Summary
Een protocol voor de niet-invasieve intraductale afgifte van waterige reagentia voor de muis borstklier wordt beschreven. De methode maakt gebruik van gelokaliseerde injectie in de tepels van melkklieren targeting mamma-kanalen specifiek. Deze techniek kan worden aangepast voor verschillende verbindingen waaronder siRNA, chemotherapeutische middelen en kleine moleculen.
Abstract
Hierin beschrijven we een protocol om verschillende reagentia leveren aan de muis borstklier via intraductale injecties. Gelokaliseerde drug delivery en knock-down van genen binnen de borstklier epitheel is moeilijk te realiseren vanwege het ontbreken van adequate targeting moleculen die onafhankelijk van ontwikkelingsstadia, zoals zwangerschap en lactatie zijn. Hierin beschrijven we een techniek voor gelokaliseerde afgifte van reagens aan de borstklier in elke fase van volwassenheid via intraductal injectie in de tepels van muizen. De injecties kunnen worden uitgevoerd op levende muizen, onder verdoving, en zorgen voor een niet-invasieve en gelokaliseerde geneesmiddelafgifte de borstklier. Bovendien kan de injecties herhaald over meerdere maanden zonder de tepel. Vital kleurstoffen zoals Evans Blue zijn zeer nuttig om de techniek te leren. Bij intraductal injectie van de blauwe kleurstof het gehele ductale boom zichtbaar voor het oog. Bovendien fluorescent gelabelde reagentia mogelijk ookvisualisatie en distributie in de borstklier. Deze techniek kan worden aangepast voor verschillende verbindingen waaronder siRNA, chemotherapeutische middelen, en kleine moleculen.
Introduction
De muis borstklier bestaat uit een complex ductaal-alveolaire boom die convergeert in een centraal kanaal in de tepel. In muizen en mensen, de meerderheid van borsttumoren oorsprong in de epitheelcellen van de melkkanalen. Huidige beschikbare behandelingen omvatten intraveneuze chemotherapie, bestraling en chirurgie. Gelokaliseerde intraductal behandelingen zijn onderzocht 1-3 en bieden aanzienlijke voordelen in termen van verminderde toxiciteit en de bijwerkingen. Echter, een aantal uitdagingen blijven voordat deze op grotere schaal kan worden toegepast. Het vermogen om vergelijkbare procedures in de muis borstklier vergemakkelijkt de karakterisering van intraductal interventies. Hier presenteren we een niet-invasieve werkwijze voor de levering van reagentia direct in de muizen mammaire kanaal.
Intraductale levering van chemotherapeutische agenten in beide borstkankerpatiënten en muismodellen al eerder is aangetoond dat het zeer effectief met geen bewijs van te zijnsystemische toxiciteit of langdurige histopathologische veranderingen 3-6. Bovendien hebben tumorcel injectie en lentivirale vector levering van oncogenen aangetoond eerder haalbaar zijn via intraductale injectie 7-10.
Naast drug delivery, deze procedure is bruikbaar voor plaatselijke uitschakeling van borstklier genen door intraductal injectie van siRNA. Injectie van kleine hoeveelheden siRNA oplossing is effectief zonder de anatomie en fysiologie van de borstklier. In ons laboratorium hebben we onlangs succesvol gebleken tot zwijgen brengen van de belangrijkste bemiddelaar genen in transgene muizen die spontaan ontwikkelen borsttumoren resulteert in preventie van progressie van de tumor (Brock et al.., Ongepubliceerd). We hebben kunnen tweewekelijkse injecties in dezelfde nippels in 2 weken te herhalen tot 7 keer zonder zichtbare weefselschade of toxiciteit geweest.
Intraductale injecties kunnen worden getimed in een volwassen muis om te ont pakkenopmentally-specifieke gebeurtenissen om ontwikkeling van de borstklier relevant tijdens de zwangerschap, borstvoeding, en involutie of latere stadia van de tumor ontwikkeling en progressie richten. Maagdelijke vrouwtjes zo jong als 8 weken oud zijn niet-invasief geïnjecteerd in ons laboratorium.
Protocol
1. Bereiding van injectieoplossing
- Bereid 0,2% Evans blauwe kleurstof in met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) of andere waterige oplossing plaats. Deze vitale kleurstof is nuttig voor de beoordeling van het succes van intraductal injecties en wordt aanbevolen als een visualisatie hulpmiddel bij de ontwikkeling deskundigheid van de techniek.
Het gebruikte volume hangt af van het aantal en de plaats van de klieren te injecteren. Alle 10 borstklieren van vrouwelijke muizen worden geïnjecteerd maar door de kleinere klier formaat worden klier paren 1 en 5 typisch geïnjecteerd met 10 ul oplossing. Alle andere mamma paren geïnjecteerd met 20 ul. Deze hoeveelheden zijn voldoende om de gehele structuur ductale vullen.
2. Preoperatieve voorbereiding
- Noteer het lichaamsgewicht van elke muis. Zoals met alle preklinische studies, moet diergewichten regelmatig worden gecontroleerd (twee keer per week of meer) om mogelijke toxiciteit te beoordelen.
- Verdoven van de mouse behulp van een isofluraan kamer en oog smeermiddel. Tijdens de procedure zal muizen blijven worden verdoofd met behulp van geïnhaleerde 2-4% concentratie van isofluraan in zuurstof via een neuskegel. Nauwlettend de muis voor de veranderingen in de ademhalingsfrequentie, dienovereenkomstig aanpassen van het niveau van isofluraan.
- Injecteer meloxicam (5-10 mg / kg) subcutaan vóór de procedure analgesie.
- Breng een over-the-counter ontharingscrème aan de tepel. Wacht 5 minuten en verwijder voorzichtig los haar met een katoenen-tip applicator met een draaiende beweging. Verwijder de crème met behulp vochtig keukenpapier bevochtigd met warm water. Scheren wordt afgeraden vanwege het risico op beschadiging van de tepels.
- Zet de muis onder de stereoscoop door voorzichtig taping beneden de extremiteiten.
- Schoon injectieplaatsen met alcoholdoekjes.
3. Intraductale injectie
- Toon passende nippels onder de stereoscoop te injecteren. Gebruik fijne micro-ontleden twodiepvriezers geen dode huid die de tepel opening dekt verwijderen.
- Belasting 10-20 ul van injectie oplossing in een 50 ul spuit met een 33 G metalen hub naald aangebracht. Soms, na injectie, kleine hoeveelheden (1 ui of minder) kan lekken van de tepel bij het uittrekken van de naald. Daarom wordt aanbevolen 11 of 21 ul respectievelijk injecteren moet de potentiële schade.
- Houd de tepel zachtjes met de fijne pincet en til het iets naar het positioneren voor injectie. Het is niet nodig de tepel snijden.
- Spuit de oplossing langzaam om mogelijke schade als gevolg van snel bewegende vloeistof in de ductale lumen minimaliseren. De injectiesnelheid moet worden gehandhaafd op ongeveer 40 ul / min.
4. Postoperatieve Care
- Let op de plaats van injectie. Er mogen geen tekenen van trauma aan de tepel regio of omringend weefsel. Zwelling in het gebied rond de tepel waarschijnlijk wijst op een uiervet pad injectie rather dan succesvol intraductale injectie.
- Verwijder het dier uit de neuskegel en te verplaatsen naar een aparte kooi voor herstel. Plaats de kooi onder een warmtelamp om onderkoeling te voorkomen en te helpen bij het herstel. Muizen worden afzonderlijk gehuisvest en zal nauwlettend worden gevolgd totdat zij weer bij bewustzijn en mobiliteit.
5. Analyse van borstklierweefsel
- Na voltooiing van de studie worden muizen gedood door cervicale dislocatie na CO 2 samengeperst gas in een isolatiekamer. Melkklieren worden uitgesneden en kan worden gebruikt voor de hele mount voorbereiding 11, histologie, of RNA en eiwitten isolement.
Representative Results
De tepels kunnen gemakkelijk worden gelokaliseerd met behulp van een stereomicroscoop eenmaal haar is in de omgeving (figuur 1A) verwijderd. Aan de injectie techniek onder de knie, is het raadzaam om Evans blauwe kleurstof te injecteren en het toezicht op de integriteit van de klier (figuren 1B en C). Deze aanpak maakt het ook voor de bepaling van geschikte hoeveelheden te injecteren in elk klier als een visueel kan beoordelen of de kleurstof het gehele ductale systeem (Figuren 1C en 2A) bereikt. Een beeld van de geïnjecteerde Evans blauwe kan dan worden vergeleken met de hele gemonteerde borstklier, waarbij de gehele ductaal boom wordt gekleurd met karmijn aluin kleurstof (Figuur 2B).
Let robuustheid van deze injectiemethode is sterk afhankelijk van de operator. Bijvoorbeeld, perforeren het kanaal resulteert in een uiervet pad en injecteren van de oplossing te snel kan de ductale epitheliale cel beschadigenls en veroorzaken een ontstekingsreactie. Succesvolle intraductal injectie kan de gelokaliseerde drug delivery aan de borstklier en vermindert niet-specifieke bijwerkingen vaak anders waargenomen.
Een voorbeeld afbeelding van een klier ingespoten met fluorescent gelabeld siRNA gericht cyclofiline (een niet-essentieel gen) wordt weergegeven in Figuur 3.
Figuur 1. Een lies borstklier geïnjecteerd door de tepel met Evans blauwe kleurstof. A) Voorkomen van de tepel vóór de injectie en B) na injectie met 20 ul Evans blauwe kleurstof. Geen zwelling of weefselschade wordt waargenomen. C) Bij het openen van de huid, de kleurstof maakt visualisatie van de hele borstklier ductaal boom.
Figuur 2. Whole-mount analyse van Evans blauw-ingeprojecteerde klier. A) representatief beeld van een ontleed klier uitgesneden uit het dier en verspreid op een glasplaatje onmiddellijk na de injectie. B) Hele mount kleuring van dezelfde klier met karmijnrode kleurstof na vet was vereffend. Vergelijking met A) bevestigt dat de geïnjecteerde oplossing vult de borstklier ductaal boom en de klier is anatomisch intact.
Figuur 3. Intraductale levering van fluorescerende siRNA. Representatief beeld van verse weefselmonster, weggesneden 48 uur na de injectie.
Discussion
Transgene en knockout muizen zijn waardevolle tools om de in vivo rol van individuele genen in borstkanker. Het is echter kostbaar en tijdrovend om deze dieren te genereren en het gen knockdown meestal alomtegenwoordig die soms uitsluit ons herkent de specifieke effecten van dat gen op de borstklier. Daarom zou een gerichte knockdown gevallen van niet-specifieke bijwerkingen en toxiciteit in andere organen verminderen.
De intraductal injectie van siRNA hier gepresenteerde maakt de gelokaliseerde gen knock-down in de muis borstklier. Het is een snelle werkwijze voor gerichte en gelokaliseerde geneesmiddelafgifte aan de borstklier niet beperkt tot siRNA levering. Een dergelijke borstklier-specifieke geneesmiddelafgifte vermijdt onspecifieke bijwerkingen en toxiciteit voor andere organen en maakt de studie van gen veranderingen op specifieke tijdstippen tijdens ontwikkeling van de borstklier en borstkanker tumorvorming. Er is geen bewijs van siRNA deeltjes in niet-geïnjecteerde klieren, de lever of andere organen leveren verder bewijs dat deze methode biedt een geprefereerde manier voor gelokaliseerde gen knock-down in de borstklier. Bovendien kan de intraductal injectie wekelijks of tweewekelijks worden herhaald gedurende enkele maanden om voor langdurige bewaking van therapeutische middelen.
Deze techniek opent de mogelijkheid voor het testen van de intraductal levering van verschillende reagentia om de muis borstklier kanalen. Vooruitgang in gelokaliseerde afgifte in goed gekarakteriseerde muismodellen dient de toepassing van niet-invasieve versnellen gerichte therapeutische strategieën bij mensen.
Disclosures
De auteurs hebben geen financiële onthullingen.
Acknowledgments
De auteurs willen graag Michael Goldberg bedanken voor het bereiden van gestabiliseerde siRNA-oplossing en Heather Tobin voor haar hulp bij de dieren. Deze studie werd gefinancierd door DOD Innovator Award W81XWH-08-1-0659 tot DEI. De postdoctorale opleiding van SK werd gesteund door de Susan G Komen Foundation (KG101329). De auteurs willen graag Kristin Johnson bedanken voor de voorbereiding van het schema.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| isoflurane | 2-4% | ||
| meloxicam | 5-10 mg/ml | ||
| Evans blue dye | Sigma-Aldrich | E2129-10G | 0.2% in PBS |
| hair removing cream | Veet | Choose sensitive option | |
| stereoscope | Zeiss | Stemi DV4 | |
| micro-dissecting tweezers | Roboz | rs-4976 | With a 0.10 x 0.06 mm tip made of dumostar |
| Hamilton syringe | Hamilton | 7637-01 | |
| 33-gauge needle | Hamilton | 7803-05 | point style 4, 12 degree bevel (standard) |
| siGLO cyclophilin B control siRNA | Dharmacon | D-001610-01-05 |
References
- Dooley, W. C., et al. Ductal lavage for detection of cellular atypia in women at high risk for breast cancer. J Natl Cancer Inst. 93, 1624-1632 (2001).
- Jacobs, L., Sukumar, S., Stearns, V. Intraductal therapy for the prevention of breast cancer. Curr Opin Investig Drugs. 11, 646-652 (2011).
- King, B. L., Love, S. M. The intraductal approach to the breast: raison d'etre. Breast Cancer Res. 8, 206 (2006).
- Murata, S., et al. Ductal access for prevention and therapy of mammary tumors. Cancer Res. 66, 638-645 (2006).
- Stearns, V., et al. Preclinical and clinical evaluation of intraductally administered agents in early breast cancer. Sci Transl Med. 3, 106ra108 (2011).
- Flanagan, M., Love, S., Hwang, E. S. Status of Intraductal Therapy for Ductal Carcinoma in Situ. Curr Breast Cancer Rep. 2, 75-82 (2010).
- Nguyen, D. -A., Beeman, N., Lewis, M., Schaack, J., Neville, M. C. Methods in mammary gland biology and breast cancer research. Ip, M. M., Asch, B. B. , Kluwer Academic/ Plenum Publishers. 259-270 (2000).
- Behbod, F., et al. An intraductal human-in-mouse transplantation model mimics the subtypes of ductal carcinoma in situ. Breast Cancer Res. 11, R66 (2009).
- Bu, W., Xin, L., Toneff, M., Li, L., Li, Y. Lentivirus vectors for stably introducing genes into mammary epithelial cells in vivo. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 14, 401-404 (2009).
- Reddy, J. P., Li, Y. The RCAS-TVA system for introduction of oncogenes into selected somatic mammary epithelial cells in vivo. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 14, 405-409 (2009).
- Plante, I., Stewart, M. K., Laird, D. W. Evaluation of mammary gland development and function in mouse models. J. Vis. Exp. , e2828 (2011).
