный барьер, бееCH состоит из монослоя желудочно-кишечного тракта (GI) эпителиальные клетки, выращенные на пористой мембраной, расположенной в Transwell вставки. Формирование барьера проницаемости подтверждается измерения трансэпителиальный электрическое сопротивление (Тир), трансэпителиальный транспорт контрольного вещества и Иммуноокрашивание плотных контактов. Например, ~ 200 нм полимерные НК используются, которые несут терапевтический груз и покрыты антителом, предназначенного для элемента клеточной поверхности определитель. Антитела или терапевтического грузов помечен ¹²⁵ I для радиоизотопной трассировки и меченые НК добавляются в верхнюю палату по клеточный монослой в течение различных периодов времени. НК, связанные с клетками и / или транспортируемых к основной камере может быть обнаружена. Измерение свободного ¹²⁵ I позволяет вычитание деградированных фракции. Маршрут парацеллюлярная оценивается путем определения потенциальных изменений, вызванных НК транспорта барьерных параметров, описанных выше. Трансцеллюлярного транспорта яы определяется решении эффект модуляции эндоцитоза и трансцитоз пути.

Introduction

Сотовые барьеры в акте тела в качестве шлюза между внешней средой и внутренними отсеками. Это тот случай, для эпителиальной выстилки, отделяющей извне открытую поверхность желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) и кровоток ^1-3. Сотовые барьеры также представляет собой интерфейс между кровоток и паренхимы и клеточных компонентов тканей и органов. Это тот случай, для внутренней эндотелиальной выстилки кровеносных сосудов, такие как гематоэнцефалический барьер легких, в гематоэнцефалический барьер и т.д. ¹ способность пересекать эти клеточные барьеры в организме имеет решающее значение для эффективной доставки терапевтических и диагностических ср....

Protocol

1. Культивирование монослой клеток в Transwell вставками

1. В стерильной, уровень биологической безопасности 2 клеток капотом культуры, поместите 0,8 мм пор ПЭТ Transwell вставки в 24-луночный планшет (4 скважин в состоянии, на статистическую значимость) щипцами. Все материалы, входящие в капот должны быть стерилизованы с этанолом.

Примечание: размер пор фильтра должен быть выбран в соответствии со средним размером ЧПУ, используемого, чтобы позволить транспортировку через мембрану. Кроме того, для статистически значимых результатов, каждый экспериментальная условие требует как минимум четырех повторов (скважины) в рамках....

Results

Как проверки нашей модели клеток для изучения трансэпителиальный транспорт целевых НК, Рисунок 2 показывает, что Сасо-2 монослои клеток высевали при плотности 1,5 × 10 ⁵ клеток / см ^2, достигнутой слияния ~ день 12 и поддерживается целостность монослоя до Дня 18, обозначается TEER (рис. 2А). Это было подтверждено наличием occludin-положительных плотных контактов (рис. 2В) в монослоев с высокой TEER (390 Ω × см ^2, 14-й день), по сравнению.......

Discussion

Используя методы, описанные выше, модель сотового для изучения транспорт целевых НК всей клеточные барьеры могут быть установлены, например, примера, приведенного в Caco-2 эпителиальных клеток, которая имеет отношение к оценке транспорт из GI просвета в кровь в случае оральных систем доставки лекарств. Культивирование Г.И. эпителиальных клеток монослоев в Transwell вставками включен измерение TEER и флуоресценции Иммуноокрашивание плотных контактов, чтобы подтвердить образование барьера клеточной проницаемости. Впоследс.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Вставки Transwell	BD Falcon	353095
Модифицированная среда Dulbecco's Eagle's Medium (DMEM), 1x	Cellgro	10-013-CM
Фетальная бычья сыворотка (FBS)	Cellgro	35-015-CV
Ручка стрептококковая	Gibco	15140
Клетки эпителиальной колоректальной аденокарциномы человека (Caco-2)	ATCC	HTB-37TM
125Йод	Perkin Elmer	NEZ033H002MC	Радиоактивная опасность
Фосфатный буферный раствор (PBS)	Gibco	14190-235
Бычья сыворотка альбумин (BSA)	Equitech Bio	BAH-66
Параформальдегид (16%)	Fisher Scientific	15710
Мышиный иммуноглобулин G (IgG)	Jackson ImmunoResearch	015-000-003
Мышиные моноклональные антитела к человеческому ICAM-1 (анти-ICAM)	Marlin 1987
α-Галактозидаза, из зеленых кофейных зерен	Sigma	G8507-25UN&	nbsp;
Латексные бусины FITC, 100 нм	Polysciences, Inc.	17150
Тритон Х-100	Сигма	234729-500МЛ
Трихлоруксусная кислота (ТСА)	Fisher Scientific	SA433-500
Антитело к окклюдину (Y-12), поликлональное антитело козы	Santa Cruz Biotechnology	Sc-27151
Монодансилкадаверин (MDC)	Sigma	D4008
Филиппинская	сигма	F9765
5-(N-этил-N-изопропил)амилорид (EIPA)	Sigma	A3085
Вортманнин	Сигма	W1628
Гамма-счетчик	Perkin Elmer	Wizard2
Вольт-омметр	World Precision Instruments	EVOM2
Электроды TEER	World Precision Instruments	STX100	Электроды доступны для различных луночных пластин
Динамическое рассеяние света (DLS)	Malvern	Nano-ZS90